단백질 분리 및 특성에 대 한 다 각 산란 (MALS)를 결합 하는 이온 교환 크로마토그래피 (전류 구동)

요약

이 프로토콜에는 단백질, 단백질 복합물, 및 다른 유형의 샘플에 펩 티 드의 정확한 어 금 니 질량 결정에 대 한 다 각 산란과 높은 특이성 이온-교환 크로마토그래피를 사용 하 여를 설명합니다. 이 메서드는 네이티브 올리고, 충전 변종 및 혼합 단백질 견본 특성에 관해서는 품질 평가 대 한 귀중 한.

초록

다 각 산란 (전류 구동-MALS)와 이온-교환 크로마토그래피는 단백질 분리 및 특성에 대 한 강력한 방법입니다. 전류 구동 MALS 함으로써 정확한 어 금 니 질량 분석 수 매우도 oligomeric 형태 또는 단백질 인구의 혼합물을 포함 한 다른 유형의 단백질 견본의 특성 높은 특이성 분리 기술의 조합 비슷한 어 금 니 대 중입니다. 따라서, 전류 구동 MALS 단백질 특성의 추가 수준을 제공 하 고 다 각 산란 (초-MALS) 기술 표준 크기 배제 크로마토그래피에 무료입니다.

여기 기본 전류 구동 MALS 실험 하 고 소 혈 청 알 부 민 (BSA)에 대해이 메서드를 설명 하는 프로토콜을 설명 합니다. 전류 구동 oligomeric 형태의 MALS 각 개별 양식으로 어 금 니 질량 분석 허용에 BSA를 구분 합니다. 전류 구동 MALS 실험의 최적화 또한 제시 하 고 BSA 단위체와 더 큰 올리고 우수한 구분을 달성 하는 BSA에 설명. 전류 구동 MALS 제공 합니다 잘 분리 샘플에 존재 하는 여러 단백질 종의 어 금 니 질량 결정 이후 단백질 품질 평가 위한 귀중 한 기술 이다.

서문

규제 목적 의약품 산업에서 고 신뢰성 및 생명 과학의 무결성을 보장 하기 위해¹ 연구 양적 특성 단백질 제품의 품질 관리 (QC)의 수단으로 점점 더 필수적 이다 ^{, 2}. 단백질의 웹사이트에 설명 된 대로 네트워크 단백질 생산 및 유럽 (P4EU) 및 협회의 자원 정화 파트너십 유럽에서 생물 연구 및 유럽 (아 흐 브 흐-MOBIEU)에서 분자 생물 물리학 (https://p4eu.org/protein-quality-standard-pqs와 https://arbre-mobieu.eu/guidelines-on-protein-quality-control, 각각), 단백질 품질 관리 뿐만 아니라 최종 제품, 하지만 또한 oligomeric 상태로, 동질성, 정체성, 순도 특성화 해야 합니다 형태, 구조, posttranslational 수정와 다른 속성^3,4.

하나는 가장 일반적인 QC 특성화 방법의 초 MALS입니다. 이 방법에서는, 분석 SEC 열 MALS 및 spectrophotometric 및 refractometric 감지기, 각 피크⁵의 단백질 분자량의 정확한 측정을 사용 결합 이다. 초 MALS 차입 볼륨 별도로 eluted 봉우리의 어 금 니 질량을 결정 하 고 열 보정을 사용 하 여 분석 SEC의 부정확성을 극복. 동적 빛 분산 (DLS) 모듈의 추가 허용 유체역학 반경 결정 크기 측정 기능을 추가 합니다. 학술 연구, 초 MALS 일반적으로를 사용 하는 단백질, 그것의 구조, 순도, 집계, 그리고 수정 된 단백질, glycoproteins 등 지질 solubilized 막 단백질의 레벨의 레벨의 oligomeric 상태를 확인 (확인은 단백질의 분자량 및 구성 요소를 개별적으로 켤레)^6,,78.

많은 경우에, 정화 과정의 최종 단백질은 잘 defined 분자 종 하지만 오히려 구성 하는 일부이 성분. 이러한 혼합물에 있는 단백질 구조 (예를 들어 다른 oligomeric 형태), conformations, 또는 단백질 isoforms는 다양 한 될 수 있습니다. 단백질이 C 터미널 lysine 처리 또는 변형^9,10충전 선도 아스파라긴/글루타민 탈으로 인 한 사소한 화학 차이의 결과 영향을 수도 있습니다. Glycosylation 같은 posttranslational 수정 차이 또한 충전 유사⁹이기종 샘플 발생할 수 있습니다. 이러한 서로 다른 유형의 단백질의 생물 특성에 반영 하 고 안정성과¹¹대상 단백질 생물 학적 활동에 영향을 줄 수 있습니다.

