관 구조의 조직 공학을 위한 코어/쉘 인쇄 비계

요약

여기에 제시된 것은 혈관 및 기타 관 구조의 조직 공학에 적합한 중공 비계의 한 단계 제작을 위한 사용이 간편한 코어/쉘, 3차원 생체 인쇄 설정입니다.

초록

코어/쉘 필라멘트의 3차원(3D) 프린팅을 통해 액체 코어와의 인터페이스에서 가교되는 안정적인 쉘로 채널 구조를 직접 제작할 수 있습니다. 후자는 중공 튜브를 남기고 인쇄 후 제거됩니다. 적층 제조 기법을 통합하는 것은 (여기에 설명된 것과 같이 구조적으로 그리고 생화학적으로 네이티브 세포 외 매트릭스 [ECM]를 모방한 맞춤형 [bio]잉크)와 같이 고급 조직 공학을 향한 중요한 단계입니다. 그러나 잘 정의된 구조물을 정밀하게 제작하려면 사용 중재료에 최적화된 맞춤형 제작 전략이 필요합니다. 따라서 사용자 정의, 사용이 간편하며 광범위한 재료 및 응용 프로그램과 호환되는 설정으로 시작하는 것이 합리적입니다. 이 작품은 잘 정의 된 알긴산 기반 스캐폴드 재료 제형으로 테스트 된 목재 더미 구조의 코어 / 쉘 인쇄를 탐구하기 위해 루어 호환성을 갖춘 제조하기 쉬운 코어 / 쉘 노즐을 제공합니다.

서문

틀림없이, 조직 공학 (TE)의 궁극적 인 목적은 인체의 부상 또는 병든 부분을 재생성하거나 대체하는 데 사용할 수있는 시험관 내에서 기능성 조직 또는 장기를 생산하는 것입니다^1,2,3. 조직 공학 (TE)의 현재 연구는 분야의 개별 적인 양상 (비계 물자, 제조 절차, 세포 근원 등)에 집중됩니다 ^4,5,뿐만 아니라 그들의 생체 내 대응의 근본적인 측면을 모방 하는 조직 및 장기의 간단한 생체 외 모델 개발. 이러한 모델은 특히 기존의 2D 세포 배양이 네이티브 조직의 동적 반응을 모방하지 못하는 경우 약물 스크리닝 및 독성 연구와 같은 많은 응용 분야에 이미^{유용하다 6,7, 8,9}. 3차원 시험관내 모델은 일반적으로 세포^10,물리 화학 큐¹¹및 생물학적 활성 분자^12,13을 스캐폴드에 결합하여 구성되며, 이는 탈세포조직 또는 생물학적 또는 생체적합성 물질로부터 데노보를 ^{14,15,16,17,18.}

스캐폴드는 생체 내 조직을 대표하는 엔지니어링 조직의 기능을 가능하게하기 위해 기본 조직의 복잡한 3D 마이크로 아키텍처 및 계층 구조를 재량화하는 것이 중요합니다^19. TE의 중요한 기술 발전에도 불구하고, 생리학적으로 관련된 인공 조직 구조의 개발은 여전히 도전과제로 남아 있습니다. 두꺼운 조직 (>200 μm 두께)은 산소 및 영양 확산^(20)과같은 제한으로 인해 특히 문제가된다. 더 큰 조직 구성으로 진행 이 만들어졌습니다. 그러나 산소와 영양분을 수송하고 폐기물 제거를 촉진하기 위해 혈관에 세포의 높은 근접성을 다시 환기시켜야합니다. 조직의 혈관 화 (또는 대안적으로, 조직 구성 내의 상호 연결된 3D 혈관 네트워크의 제조)는 세포 생존력을 유지하고 체외 엔지니어링 조직의 기능을 촉진하는 데 중요한 역할을합니다. 장기간 실험^21,22에서모델 . 또한 필요한 해상도, 구조적 무결성 및 동시 생체 적합성은 아직^23을달성하지 못했습니다.

