아파티닙 내성 폐 선암 종 PC-9 세포주 의 설립 및 특성은 아파티닙의 증가 복용량으로 개발

요약

폐 선암종 PC-9 세포로부터 아파티닙 내성 세포주를 확립하는 방법이 개발되었고, 내성 세포가 특징지어졌다. 내성 세포는 비소세포 폐암 환자에게 적용되는 표피 성장인자 수용체 티로신 키나아제 억제제 내성 메커니즘을 조사하는데 사용될 수 있다.

초록

분자 표적 억제제에 대한 획득된 내성은 암 치료에 심각한 문제이다. 폐암은 대부분의 국가에서 암 관련 죽음의 주요 원인 남아 있습니다. 표피 성장 인자 수용체(EGFR)-활성화 돌연변이와 같은"종양발생 드라이버 돌연변이"의 발견, EGFR 티로신 키나아제 억제제(TKIs)의 분자 표적제의 후속 개발(gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib, 및 osimertinib) 최근 수십 년 동안 극적으로 변경 된 폐암 치료. 그러나, 이들 약물은 EGFR-활성화 돌연변이를 운반하는 비소세포 폐암(NSCLC)을 가진 환자에서 여전히 효과적이지 않다. 후천성 저항에 이어, NSCLC의 전신 진행은 EGFR 돌연변이 양성 NSCLC를 가진 환자 를 치료하는 데 중요한 장애물로 남아 있다. 여기서, 우리는 EGFR 엑손 19에서 EGFR 쌍 삭제의 EGFR 활성화 돌연변이를 품고 있는 NSCLC PC-9 세포로부터 3개의 독립적인 획득된 afatinib 내성 세포주를 확립하기 위한 단계적 투여량 에스컬레이션 방법을 제시한다. 3개의 독립적인 afatinib 저항 세포주를 특성화하는 방법은 간략하게 제시된다. EGFR TKIs에 대한 획득된 저항 메커니즘은 이기종이다. 따라서 EGFR-TKIs에 대한 후천성 저항성을 가진 다중 세포주를 검사해야 합니다. 10 12 개월이 단계별 복용량 에스컬레이션 접근 방식을 사용 하 여 획득 된 저항세포를 얻을 필요. 새로운 취득한 저항 기계장치의 발견은 더 효과적이고 안전한 치료 전략의 발달에 기여할 것입니다.

서문

5개의 티로신 키나아제 억제제, 표적표피 성장 인자 수용체(EGFR), 게피티닙, 에로티닙, 아파티닙, 다코미티닙, 및 오시메르티닙을 포함한 현재 EGFR 돌연변이 양성 비소세포 폐 환자를 치료하는데 사용할 수 있다. 암 (NSCLC). 지난 10 년간, 그 같은 환자를 위한 치료는 새로운 잠재적인 EGFR-TKIs의 발견과 극적인 발달을 겪었습니다. 폐 선암종 환자 중 EGFR의 체세포 돌연변이는 아시아인의 약 50 %와 백인 환자의 15 %에서 확인됩니다^1. EGFR에서 가장 흔한 돌연변이는 EGFR 엑손(19)^2에서EGFR 엑손 21 및 15 염기 쌍(bp) 삭제에서 L858R 점 돌연변이이다. NSCLC를 가진 EGFR 돌연변이 양성 환자에서, EGFR-TKIs는 백금 doublet 화학요법의이전 표준에 비해 반응 비율 및 임상 결과를 향상합니다 3.

Gefitinib 및 에로티닙은 최초로 승인된 소분자 억제제였으며 일반적으로 1세대 EGFR TKIs로 지칭된다. 이러한 EGFR TKIs는 ATP와 경쟁하여 티로신 키나아제 활성을 차단하고 ATP 결합 부위에 가역적으로 결합한다^4. 아파티닙은 EGFR의 티로신 키나아제 도메인에 비가역적이고 공유적으로 결합하는 2세대 EGFR TKI이며 범인간 EGFR 패밀리 억제제^5로서특징이 있다.