같은 다른 유형의 샘플의 신뢰할 수 있는 품질 관리 분석 매우 resolutive 분석 분리 기술이 필요로합니다. 좋은 분리 분석 초 열, 그들의 제한 된 해상도 분리 능력¹², 결함이 초 MALS 분석 결과로 인해 달성 하기 위해 도전 하는 수 있는 경우가 있습니다. 전류 구동 MALS와 같은 높은 특이성 분리 기술을 결합 하 여 다른 유형의 샘플에 초 MALS의 한계를 극복 하 고 단백질 특성 (Amartely 외.¹²표 1)에 대 한 보완 방법을 제공 수 있습니다. 그들의 유체역학 크기¹³에 의해 고분자를 분리, 초 달리 전류 구동 그들의 표면 충전¹⁴에 의해 고분자를 분리 합니다. 음이온 교환 (AIEX) 및 양이온 교환 (CIEX) 행렬 bind 부정적인 긍정적으로 청구 변종, 각각. 상대적으로 가까운 질량 또는 모양 공유 하는 단백질 인구 사이 좋은 별거, 전류 구동 MALS 성공적으로 혼합 샘플¹²에서 각 개별 단백질의 분자량을 결정 합니다.

여기 선물이 같은 샘플에는 분리와 존재 BSA oligomeric 형태의 분석에 대 한 전류 구동 MALS 실험을 실행 하기 위한 표준 프로토콜. 특정 단백질에 대 한 전류 구동 열의 선택은 중요 하 고 논의 하 고, 버퍼의 pH 및 전도도 조건 뿐만 아니라. 전류 구동 MALS 실험 데이터의 분석 또한 단계적으로 설명 되어 있습니다. BSA 올리고의 분리는 좋은 초 MALS에서 충분 한, BSA 전류 구동 MALS 기능을 게재 하 고 실험의 최적화를 보여주는 좋은 예입니다. 초 MALS 및 적절 한 분리 및 분석 전류 구동 MALS로 활성화 함으로써 가난한 분리의 예는 이전 연구¹²에서 설명 합니다.

프로토콜

1입니다. 시스템의 준비

1. 고속 단백질 액체 착 색 인쇄기 (FPLC) 시스템 및 MALS/굴절 인덱스 (RI) 검출기 ( 재료의 표참조) 컨트롤, 데이터 수집, 및 제조 업체는 당 분석에 대 한 그들의 각각 소프트웨어 패키지와 함께 설치 지침입니다.
2. FPLC의 UV와 전도도 검출기의 하류 아니라 MALS 및 RI 검출기를 연결 합니다. UV와 MALS 감지기 사이 interdetector 볼륨을 최소화 하기 위해 pH 기울기에 대 한 절대적으로 필요한 경우가 아니면 전화 탐지기를 우회. 0.25-0.5의 모 세관 튜브를 사용 하 여 m m 내경 (아이디) 열 탐지기와 폐기물 또는 수집기에 RI 검출기의 출력 0.75 m m i.d. 모 세관 배관 사이.
3. 그 FPLC과 감지기 사이 필요한 신호 연결 설립 되었습니다, MALS Aux 입력에 FPLC 검출기에서 UV 아날로그 출력 및에 MALS Autoinject, I/O 상자 통해는 FPLC에서 디지털 출력을 포함 하 여 확인 합니다.

2입니다. 샘플 및 버퍼의 준비

1. 0.1 µ m 필터 세척 및 차입 버퍼를 포함 하 여 모든 시 약을 필터링 합니다. 건조 필터에서 입자를 제거 하기 위해 폐 병으로 버퍼의 첫 번째 50-100 mL를 필터링 하 고 필터링 된 물으로 철저 하 게 세척 되 고 입력에서 먼지를 방지 하기 위해 출장 청소, 살 균 병에 버퍼의 나머지를 유지.
2. PH, 이온 강도에 BSA 샘플 조정 (예를들면, pH = 8, 50 mM NaCl) 희석, 한, 또는 버퍼 교환 절차 동안 전류 구동 열 바인딩 수 있도록.
   참고: 것이 좋습니다 관심의 자료를 제거 하지 않는 작은 기 공 크기로 단백질 샘플 prefilter (0.02-0.1 µ m). 또는, 큰 입자의 강 수 있도록 10 분 샘플 고속 (13000-16000 x g) centrifuged 될 수 있습니다.
3. 적어도 0.3-0.5 준비 BSA의 mg ( 재료의 표참조) 좋은-품질 MALS 분석을 달성 하기 위한 1 mL 열 (5/50 m m)에 삽입. 참고 주입의 볼륨 제한 되지 않습니다.