몇몇 TE 접근은 혈관 같이 구조물을 건설하고 시험관에서 혈관화를 촉진하기 위하여 시도에서 제안되었습니다. 몇 가지 예로는 미세 혈관^{네트워크(24)를}생성하기 위해 자체 조립하는 내피 세포(섬유아세포와 같은 다른 세포 유형과 공동 배양)를 시딩하고, 혈관 전구 세포 및 내피 세포를 촉진하는 회비 세포를 사용하는 것이 있습니다. 성장^21,25,혈관 형성을 유도하는 혈관 신생 성장 인자 전달 20,^26,혈관 층^20,제조를 제어 할 수있는 세포 시트 기술을 사용하여 혈관신생을 촉진하는 고다공성 스캐폴드^구조(27). 언급된 접근법은 혈관신생 유도에 초점을 맞추고, 이는 일반적으로 상당한 양의 추가 성장 인자(예를 들어, VEGF)와 형성하는 시간을 필요로 한다. 그러나, 가장 큰 단점은 혈관 패터닝에 대한 제한된 재현성 및 제한된 공간 제어이며, 일반적으로 반드시 관류를 용이하게하지 않는 조직 구조 내에서 임의의 혈관 분포를 초래합니다.

적재제(AM, 예: 3D 바이오프린팅)는 TE에 적합한 스캐폴드를 만들기 위해 생물학적 또는 생체 적합성 물질을 사용하여 3D 구성물의 제조에 점점 더 관여하고 있습니다. 아키텍처, 생화학 및 기능에서 기본 조직을 모방하는 스캐폴드를 생성하기 위해 여러 AM 접근법(예: 잉크 젯 및 미세 압출 기반 방법, 다양한 유형의 리소그래피 기술)을 병렬로 사용하고 개발되고 있습니다. . 개별 기술은 특정 장점과 단점^(28)을전시, 이는 다양한 변형이 탐구되는 이유입니다 (예를 들어, 마이크로 패터닝, 유도 혈관 형성 등) 크고 복잡하고 안정적인 혈관의 정도를 증가시키기 위해 네트워크는^22,29,30을조작 할 수 있습니다.

이 중, 압출 바이오 프린팅은 가장 일반적으로 사용되는 방법, 특히 호환 재료의 넓은 범위로 인해 (일반적으로 세포 친화적 인 공정^28,31,32)뿐만 아니라 뛰어난 다양성 응용 프로그램 용어 (예를 들어, 임베디드 및 희생 인쇄^23,33,중공 구조의 제작^34,35,등). 현재 연구에 대한 주요 과제는 2D에서 3D 구조로의 전달, 높은 공간 해상도의 중공 튜브의 조밀한 네트워크 형성, 세포 배양에서 유체 흐름 중 전반적인 기계적 무결성 및 형상 충실도 를 포함합니다. 조건³⁰.

이연성 조직에 대한 가장 간단한 접근 방식은 구성 내의 상호 연결된 채널 네트워크를 만드는 것입니다. 조직 스캐폴드 내에서 이러한 이난 성 채널의 생성은 폐기물을 제거하면서 즉시 영양분과 산소 확산을 허용하기 때문에 앞서 언급 한 많은 문제를 해결할 것으로 예상됩니다. 따라서, 컨스트럭트 내의 괴사 부위의 잠재적 형성은^36을피할 수 있다. 이러한 채널은 추가적으로 내피 세포(ECs)로 시드될 수 있고 3D 조직^{모델(37)에서}인공 혈관으로서 작용할 수 있다. 대부분의 기본 의미에서, 용기는 중공 채널, EC의 연층 및 뻣뻣한 쉘로 구성될 수 있습니다. 최근에는 압출용 동축 바늘을 활용한 코어/쉘 방식으로 두 개의 서로 다른 물질의 3D 압출이^38,39,40,41,제조가 가능하므로 많은 관심을 얻고 있다. 중공 튜브.