NSCLC를 가진 환자에 있는 이 치료의 극적인 이득에도 불구하고, 취득한 저항은 불가피합니다. 1 세대 및 2 세대 EGFR TKIs에 대한 가장 일반적인 저항 메커니즘은 EGFR exon 20에서 T790M 돌연변이의 출현이며, 이는 종양 샘플 6,^7,8의50-70 %에 존재한다. 다른 저항 기전은 우회 신호 (MET, IGF1R 및 HER2), 소세포 폐암으로의 변환, 및 전임상 및 임상적으로 발생하는 상피-중간엽 전이의 유도를 포함한다. EGFR TKIs에 대한 저항 메커니즘은 이기종이다. 전임상 연구에서 새로운 내성 메커니즘을 식별함으로써, 내성을 극복하기 위해 새로운 치료법을 개발할 수 있다. 환자에게 임상적 이점을 극대화하는 최적의 서열 요법은 내성 메커니즘 및 치료 적 표적을 고려해야 한다.

그것은 모든 후속 실험의 기초이기 때문에, 올바른 부모의 세포줄을 선택하는 것이 필수적이다. 선택 전략은 임상 적 관련성으로 시작됩니다. 화학 요법과 방사선 순진한 세포줄을 선택할 필요가 있습니다. 이전 화학요법 및/또는 방사성 치료는 내성 경로의 변경 및 약물 내성 마커의 발현의 변화를 유도할 수 있다. 본 연구에서, EGFR 엑슨 19에서 15 bp 삭제를 운반하는 PC-9 세포는, afatinib에 취득한 저항의 설치를 위해 이용됩니다. 이 세포주 세포주 환자는 일본 NSCLC 환자에서 유래하였고, 이들은 이전에 화학요법과 방사선을 받지 않았다.

아파티닙은 매일 구두로 투여되기 때문에, 세포가 아파티닙의 존재 내에서 지속적으로 배양되는 체외 내 치료는 임상적으로 관련이 있을 것이다. 실험의 다양한 단계에서 사용되는 약물의 투여량은 선택된 부모 세포주에 대해 최적화되어야 한다. 세포 독성 분석법은 약물의 약물 동력학 정보와 비교되어야하는 적합한 약물 범위를 결정하는 데 사용될 수 있습니다.

선택 과정 전반에 걸쳐, 세포의 전체 집단은 단일 그룹으로 유지된다; 복제 또는 기타 분리 방법은 사용되지 않습니다. 세포는 먼저 약물의 낮은 수준에 지속적으로 노출됩니다. 이어서, 세포가 약물의 존재 속에서 성장하도록 적응한 후, 약물의 투여량은 약물의 최종 최적 용량으로 서서히 증가한다^10,11. 대안적으로, 펄스 약물 투여 또는 돌연변이 발생은 약물 ^{치료(12,13)}이전에 수행되는 저항성 세포를 선택하는데 사용될 수 있다. 불행히도 약물 내성이 발병하지 않는 경우는 일반적으로 보고되지 않습니다. 선택 전략은 임상적으로 관련된 저항을 재건하기 위한 암 환자의 조건을 모방하는 것을 목표로 개발됩니다. 때로는 약물 내성의 메커니즘과 관련된 분자 변화를 식별하기 위해 높은 약물 농도가 사용됩니다. 이 모델은 임상적으로 관련성이 낮아집니다.

여기서, 우리는 EGFR 엑손(19)에서 15bp 의 탈착을 수용하는 PC-9 세포로부터 3개의 독립적인 afatinib 내성 세포주를 확립하는 방법뿐만 아니라 아파티닙 내성 세포주들의 초기 특성화를 설명한다.