3. 선택과 단백질에 대 한 전류 구동 방법의 개발

1. Protparam 도구 는 ExPASy에 있는 서버에 대 한 웹사이트 사용된¹⁵수 기본 시퀀스에 따라 단백질의 전자 점 (pI)을 계산 합니다. 참고 BSA의 pI 5.8입니다.
2. 열 유형 및 버퍼 매개 변수를 선택 합니다.
   1. pK는_는 버퍼와 버퍼의 이온 특성에 따라 AIEX와 CIEX, 다른 버퍼를 사용 합니다. AIEX 열과 음이온 버퍼 작은 counterions CIEX 열에서 실행할 때 실행할 때 양이온 버퍼를 사용 합니다. 이 예제에서 20 mM Tris HCl 버퍼, pH 8, AIEX 열에 BSA의 분석을 사용 합니다.
   2. BSA, 등 7 보다 낮은 pI와 단백질에 대 한 두 개 이상 단위에 의해 파이 보다 더 높은 ph는 AIEX 열 및 버퍼를 사용 합니다. 7 보다 높은 pI와 단백질에 대 한 두 개 이상 단위에 의해 단백질 pI 보다 낮은 ph CIEX 열 및 버퍼를 사용 합니다.
   3. 바인딩 단백질 사이의 열 매트릭스의 강도 따라 버퍼 pH 최적화. 단백질 잘 열에 바인딩되지 않습니다, pI에서 pH를 사용 합니다. 단백질 사용된 pH에 안정 되어 있는지 확인 합니다.
   4. 낮은 염 농도 사용 하 여 바인딩에 고 단백질 바인딩 로드 샘플의 이온 강도에 따라 달라 집니다 이후 행렬에 단백질의 바인딩을 허용 하는 버퍼를 씻어. 단백질의 안정성에 대 한 몇 가지 소금 필요 따라서, 단백질 로드 및 열 세척 단계 동안 50 m m NaCl (또는 대체 소금)을 사용 합니다.
   5. 차입 버퍼에 대 한 최대 0.5 M NaCl 사용 하 여 열에서 단백질을 분리.
      참고: 높은 소금 농도 표준 모델 RI 굴절 계 악기의 범위 제한 때문에 작업할 때 권장 하지 않습니다. 그러나, 고 농도 모델 사용 될 수 있다 그리고 2 M NaCl을 수용할 것입니다.
3. 초기 메서드를 다음과 같이 수행 합니다.
   1. BSA의 1 mg 로드 (6 mg/mL의 170 µ L) 20 mM Tris HCl 버퍼, pH 8의 로딩 버퍼의 ~0.5 mL에서 50 mM NaCl을 포함 하. 빛 산란 (LS), UV 때까지 바인딩되지 않은 분자 및 입자 시스템에서의 완전 한 차입을 허용 하는 10-15 열 (CV) 볼륨에 대 한 동일한 버퍼 열 세척 하 고 RI 신호는 완전히 안정.
   2. 20-30 이력서, 20 mM Tris HCl, pH 8의 차입 버퍼를 사용 하 여, 포함 하는 열에서 단백질을 분리 하 0.5 M NaCl의 짧은, 선형 솔트 그라디언트를 수행 합니다. 차입 버퍼의 0%-100% (또는 대체 광범위 한 그라데이션)의 그라디언트를 수행 하거나 두 그라디언트를 분할: 차입 버퍼의 0%-50%는 추가 그라데이션 차입 버퍼, 10-20 이력서에 대 한 각 그라디언트의 50%-100%의 뒤에. BSA, 30에 대 한 광범위 한 그라데이션 15%-70%의 사용 초기 방법에 대 한 이력서.