기존의 미세 압출 3D 프린팅과 마찬가지로 코어/쉘 프린팅은 동시 축 노즐(예: 동일한 축에 정렬된 다른 직경의 두 개의 바늘을 더 넓은 바늘이 더 좁은 축으로 둘러싸도록)으로 수행됩니다. 따라서, 두 물질을 동시에 압출할 수 있고, 하나는 중앙 필라멘트 또는 "내부" 코어로, 두 번째는 "외부"^{쉘(41)으로서}압출될 수 있다. 현재까지, 공동 축 바이오 프린팅은 고체^42,코어 / 쉘^43,중공 가닥^40,44와구조를 제작하는 데 활용되었습니다; 그러나 사용되는 재료는 인쇄 된 구조의 최적의 셀 생존 가능성과 기계적 견고성 모두에 최적화되지 않았습니다. 언급 한 바와 같이,이 기술은 생체 물질을 다른 기계적 특성과 결합 할 수있는 가능성을 제공하며, 이 경우 딱딱한 물질이 더 부드러운 것을 지원합니다. 더 중요한 것은, 스캐폴드 물질(예를 들어, 알긴산, 카르복시메틸 셀룰로오스)이 쉘로 압출되는 경우, 가교제(예를 들어, 염화칼슘)로 구성된 코어가 내부 모세관에서 분배된 후 인쇄 후 헹구는 경우, 단일 단계^45에서연속 중공 튜브를 제조 할 수 있습니다.

이를 염두에 두고 혈관 구조 및 기타 관 조직의 엔지니어링을 위해 잘 정의되고 이탕 가능한 스캐폴드를 구축하기 위해 간단하고 반복 가능한 한 단계 방법이 개발되었습니다. 비용 효율적인 기술을 개발하려면 제작이 단일 단계 프로세스여야 합니다. 따라서 코어/쉘 셋업을 3D 바이오프린터에 적용하여 통합했습니다. 기본 설계는 더 큰 직경의 두 번째 노즐이 배치되는 주입 중에 변형을 방지하기 위해 금속으로 만들어진 중앙 노즐로 구성됩니다. 이러한 공동 축 축 노즐 셋업은 압출 하이드로겔 채널의 두 흐름및 즉각적인 가교의 공동 압출을 허용한다. 이를 통해 다층 중공 필라멘트를 직접 제조할 수 있으며, 이후 고농도의 염화칼슘(CaCl_2)과가교하여 외부에서 보다 영구적인 안정화를 보장합니다.

따라서, 이 방법은 중공 하이드로겔 필라멘트가 3D 구성물의 기계적 무결성을 지원하고 동시에 내장 된 마이크로 채널로 작용하는 스캐폴드와 마이크로 채널의 동시 인쇄를 허용합니다. 세포 성장을위한 영양소. 이 프로토콜은 내장 채널하이드로겔 3D 구조가 중공 필라멘트를 생산하기 위해 가교를 제어하여 제조되는 맞춤형 공동 축 노즐의 사용을 기반으로 코어/쉘 3D 바이오프린팅 전략의 상세한 절차를 제공합니다. 세포 배양 중에 향수를 남기는.

이 작업에 사용되는 3D 프린팅 셋업은 Banović 및 Vihar^46에 의해 설명된 바와 같이 구성되며 세 가지 주요 구성 요소로 나눌 수 있습니다: A) X, Y 및 Z 방향에서 50 μm 위치 정확도를 가진 3축 CNC 기계식 셋업; B) 1.2 μL 복셀 분해능을 가진 일회용, 5 mL 루어 잠금 주사기에 적합한 2 개의 압출기; 및 C) 전자 및 소프트웨어를 제어합니다.

코어/쉘 인쇄를 용이하게 하기 위해 압출기(기본 압출기, 코어 인쇄) 중 하나에 장착할 수 있고 G27 무딘 엔드 니들과 호환되는 적절한 노즐이 개발되었습니다. 또한 두 번째 압출기(셸 인쇄)와 연결하는 루어 잠금 호환성이 있습니다. 첫 번째 프로토타입은 무딘 말단 G27 바늘(내경 = 210 μm, 외경 = 410 μm)을 G21 바늘(내경 = 510 μm, 외경 = 820 μm) 또는 G20 원근팁(내경 = 600 μm)에 삽입한 다음 이차 n을 삽입하여 제작하였다. 대목동을 통해 쉘 소재를 공급할 수 있습니다. 그러나, 바늘 샤프트의 약간의 굽힘으로 인해, 내부 및 외부 바늘의 동심 정렬노즐 팁을 생성 할 수 없습니다.