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프로토콜

1. 독립형 아파티닙 내성 PC-9 세포주 3개 구축

1. 3-(4,5-디메틸티아졸-2-yl)-2,5-디페닐테테라졸륨 브로마이드(MTT) 분석법을 사용하여 PC-9 세포에 대한 초기 아파티닙 노출 농도의 결정
   1. 배양 PC-9 세포는 태아 소 혈청(10%), 페니실린(100 U/mL), 및 스트렙토마이신(100 μg/mL)을 함유하는 성장 배지에서 세포 배양에서 5% CO2 인큐베이터에서 5% CO2 인큐베이터에서 처리하였다.
   2. 성장 배지에서 4 x 10⁴ 세포 / mL에서 PC-9 세포를 다시 일시 중단하고 96 웰 마이크로 플레이트에서 50 μL / well에서 씨앗을 제거하십시오. 세포의 최종 농도는 2.0 x 10³ 세포/ 50 μL / well입니다. 37°C에서 5%_CO2 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다.
   3. 성장 배지(50 μL)를 함유하는 웰에 0, 0.002, 0.006, 0.02, 0.06, 0.2, 0.6, 2, 6 및 20 μM의 다양한 농도로 50 μL의 아파티닙 용액을 첨가한다. 아파티닙의 최종 부피 및 농도는 각각 100 μL 및 0, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3 및 10 μM이다.
   4. 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에서 96시간 동안 96웰 플레이트를 배양한다.
   5. 염료 용액 15 μL을 각 웰에 추가하고 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에서 4시간 동안 배양한 다음 용해/정지 용액 100μL을 각각 잘 추가하고 5% CO<에서 밤새 배양합니다<< 37 °C에서 c10>2 인큐베이터.
   6. 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 570 nm (OD_570)에서광학 밀도를 측정하십시오 (재료 표참조). 6-12개의 복제를 준비하고 적어도 3회 실험을 반복한다.
   7. 통계 소프트웨어(재료 표참조)를 사용하여 이러한 데이터를 반로그 그래프로 그래픽으로 플롯하고 최대 50%의 응답을 감소시키는 약물 농도인 IC₅₀ 값을 계산합니다(재료 표 참조) ).
2. 돌이킬 수 없는 EGFR-TKI, 아파티닙에 PC-9 세포의 지속적인 노출, 3개의 독립적인 10cm 접시에 단계적 투여량 에스컬레이션
   1. 배양 PC-9 세포는 성장 배지의 10 mL를 함유하는 p100 접시에. PC-9 세포가 하위-결합 단계에 도달하면, 세포 현탁액 1mL을 3개의 새로운 p100 접시로 옮기고 9 mL의 성장 배지를 사용합니다. 1:10 희석된 PC-9 세포는 3-4일 안에 하위-결합이 되며, 세포 수는 약 4-5 x 10⁵ 세포/mL입니다.
   2. 다음 날, 3개의 p100 요리각각에 아파티닙의 IC₅₀ 값의 1/10을 추가합니다.
      참고: 아파티닙은 DMSO에서 1 μM, 10 μM, 100 μM, 1 mM 및 5 mMM의 재고 농도로 재구성됩니다. 1 ~10 μL의 아파티닙-액은 필요한 최종 농도에 따라 배양배지의 10 mL에 첨가된다.
   3. afatinib 함유 p100 접시의 세포가 서브-컨벤티션이 되면, 1 mL 파이펫으로 포부로 잘 혼합하고 새로운 p100 접시에 9 mL의 신선한 성장 배지에 세포 현탁액1 mL을 추가합니다. 다음으로, 새로운 문화에 10-20% 더 높은 농도의 아파티닙을 추가하십시오.
   4. 아파티닙 농도를 0.1 nM에서 1 μM으로 증가시켜 10-12개월의 기간 동안 각 단계에서 아파티닙 농도가 10-20% 증가하면서 단계별 투여량 에스컬레이션에 의해 증가한다.
      참고: 아파티닙 농도가 IC₅₀ 값에 접근할 때, 세포 성장은 매우 느려진다. 세포가 1:9로 분할되는 경우에, 이 세포는 afatinib의 더 높은 농도에 의해 살해되기 때문에, 그(것)들은 증가하지 않을 수 있습니다. 따라서, 더 높은 afanitib 농도에서, 세포는 1:2의 비율로 분할될 수 있다. 가장 저항하는 세포는 3-14일 동안 afatinib 함유 배지에서 성장하였고, 배지는 내성 세포가 통과될 필요가 있을 때까지 변하지 않았다.
   5. 1 μM 아파티닙 함유 성장 배지에서 2-3개월 동안 아파티닙 내성 세포를 배양하였다. 1 μM의 afatinib 농도에서, 10-12 개월이 모델에서 afatinib에 저항을 개발 하는 데 필요한. MTT 분석기를 수행하여 세포가 아파티닙에 내성이 있는지 확인합니다. 독립적으로 확립된 3개의 afatinib 저항 세포주명명된 AFR1, AFR2, 및 AFR3.