      참고: 어떤 경우에, 초기 방법을 제공할 수 있습니다 신뢰할 수 있는 MALS 분석에 대 한 분리 그리고 추가 실행이 필요 하지 않습니다. 대부분의 경우, 초기 메서드 추가 방법 최적화에 대 한 지침을 제공합니다.
4. 해상도 증가 하 고 다른 매개 변수를 변경 하 여 피크 분리를 개선 하는 전류 구동 메서드를 최적화 합니다.
   1. 그라데이션 경사와 길이 변경 합니다. 높은 슬로프와 짧은 그라디언트 가벼운 슬로프와 긴 그라디언트 제공 더 나은 분리 낮은 봉우리 적은 분리와 함께 강렬한 봉우리를 제공 합니다. 최적의 MALS 분석에 대 한 최대 해상도 및 신호 강도 사이의 균형을 찾아.
      참고: LS, UV, 증가할 수 있다 단백질의 높은 수량을 로드 하 고 RI 신호 하지만 해상도 비용 않습니다.
   2. 차입에 대 한 단계적 소금 농도 프로 파일을 사용 합니다. 단계 및 선형 그라데이션의 조합 일반적으로 사용 되는 기억 하십시오.
   3. 피크 분리 개선 흐름 속도 감소.
      참고: 아주 작은 입자와 함께 행렬에 대 한 이건 매우 중요 한입니다.
   4. 샘플에서 단백질 인구 사이 충전 편차를 증가 하 고 그 변종 사이의 분리를 향상을 버퍼 pH를 변경 합니다. 참고 한 pH에서 제대로 분리 되지 단백질 다른 pH에서 분리 될 수 있다.
   5. 그라데이션, 선형 또는 stepwise, pH를 사용 하 여 전류 구동 열 로부터 단백질을 분리. PH 및 소금 농도 변화가 필요한 경우 결합 하는 차입 그라디언트를 사용 합니다.
   6. 강한 염, MgCl₂또는 약한 소금 나트륨 아세테이트, 등 등을 사용 하 여 감도 및 해상도¹⁶증가.
   7. 분리 능력을 향상 시키는 작은 입자와 더 이상 전류 구동 열 또는 다른 열 매트릭스를 사용 합니다.
   8. 열 (AIEX/CIEX) 분리의 다른 패턴을 제공 하기의 형식을 변경 합니다. 참고는 강한, 약한, 또는 결합 된 (혼합 모드) ligands와 행렬도 사용할 수 있으며 일부 샘플의 해상도 향상 시킬 수 있습니다.
   9. 다른 매트릭스 수 지에 연결 된 동일한 ligand와 다른 공급 업체에서 열을 사용 합니다. Ligand, 별도로 수 지 자체, 단백질와 다르게 상호 작용 하 고 분리 프로필에 영향을 미칠 수 있습니다.
   10. 단백질 안정성 향상 및 전류 구동 실험을 개선 하기 위해 단백질 집계를 피하기 위해 버퍼에 첨가제 (안정화 솔루션에서 단백질 분자)를 포함 합니다.
       참고: 이러한 첨가제는 설탕, 알콜, 우 레 아, 비 또는 zwitterionic 세제, 그리고 chaotropic 및 kosmotropic 소금^17,18.