이 문제를 해결하기 위해, 새로운 노즐 설계는 다음과 같은 기준을 충족 고안되었다 : 1) 3 축 CNC 밀을 사용하여 제조 할 수 있습니다, 2) 다양한 재료 (PEEK 또는 금속과 같은 고성능 플라스틱)에서 제조 될 수있다, 3) 루어 잠금 호환성을 갖는다 쉘 소재를 적용하기 위한 4) G27 무딘 엔드 니들과 호환되며, 팁을 중앙 축에 맞추기 위해 두 위치에서 제자리에 보관합니다. 노즐 프로토타입의 회로도는 그림 1에나와 있습니다.

프로토콜

1. 하이드로겔 및 가교 용액 의 준비

1. 간단히, 활발하게 혼합하여, ALG 및 CMC 분말을 초순수에 용해시켜 총 3 wt% ALG 및 3 wt% CMC 용액을 얻었다.
   참고 :이 작품에서는 5 mL 주사기가 인쇄에 사용됩니다. 따라서 최종 재료의 양이 해당 볼륨으로 조정됩니다. 그러나 다른 압출 카트리지 및 인쇄된 샘플 크기의 경우 준비된 재료의 양을 그에 따라 배율조정해야 합니다.
2. ALG-CMC 혼합물에 1.5wt% 셀룰로오스 나노섬유를 첨가하여 인쇄에 적합한 원하는 점도에 도달하기 위해 기계적 보강을 추가합니다.
3. 오버헤드 믹서를 사용하여 하이드로겔 현탁액을 균질하게 킵니다.
   참고: 하이드로겔에는 섬유나 기포가 없어야 합니다.
4. 인쇄를 위한 1차 가교 솔루션으로 사용되는 초순수에 100mMMMMMMMMMSMS칼슘염화물(CaCl2) 용액을 준비합니다.
5. 스캐폴드 후처리시 보조 가교 용액으로 사용되는 초순수에 5wt.% CaCl₂ 용액 10mL를 준비합니다.
   참고 : 일반적으로, 즉각적인 화학 적 가교에 적합한 모든 하이드로 겔 제형은 중공 튜브의 한 단계 제조를 허용하고 코어 / 쉘 셋업이 유형과 함께 사용할 수 있습니다. 인쇄 및 가교 메커니즘은 그에 따라 최적화되어야 합니다. 하이드로겔의 점도는 원하는 조성물에 따라 달라질 수 있으며; 그러나, 중합체 농도 및 농축제(예를 들어, 나노섬유)의 첨가로 조절될 수 있다. 안정적인 구조물의 3D 프린팅에 이상적인 점도는 압출 필라멘트가 모양을 유지하고 스캐폴드가 가교 하기 전에 자체 중량을 보유할 수 있을 만큼 충분히 높습니다.