2. 3개의 독립적인 afatinib 저항하는 세포의 특성화

1. 부모 PC-9 세포의 성장 곡선의 결정 및 afatinib 저항 하는 세포의 설립
   1. 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에서 성장 배지에서 PC-9, AFR1, AFR2 및 AFR3 세포를 배양하였다.
   2. 성장 배지로 5 x 10³ 세포 / mL에서 세포를 다시 중단하고, 세포의 최종 농도가 500 세포 / 100 μL / well이되도록 96 웰 마이크로 플레이트에 100 μL / well을 넣습니다.
      참고: MTT 분석은 0, 1, 2, 3, 5 및 7일에서 OD₅₇₀ 값을 측정하기 위해 수행된다. 매일 6개의 96웰 마이크로플레이트가 필요합니다.
   3. MTT 분석을 24시간마다 수행한 다음 0, 1, 2, 3, 5 및 7일에 수행합니다. OD₅₇₀ 값을 측정하고 6-12 복제를 준비; 실험을 세 번 이상 반복하고 통계 소프트웨어를 사용하여 결과를 그래픽으로 플로팅합니다(재료 표참조).
2. 실시간 PCR에 의한 EGFR의 게놈 DNA 변조 확인
   참고: 아파티닙은 EGFR 티로신 키나아제를 표적으로 하는 소분자 억제제이다. EGFR 발현 상태는 DNA 및 단백질 수준에서 결정된다.
   1. 게놈 DNA는 제조업체의 지시에 따라 DNA 정제 키트(재료 표참조)를 사용하여 분리됩니다. 분광광도계로 분리된 게놈 DNA의 농도를 측정하고 모든 게놈 DNA 샘플을 25 ng/μL로 조정합니다.
   2. SYBR 그린 마스터 믹스(재료 표참조)를 사용하여 25 ng/μL 스톡의 2 μL에 해당하는 게놈 DNA 50ng을 증폭하고 형광 기반 RT-PCR 검출 시스템을 사용하여 결과를 분석합니다(재료 표참조).
      참고: PCR 사이클링 조건은 20초 동안 95°C에서 초기 변성 단계로 시작하여 3초 동안 95°C 변성의 40사이클, 30초동안 60°C 어닐링으로 시작되었습니다. 특정 프라이머 세트는 다음과 같습니다: EGFR F: 5′-CAAGGCCATATGGTCA-3′, R: 5′-CTGGAATGGGGAACA-3′. 정상화 유전자 LINE-1 F: 5′-AAAGCCGCTACATGG-3′, R: 5′-TGCTTTTTTTGAATGCGTCCCAGAG-3′.
3. 서부 얼룩 분석에 의한 EGFR 수준에 대한 단백질 변경의 영향 평가
   1. 24 시간 동안 실험하기 전에 아파티닙으로 세포를 지속적으로 치료하십시오. PC-9, AFR1, AFR2 및 AFR3 세포를 5 mL의 얼음 차가운 PBS로 두 번 씻으하십시오.
   2. 1% 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 RIPA 완충제의 세포를 라이즈(재료 표참조) 및 인산염 억제제 칵테일 II 및 III(재료 표참조)에서 30분 동안 4°C에서 배양합니다. 100 x g 및 4 °C에서 클리어 된 용해액을 수집합니다.
   3. 비신코닌산 분석법(재료 표참조)을 사용하여 단백질 농도를 결정하고, 4x 샘플 버퍼(500 mM Tris (PH 6.8), 40% 글리세롤, 8% SDS, 20% H₂O, 0.02% 브로모펜 블루를 사용하여 모든 단백질 샘플을 0.5 μg/μL로 조정하고 96°C에서 5분간 끓인다.
   4. 동일한 양의 단백질 샘플을 분리하여, 바람직하게는 20-30 μL, 8% SDS 페이지로 단백질을 폴리비닐리덴 불소(PVDF) 멤브레인으로 옮김.
      참고: 나트륨 도데실 황산염-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)은 분자량에 따라 단백질의 분리를 위해 실험실에서 일반적으로 사용됩니다.
      1. 에탄올로 유리 판을 청소하고 유리 판과 스페이서를 조립합니다. 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8, 40% 비스 아크릴아미드, 10% SDS, 10% APS 및 TEMED를 함유하는 8% 폴리 아크릴아미드 젤을 준비합니다. 실온에서 30 분 동안 중합.
      2. 이어서, 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8, 40% 비스-아크릴아미드, 10% SDS, 10% APS 및 TEMED를 함유하는 스태킹 겔을 준비한다. 스태킹 젤 용액을 추가하고 빗을 삽입하고 실온에서 20-30 분 동안 젤을 중합합니다.
      3. 겔을 전기 동공 장치에 놓고 실행 버퍼 (0.25 M Tris, 1.92 M 글리신 및 1 % SDS)로 탱크를 채웁니다. 동일한 양의 단백질 샘플(20-30 μL)을 로드하고 약 60분 후에 염료 전면이 겔에서 흘러나오면 180 V. 전기 영동을 중지하여 겔을 실행합니다.
      4. 젤을 TBST로 1-2 분 동안 씻은 다음 300 mA의 일정한 전류에서 1.5 시간 동안 반 건조 블로팅 (재료 표참조)으로 PVDF 멤브레인에 단백질을 옮김을 옮니다.
   5. 실온에서 1시간 동안 TBST 용액으로 희석된 무지방 건조우유(재료표 참조)로 멤브레인을 차단한 다음, 안티EGFR, 항포스-EGFR(Y1068), 항-HER2로 멤브레인을 프로브하고, 항-HER3, 항-MET 및 항액틴 항체(TBST에서 1:3,000 희석) (재료 표참조) 4 °C에서 하룻밤.
   6. 10 분 동안 TBST로 멤브레인을 세 번 씻은 다음 실온에서 1-1.5 시간 동안 이차 항체 (TBST에서 희석 된 1 :200)에 멤브레인을 노출시킵니다. 실온에서 TBST로 멤브레인을 5회 세척하고 ECL 용액에 노출시키고(재료 표참조) 필름을 사용하여 신호를 시각화합니다.
4. 시퀀싱에 의한 EGFR 돌연변이 분석
   1. EGFR 엑슨 19-21에 대한 특정 프라이머를 사용하여 게놈 DNA를 증폭시다. PCR 사이클링 조건은 1 분 동안 94 °C에서 초기 변성 단계로 시작하여 10 초 동안 98 °C에서 30 사이클의 변성, 30 초 동안 55 °C에서 어닐링, 72 °C에서 1 분 동안 연장합니다.
      참고: EGFR 엑슨에 대한 특정 프라이머 19: F: 5′-GCAATCTGCGCGCGCC-3′ R: 5′-카타가아아아아아GT가아카타그타그GTG-3′, 엑슨 20: F: F: 5′-CCATGAGTACTTTGAACTC-3′, R: 5′-CATATCCCCATCAAACTTGC-3′, 그리고 엑소 21: F: 5′-ATGAAATGATATTG-3′, R: 5′- GCTCACAGAATGTGG가-3′.
   2. PCR 정제 키트를 사용하여 증폭된 PCR 제품을 정화하고(재료 표참조) 앰플리온을 순서화합니다.