4. 전류 구동 MALS 실험

1. New\Experiment 메서드에서 MALS 소프트웨어에서 열고 빛 산란 시스템 방법 폴더에서 온라인 메서드를 선택 합니다. DLS 모듈 사용할 수 있는 DL 데이터 취득 하는 경우에, 빛 Scattering\With QELS 하위 폴더에서 온라인 메서드를 선택 합니다.
2. 구성 섹션에서 실행의 매개 변수를 설정 합니다.
   1. FPLC (1.5 mL/min)에서 사용 하는 유량에 일반적인 펌프 섹션에서 실행의 흐름 속도 설정 하 고 입력 하거나 용 매 섹션에서 버퍼 매개 변수를 확인 합니다.
   2. 단백질 이름 (BSA), 굴절률 증가 입력 (dn/dc; 표준 단백질에 대 한 값은 0.185 mL/g), 280의 파장에 UV 소멸 계수 (0.66 g/L^-1·cm^-1), 및에서 단백질 견본 (6 mg/mL)의 농도 인젝터 섹션 아래 샘플 탭. 같은 섹션에서 또한 주입 (170 µ L)에 대 한 샘플 볼륨을 삽입 합니다.
   3. 프로시저 섹션에서 기본 컬렉션 탭에서 Autoinject에 트리거 확인란을 선택 하 고 그라디언트에 도달 하면 적어도 5 분 동안 데이터 수집을 계속 것 이다 있도록는 실행 기간을 설정의 최종 값입니다.
3. FPLC 소프트웨어에서 실험 매개 변수를 설정 합니다.
   1. 메서드 편집기 탭에서 새 실험을 만듭니다. 초기 실험 소금 또는 산도의 선형 그라데이션 됩니다 (단계 3.3 참조). 최적화 방법에 대 한 좀 더 구체적인 그라데이션 또는 차입 결과 단계적 프로그램 동안 만드는 초기 메서드 (3.4 단계 및 그림 1참조). MALS 소프트웨어에서 데이터 수집을 트리거하는 방법에는 펄스 신호를 포함 합니다.
   2. 열과 관련 된 버퍼와 밸브 세척: 세척 버퍼 (밸브)와 500 m m NaCl 차입 버퍼 (B 밸브)에 대 한 동일한 버퍼에 대 한 50 m m NaCl 20 mM Tris HCl, pH 8. 마지막 열 세척이 낮은 소금 농도 포함 하는 바인딩 버퍼를 사용 하 여 열 매트릭스에 단백질의 바인딩을 활성화는 다는 것을 확인 하십시오. 강력 하 게 바인딩된 불순물의 대규모 세척, 중화 버퍼 세척 뒤 관련 버퍼와 세척 하기 전에 0.5 M NaOH를 사용 합니다.
   3. 주사기를 사용 하 여 루프에서 단백질 견본을 놓습니다. 샘플의 10 mL 이상의 로드 하는 경우 필터 펌프와 믹서는 FPLC의 무시 하면서는 superloop 또는 FPLC 악기의 펌프 밸브를 사용 합니다.
4. 실험 처음 시작 MALS 소프트웨어에서 그리고 FPLC 소프트웨어에서 실행 버튼을 클릭 하 여. MALS 검출기를 통해 FPLC 악기에서 펄스 신호를 받은 후 데이터를 수집 합니다.
5. 실행 및 독립 실행형 메서드 대신 연속 흐름 모드 전류 구동 MALS 수동으로 수행 하는 경우 단계 4.1-4.4에서에서 설명 하는 지침의 동일한 매개 변수를 적용 합니다.
6. 마지막 방법은 확인 되 고 실행 후 빈 주입 (샘플 대신 로딩 버퍼)를 사용 하 여 정확 하 게 같은 방법을 수행 합니다. Autoinject 펄스 사이의 빈 실행의 그라데이션 타이밍 실행 하는 샘플의 동일은 중요 하다.