2. 이퍼블 스캐폴드의 코어/쉘 프린팅

1. 인쇄하기 전에 70% 에탄올을 철저히 분사하여 바이오 프린터를 살균하고 1시간 동안 UV 광에 노출시십시오.
2. 바이오 프린터를 켜고 3D 프린터와 함께 번들로 제공되는 제어 소프트웨어를 실행합니다.
3. 홈 아이콘을 눌러 호밍 절차를 수행합니다.
4. 도구 모음 명령 파일 사용 | G-Code 가져오기,생성된 스캐폴드 g-코드를 가져옵니다.
5. 하이드로겔을 멸균 5mL 주사기로 옮기고 3D 프린터의 압출기 마운트 중 하나에 놓습니다. 루어 잠금 장치와 짧은 튜브를 통해 코어/쉘 노즐의 측면 루어 입력에 연결합니다.
6. 가교 용액(100mM CaCl_2)을연결된 G27 무딘 엔드 바늘로 다른 멸균 5mL 주사기로 옮기고 코어/쉘 노즐의 상단 바늘 홀더에 삽입합니다. 내부 바늘은 외부 코어/쉘 노즐에서 약간 돌출(~1mm)해야 합니다. 정렬을 수동으로 조정합니다. 돌출 마운트에 두 번째 주사기를 삽입합니다.
7. 주사기를 마운트에 올바르게 삽입하려면(그림 2에표시된 설정) A 및 B 및 위쪽 및 아래쪽 화살표를 클릭하여 돌출 마운트를 수동으로 제어합니다.
8. 인쇄가 시작되기 전에 하이드로겔과 가교 용액을 별도로 압출하여 코어/쉘 노즐의 모든 여분의 기포를 제거하고 연속적인 하이드로겔 흐름을 보장합니다.
9. Z 및 위쪽 및 아래쪽 화살표를 사용하여 노즐과 인쇄 기판 사이의 거리를 수동으로 조정합니다. 접착력이 좋은 평평한 유리 인쇄 기판을 사용하는 것이 좋습니다. 압출 노즐은 하이드로겔의 중단 없는 흐름을 허용하기 위해 기판과 접촉해서는 안 됩니다. 노즐과 기판 사이의 최적 거리(층 높이)는 일반적으로 외부 노즐 직경의 폭과 동일하지만 사용되는 재료 및 개별 인쇄 매개변수에 맞게 조정됩니다. 개별 필요에 따라 시작 인쇄 높이를 조정합니다.
10. 재생 버튼을 눌러 인쇄 프로세스를 시작합니다.
    참고 : 실제 스캐폴드의 인쇄가 시작되기 전에 균일 한 중공 필라멘트의 부설을 보장하기 위해 스캐폴드를 둘러싼 스커트(그림 3)의인쇄를 포함하는 것이 좋습니다. 최적의 스캐폴드를 인쇄하려는 의도로 최적의 하이드로겔 흐름을 달성하려면 제형 조성, 가교 용액 조성물 및 인쇄 파라미터(즉, 인쇄 속도, 압출 압력, 인쇄 온도, 사이의 거리) 기판 및 압출 노즐 등).
11. 인쇄 후, 인쇄된 스캐폴드로 기판을 조심스럽게 제거하고 전체 스캐폴드에 걸쳐 이차 가교 용액(5 wt.% CaCl_2)을전체 스캐폴드에 부어 전체 스캐폴드에 걸쳐 가교를 보장한다. 실온(RT)에서 1분 동안 배양합니다.
    참고: 전체 스캐폴드가 가교 솔루션에 잠겨 있는지 확인합니다. 이 단계는 스캐폴드의 원하는 강도 특성을 달성하기 위해 중요하지만 사용되는 재료 및 가교 방법에 따라 달라질 수 있습니다.
12. 메스를 사용 하 여 수동으로 여분의 스커트 소재를 잘라.
13. 30 분 동안 자외선 아래에서 스캐폴드를 살균하십시오.
14. 조심스럽게 옆으로 부드럽게 당겨 기판에서 스캐폴드를 분리합니다. 스캐폴드가 기판에 강하게 부착되면 그 사이에 날카로운 모서리를 삽입하여 분리하십시오.
15. 무색 세포 배양 배지로 스캐폴드를 옮기십시오 (DMEM 5 wt.% FBS, 100 U/mL 페니실린 및 1 mg/mL 스트렙토마이신으로 보충), 적어도 24 시간 동안 5 wt.%_CO2를 함유한 대기에서 37°C에서 배양합니다.