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결과

단계적 투여량-에스컬레이션 절차를 사용하여 PC-9 세포로부터 3개의 아파티닙 내성 세포주를 확립하기 위한 스키마는 도1에 나타내고 있다. 도 2는 아파티닙의 농도가 증가함에 따라 부모PC-9 세포의 세포 증식의 감소를 나타내며, 이는 PC-9 세포가 아파티닙 노출에 민감하다는 것을 나타낸다. 도 3은 3개의 ?...

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토론

여기에서, 우리는 3개의 독립적인 afatinib 저항하는 세포주를 설치하는 방법을 기술하고 부모 PC-9 세포에 비교하여 이 세포를 특징으로 합니다. 단계적으로 복용량 에스컬레이션 노출에 의해, 부모 PC-9 세포의 기간 동안 afatinib에 저항을 획득 10-12 개월. 임상적으로, EGFR TKIs에 대한 저항 기전은 이질적이며, 따라서, 아파티닙을 사용하여 초기 처리 후, PC-9 세포를 3개의 독립적인 p100 요리로 나누어 아?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
afatinib	Selleck	S1011
anti-EGFR monoclonal antibody	cell signaling technology	4267S
bicinchoninc acid assay	sigma	B9643
cell-culture treated 10 cm dish	Violamo	2-8590-03
CELL BANKER1	TakaRa	CB011	cryopreservation media
CellTiter 96	Promega	G4100	Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution
DMSO	Wako	043-07216
ECL solution	Perkin Elmer	NEL105001EA
FBS	gibco	26140-079
GeneAmp 5700	Applied Biosystems		fluorescence-based RT-PCR-detection system
GraphPad Prism v.7 software	GraphPad, Inc.		a statistical software
NanoDrop Lite spectrophotometer	Thermo		spectrophotometer
Nonfat dry milk	cell signaling technology	9999S
Pen Strep	gibco	15140-163
phosphatase inhibitor cocktail 2	sigma	P5726
phosphatase inhibitor cocktail 3	sigma	P0044
Powerscan HT microplate reader	BioTek
Power SYBR Green master mix	Applied Biosystems		SYBR Green master mix
protease inhibitor cocktail	sigma	P8340
QIAamp DNA Mini kit	Qiagen	51306	DNA purification kit
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN		PCR purification kit
RPMI-1640	Wako	189-02025	with L-Glutamine and Phenol Red
TBST powder	sigma	T9039
Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell	Bio-Rad		semi-dry t4ransfer apparatus
96 well microplate	Thermo	130188