5. 전류 구동 MALS 실험 데이터의 분석

1. MALS 소프트웨어에서 분석 절차 섹션 아래 단계를 수행 합니다. 기본 컬렉션 뷰 실험의 원시 데이터 컬렉션을 표시합니다.
   1. Despiking 탭을 사용 하 여 그들은 소음을 많이 전시 하는 경우는 chromatograms를 부드럽게. 일반적으로, 정상적인 수준을 사용 합니다.
   2. 모든 신호를 위한 기준 정의 (모든 LS, UV, 그리고 RI 검출기) 기본 보기에서.
   3. 분석에 대 한 봉우리 봉우리 보기 정의 합니다. 각 피크에서 단백질을 위한 UV 소멸 계수 및 dn/dc의 올바른 값을 확인 합니다.
      참고: 단백질, 그것은 0.185 mL/g 표준 RI 증분 값을 사용 하 여 일반적인 하지만 다른 고분자에 대 한 다른 dn/dc 값 사용 해야, 분자의 특성에 따라. Polynucleotides (DNA/RNA)의 평균 dn/dc는 0.17 mL/g¹⁹, saccharides, 자당, 같은 0.145 mL/g²⁰ 의 평균 dn/dc 값 있고 지질과 세제 범위 0.1-0.16의 dn/dc 값 mL/g²¹.
   4. 어 금 니 질량 및 반지름 피팅 매개 변수 그리고 분자량 및 LS에서 반경 및 QELS에서 R_h 보기 아래에서 상관 함수를 사용 하 여 분석 합니다.
2. 전류 구동 MALS 동안 크게 RI 신호 변경 소금 농도 증가로 인해 실행합니다. 따라서 RI 데이터를 필요로 하는 대량 계산에 대 한 빈 주입에서 기준 신호를 뺍니다.
   1. 단백질 및 빈 전류 구동 MALS 실험을 엽니다. 단백질 실험 이름을 마우스 오른쪽 단추로 누릅니다, 그리고 적용 방법, 고 기준 빼기 폴더 파일 대화 상자에서 선택 하십시오. 표준 어 금 니 질량 분석에 대 한 메서드 (예: 온라인)의 올바른 유형을 선택 합니다. 참고 매개 변수 및 설정 단백질 실험에 대해 정의 된 새 열된 방법에 저장 됩니다.
   2. 초기 빼기 보기 가져오기 빈 빈 실행의 신호를 가져오려면 클릭 합니다. 악기 (옆 빈 가져오기 버튼)에서 모두 뺄 검출기의 선택 합니다.
   3. 솔루션의 RI¹²실행된 동안 변경 이후 봉우리 보기에서 단백질 피크 지역에 해결책의 전도도 때문 dn/dc 값 (필요한 경우)를 조정 합니다.
3. BSA 단위체와 전류 구동 MALS 시스템 보정.
   참고: 일반적으로, 전류 구동 MALS 시스템은 주기적으로 보정 피크 정렬, 밴드 확대, 및의 선회 (R_g)의 반경 가진 단 분산 단백질을 사용 하 여 90 °의 검출기 각도 검출기의 < 10 nm, BSA 단위체 등. 이 예제에서는 BSA 모두 교정 분자 하며 자체 어 금 니 질량 분석의 주제 이다.
   1. 절차 에 따라 봉우리 정렬 > 구성 보기.
   2. 3.0 입력 정규화 보기 아래 정규화 수행 R_g 값으로 nm.
   3. 동일한 구성 탭에서 밴드 확대 를에서 피크를 선택 하 고 맞는 수행 버튼을 사용 하 여 RI 신호에는 UV 및 LS 신호를 일치 합니다.
4. 결과의 그래프 결과 피팅 보기에 표시 됩니다. 그래프를 마우스 오른쪽 단추로 클릭, 편집을 선택한 다음 고급 버튼을 클릭 하 여 축 비늘과 다른 그래프 매개 변수를 변경 합니다. 더 많은 디스플레이 옵션 그래프 그림은 또한 EASI 그래프 탭에서 사용할 수: 윈도우의 상단에 표시 하는 드롭 다운 메뉴에서 선택 하는 어 금 니 질량 .
5. 참고 어 금 니 질량, 반지름, 순도의 수준 및 다른 사람를 포함 하 여 모든 결과 결과 섹션에서 보고서 보기 요약 (세부)에서 사용할 수 있습니다. 보고서 디자이너 단추를 사용 하 여 보고서에 더 많은 결과 또는 매개 변수를 뿐만 아니라 숫자, 추가.

결과

BSA는 크로마토그래피 실험 시스템²² 의 교정에 대 한 사용 되 고 높은 전류 구동 MALS 뿐만 아니라 초 MALS 연습에 적합 한 일반적인 단백질 이다. 그것은 주로 66.7 kDa의 이론적인 단위체 질량으로 단위체 이며 일반적으로 이합체 및 더 높은 올리고²³의 작은 숫자를 포함.

BSA에 전류 구동 MALS 음이온 교환 분석 열을 사용 하 여 분석 ( 재료의 표참조). 넓은 선형 그라데이션 30의 구성 된 350 mm NaCl 75 m m에서 CV 높은 올리고에서 BSA 단위체를 분리. 다운스트림 MALS 분석 결과 66.8 ± 0.7 kDa의 계산 된 단위체의 어 금 니 질량 및 130 ± 5 kDa (그림 1A)의 계산된 이합체 어 금 니 질량.

Eluted 봉우리에서 버퍼 전도성을 바탕으로, 그라데이션 다른 프로그램으로 변경 되었습니다: 175 m m NaCl의 긴 단계 다음에 선형 그라데이션 175 m m에서 500 m m NaCl. 새로운 그라데이션 크게 향상 된 해상도 우수한 (66.1 ± 0.7 kDa의 계산 된 어 금 니 질량)와 BSA 단위체와 (132 ± 2 kDa의 계산 된 평균 질량)와 높은 oligomeric 종 구분 (그림 1B). 또한 높은 oligomeric 종에 집중 하 고 각 개별 oligomeric 형태의 BSA의 어 금 니 질량을 계산, 200 mM와 250mm NaCl의 stepwise 프로그램 적용 되었습니다. 이 실험 결과 우수한 BSA (62.4 ± 0.4 kDa의 계산 된 질량)으로 단위체, 이합체 (130 ± 10 kDa의 계산 된 질량)와 삼합체 (170 ± 10 kDa의 계산 된 질량)으로 구분 (그림 1C). 모든 전류 구동 MALS 실험 BSA BSA 단위체 85¹²의 순도 함께 elute 초 MALS 결과와 80%의 순수성을 가진 모노 머로 주로 elutes 보여줍니다.