3. 내피 세포 및 살아있는 / 죽은 분석 솔루션의 준비

1. 세포 배양을 위해, 페놀 레드첨가와 함께 고급 DMEM 세포 배양 배지를 준비하고 5 wt.% FBS 및 2 mML-글루타민으로 보충하였다. 100 U/mL 페니실린과 1 mg/mL 스트렙토마이신을 넣으세요.
2. 인간 배꼽 내피 세포(HUVEC) 라인을 개시하고 기재된 바와 같이 HUVEC 배양 프로토콜에 따라 이를^{통과한다(47).}
   참고: 아래에 설명된 바와 같이 세포를 백색 반투명 스캐폴드로 주입하는 동안 간단한 시각화를 위해 페놀레드를 첨가한 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 것이 좋습니다.
3. 세포 계수의 경우, 피펫 100 μL의 세포 배양 배지에 부유하고 0.1 wt.% 트라이판 블루 용액의 900 μL로 염색하였다.
4. 자동 셀 카운터 또는 수동 혈독계를 사용하여 서스펜션의 예상 셀 수를 계산하고 얻을 수 있습니다.
5. 살아있는/죽은 분석의 경우 멸균 PBS에서 4 mMCalcein-AM 및 2 mM 프로피듐 요오드화물용용을 준비합니다.
   참고 : 라이브 / 죽은 솔루션은 분석법을 수행하기 전에 직접 준비해야합니다.

4. 세포를 스캐폴드로 옮기기

1. 세포 배양 배지에서 스캐폴드를 제거하고 충분히 큰 유리 페트리 접시로 옮김.
2. 스캐폴드에 세포를 주입하기 직전에, 0.25 wt.% 트립신에 의한 치료를 사용하여 플라스크에서 HUVECs를 해리한다.
   1. 간략하게, 세포 배양 배지를 처분하고 37°C에서 5분 동안 0.25 wtt.% 트립신(~2 mL)으로 세포를 배양하였다.
   2. 배양 후 트립시니화된 세포에 ~3 mL의 세포 배양 배지를 추가하고 모든 분리된 세포를 원심분리관으로 옮김을 전달한다.
   3. 세포를 200 x g에서 5 분 동안 원심 분리하고 상한체를 폐기하십시오.
   4. 신선한 세포 배양 배지에서 세포를 다시 중단합니다.
3. 앞서 설명한 대로 셀을 계산합니다. 개인의 필요에 따라 총 세포 농도를 조절합니다. 이 작품에서는 340,000 세포 / mL의 시작 농도가 사용됩니다.
4. 부착 된 무딘 G27 바늘로 멸균 주사기에 세포를 다시 일시 중단.
5. 진입점을 찾아 스캐폴드에 세포를 조심스럽게 주입하십시오. 반투명 스캐폴드를 통한 세포 현탁액 흐름이 표시되어야 한다. 전체 스캐폴드가 셀 서스펜션으로 채워지도록 하십시오.
6. 세포 배양 배지에 스캐폴드를 침수시키고 최대 10일 동안 5 wt.%_CO2를 함유하는 대기에서 37°C에서 배양한다.
7. 실험적 필요에 따라 세포 배양 배지를 보충한다.

5. 라이브 / 죽은 분석 및 세포 이미징

1. 배양 후 PBS로 스캐폴드를 헹구고 있습니다.
2. 무딘 엔드 바늘로 이전에 준비된 라이브/데드 솔루션(PBS에서 4mMM calcein-AM 및 2 mMM 프로피듐 요오드화물)을 스캐폴드에 조심스럽게 주입하고 37°C에서 30분 동안 PBS로 배양합니다. 솔루션이 전체 스캐폴드의 길이를 통해 흐르는지 확인합니다.
3. PBS로 스캐폴드를 헹구고 있습니다.
4. 조심스럽게 유리 슬라이드에 스캐폴드를 전송합니다.
5. 형광 현미경의 밑에 스캐폴드에서 직접 염색된 세포를 관찰하십시오.
   참고: 생존 가능한 세포는 녹색 형광을 생성하고 죽은 세포는 적색 형광 광을 방출합니다.

결과

이 작업의 목적은 목재 파일 구조의 코어/쉘 인쇄를 위한 루어 호환성을 갖춘 제조하기 쉬운 코어/쉘 노즐을 개발하는 것이었습니다. 또한 간단하고 반복 가능한 원스텝 프린팅 프로토콜이 설명되었으며, 이는 수정이 간단하고 광범위한 재료와 다양한 화학 적 가교 메커니즘을 수용하여 잘 정의되고 이연성 스캐폴드를 구축할 수 있습니다. 혈관 및 기타 관 조직 구조의 엔지니어링.