그림 1 : 전류 구동 MALS BSA에 대 한 실험의 최적화. (A) 전류 구동 MALS 75-350 m m NaCl의 그라데이션 프로그램 BSA의 실험. (B) 전류 구동 MALS 175 m m NaCl 단계 뒤에 175-500 m m NaCl의 선형 그라데이션 프로그램의 프로그램 BSA의 실험. (C) 전류 구동 MALS 200 mM와 250mm NaCl의 단계 프로그램 BSA의 실험. chromatograms 280 nm (파란색), 빛 (빨간색), 90 ° 각도 굴절률 (핑크) MALS (검정)에 의해 계산 된 각 피크의 어 금 니 질량 함께 전도도 (회색) 곡선에서 비 산에 UV를 표시 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

전류 구동 MALS 네이티브 올리고, nonnative 집계, 화학식 및 noncovalent 특성화 단백질 분리 및 이기종 샘플으로 뿐만 아니라 순수 단백질의 정확한 어 금 니 질량 결정 수 있도록 특성화에 대 한 강력한 방법입니다. 단지, 그리고 conjugated 단백질입니다. 선형 그라데이션 또는 일련의 소금 농도 단계 구성 된 프로그램 단백질 인구의 좋은 분리를 달성 하 고 각 개별 피크는 MALS에서의 적절 한 분석을 허용 수 있습니다. 그라데이션 같은 다른 매개 변수를 변경 하 여 추가 최적화 경사 (프로토콜의 3.4 단계 참조), 더 나은 해상도 필요한 경우 수행할 수 있습니다. 전류 구동 MALS 이후 단백질 특성 분석, 보완 초 MALS 같은 다른 방법에의 한 추가, 중요 한 수준을 제공 하는 귀중 한 단백질 품질 관리 분석 결과 될 수 있습니다.

초 MALS 단백질 어 금 니 질량 결정에 대 한 표준 및 일반적인 기술 이다, 하는 동안 표준 분석 초 열의 상대적으로 낮은 해상도 MALS¹²달성 정확한 어 금 니 질량 측정을 제한할 수 있습니다. 일부 SEC MALS의 한계 등 연속 올리고, 단위체 피크, 그리고 수정 된 단백질 등 비슷한 어 금 니 질량을 가진 이질적인 인구에서 완전히 분리 되지 집계의 높은 수준을 포함 하는 솔루션.

전류 구동 설계 하 고 수행 초, 보다 더 복잡 한 크로마토그래피 방법 이지만 전류 구동 MALS 실험에서 얻은 정보 보완 하 고 때로는 초 MALS 분석 보다도 더 유익 될 수 있다. 전류 구동 MALS는 성공적으로 항 체 변형 하지 완전히 분리 된 초, 및 짧은 펩 티 드 분석 하기 어려운 초^12,24같은 어 금 니 질량, 올리고 공유 하는 특징 이다. 또한, 너무 커서 전체 (포함 하 바이러스 성 DNA) 및 adeno 관련 바이러스 (AAV)의 빈 입자 등 초,으로 구분 하는 고분자 어셈블리 전류 구동²⁵ MALS 분석 이전에 의해 해결할 수 있습니다. 초에 비해 전류 구동은 더 다양 한 분리 기능¹⁴ 그리고 그것이 버퍼 pH, 소금, 유형 및 길이 열, 그리고 다른 유형의 최대 해상도 높이기 위해 여러 매개 변수를 조정의 유연성. 초, 달리는 샘플 주입 전류 구동에 대 한 볼륨 제한이 없습니다 그리고 어떤 분자 크기의 독립적인 분석 될 수 있다 (Amartely 외.¹²의 Table 1 참조). 이것은 주로 아주 작은 단백질 또는 희석된 단백질 농도 따라 집계를 위한 추세와 같은 낮은 LS 강도, 샘플에 대 한 전류 구동 MALS의 큰 장점은. 분석 전류 구동 열 더 안정 되어 있기 때문에 초 열 보다 적은 입자를 분리 하는 경향이, 전류 구동 MALS 매우 짧은 평형은 시간이 필요, 그리고 LS 신호는 매우 빠르게 안정화. 이 프로토콜에서 설명 된 대로 개별 실험의 실행 및 필요에 따라 실행의 중지 수 있습니다.

초, 달리는 일반적으로 제공 합니다 좋은 결과 단 1 개 (오른쪽 분류 범위 열 사용) 실험, 전류 구동 메서드 매개 변수를 조정 하 여 최적의 해상도 달성 하기 위해 몇 가지 실험 필요할 수 있습니다. 전류 구동 MALS 실험에는 솔트 그라디언트, 버퍼 전도도 수행 되 고, 따라서, RI는 극적으로 RI 신호에 따른 변화, 실행 하는 동안, 변경 합니다. 이 농도 분석은 UV 탐지 (멸종의 선험적 지식이 필요로 제한 기준선 빼기 (5.2 프로토콜의 단계에서와 같이)와 각 전류 구동 MALS 실험 및 분석에 대 한 실행 하는 추가 빈 필요 각 피크에 대 한 계수)입니다. 추가 방법의 개발은 여전히 필요 소금 stepwise 프로그램의 성공적인 초기 빼기에도 기준선 빼기와 분석 선형 그라디언트에 대 한 강력한입니다. 각 피크의 dn/dc 값 특정 버퍼 전도도 eluted 피크 (계산 문학¹²에서 찾을 수 있습니다)에 따라 조정 되어야 한다. 단백질이이 조정 200 mM (BSA 예제에서 같은), 보다 낮은 NaCl 농도에 eluted 무시할 수입니다.

상대적으로 많은 양의 단백질 초 MALS에 비해 (단계로 2.3 프로토콜의) 전류 구동-MALS에서 사용 되는 소금 기온 변화도의 불완전 한 혼합으로 인해 RI 변동으로 인 한 RI 신호의 극적인 변화를 극복 하는 것이 중요 합니다 그라데이션 완충기입니다. UV 탐지 질량 측정을 위해 사용 하는 경우에 작은 금액을 사용할 수 있습니다. 주입 하는 단백질의 양을 단백질, 균질 성, 순수성, 및 UV 소멸 계수의 분자량에 따라 달라 집니다. 필요한 주입 된 질량 더 작은 단백질을 위해 더 높은 더 큰 단백질 (150 kDa 단백질에 대 한 20 kDa 단백질 및 ~0.2 밀리 그램에 대 한 ~ 1 mg)에 대 한 낮은 해야 합니다. 다른 유형의 샘플 수량 여러 인구 사이 분할 된다 이후 더 많은 샘플의 주입이 필요 합니다. 분석 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) FPLC 시스템 보다 더 적은 자료를 요구할 수 있습니다.

최근, 정화 절차 동안 MALS를 사용 하 여 인라인 분석 보고 되었습니다. 이러한 실시간 분석은 정화²⁶후 단백질의 어떤 추가 분석에 대 한 필요성을 제거할 수 있는 정화 하는 동안 발생 하는 집계 제품에 대 한 매우 효율적. 전류 구동 크로마토그래피는 자주 중간 정화 단계;로 사용 따라서, 대리점 전류 구동 열 MALS의 조합 뿐만 아니라 대규모 정화 절차에 대 한 실시간 분석으로 뿐만 아니라 분석 특성화 방법으로 유용할 수 있습니다. Nonanalytical 전류 구동 열 입자 방출의 낮은 정도 가진 안정 되어 있으며, 따라서 MALS 함께 사용할 수 있습니다. 친화성 크로마토그래피 또는 소수 교환 크로마토그래피 등 다른 분리 기법 또한 MALS 비교적 순수한 견본을 복종 될 때 (MALS 및 RI 검출기의 오염 방지)을 결합 수 있습니다. 이것은 적응 필요와 최적화 방법 뿐만 아니라 좋은 피크 분리 하지만 또한 충분히 깨끗 한 LS 및 RI의 성공적인 MALS 분석 신호.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
ÄKTA pure	GE Healthcare	29-0182-26	FPLC
0.02 µm Anotop Whatman Filter 10 mm	GE Healthcare	6809-1002	Sample Filter
0.1 µm Anotop Whatman Filter 10 mm	GE Healthcare	6809-1012	Sample Filter
0.1 µm Anotop Whatman Filter 25 mm	GE Healthcare	6809-2012	Mobile phase filter
BSA (purity >97%)	Sigma	A1900	Bovine serum albumin
miniDAWN TREOS	Wyatt Technology	WTREOS	MALS
mono Q HR 5/50 GL	GE Healthcare	17-5166-01	Anion exchange analytical column
Optilab T-rEX	Wyatt Technology	WTREX	Refractometer
0.1 mm PES 1000 mL Stericup	Millipore	SCVPU11RE	Mobile phase filter
Sodium chloride	Sigma	71382	HPLC grade NaCl
TRISMA base	Sigma	T-1503	TRIS buffer