코어/쉘 노즐
노즐은 G27 무딘 엔드 바늘(내부 축 필라멘트 인쇄용)과 노즐 본체로 구성되며, 이 노즐 본체는 바늘을 제자리에 놓고 재료 입력을 위한 연결 포트가 있는 쉘 필라멘트의 외부 노즐을 만듭니다. 도식은 그림 1에나와 있습니다. 개별 압출기에 배치하고 코어 및 쉘 재료를 제공하는 두 개의 5 mL 주사기. 튜빙은 노즐 본체와 주사기를 연결하여 쉘 소재를 제공합니다.

코어/쉘 노즐 및 주사기 셋업의 전체 조립체는 그림 2에나와 있습니다. 노즐 본체의 첫 번째 기능성 프로토타입은 CNC 밀링 폴리옥시메틸렌(POM)의 블록을 제조하였다. 요소 간의 호환성 및 밀봉, G27 바늘과 튜브는 Vitaprint에 설치하여 테스트되었습니다. 노즐, 루어 잠금 커넥터 또는 본체와 바늘 사이에 쉘 재료가 누출되지 않았습니다. 노즐 본체는 바늘 허브(luer 커넥터)와 긴밀하게 맞으며 압출기와 전체 노즐의 동기화된 모션을 보장합니다.

스캐폴드 빌딩
스캐폴드 제작에 대한 가장 간단한 방법은 인쇄 방향이 모든 연속 층(일반적으로 90°)의 각도로 변경되는 레이어별로 재료 층을 증착하는 것입니다. 하이드로겔의 점도및 흡습성 특성으로 인해 인쇄된 구조물의 형상 충실도를 유지하는 것은 여전히 어려운 일입니다. 이 프로토콜 섹션의 주요 목적은 이전에 셀룰로오스 나노 섬유 (NFC)의 추가와 함께 스캐폴드 건물 (ALG 및 CMC)에 대한 유망한 결과를 보여 주었다 두 개의 폴리머를 사용하여 이과 코어 / 쉘 스캐폴드의 3D 프린팅입니다 기계적 안정성. ALG와 CMC는 모두 음전하, 수용성 선형^{공중합체(48)이며} 둘 다 카르복실 기를 함유하고 있으며, 이는 이원양이첨가된 것과 상호 연결될 수 있다. ^Ca2+ 입자는 두 가지 작용기와 동시에 이온 결합을 형성하여 폴리머 사슬 간의 연결을 형성하여 겔 강성을 증가시고 있습니다.

이향수 스캐폴드 인쇄
이 프로세스의 목적은 여러 층에 걸쳐 완전히 가교될 때까지 자신의 모양 충실도뿐만 아니라 향수를 유지 3D 인쇄 간단한 나무 더미 비계 구조입니다. 이를 위해서는 크로스오버 나 후퇴 움직임없이 코어와 쉘의 코압이 필요하므로 흐름을 방해 할 수 있습니다. 따라서 일반적인 CAD 모델링 및 슬라이싱 방법은 적합하지 않습니다. 이 작업에서는 수동으로 설계된 g-코드가 사용되고 빠른 g-코드 준비를 위해 파이썬 기반 g-코드 생성기가 개발되었습니다.

비계는 나무 더미 격자 모양으로 구조화되고 평평한 유리 표면에 지어졌습니다. 제작은 레이어별로 수행되어 각 후속 레이어의 교차선을 이전 층으로 90° 각도로 증착했습니다. 또한, 각 후속 층은 X 및 Y 방향에서 2% 더 좁아졌으며, 선행 레이어에 의한 지속적인 필라멘트 지지도를 보장합니다. 필라멘트(매크로포어 크기) 사이의 거리는 압출 필라멘트(0.8 mm)의 외지와 그리드라인(3mm) 사이의 거리를 고려하여 g-code에서 정밀하게 설계될 수 있다.

스캐폴드는 추가 고려를 위해 주요 포함 기준을 충족해야 했습니다. 첫째, 4개 이상의 층이 있는 스캐폴드는 인쇄 중에 구조적 무결성과 형상(예: 매크로포어 크기)을 유지하여 추가 개발을 위해 필요했습니다. 둘째, 스캐폴드는 37°C에서 세포 배양 배지에서 7일 동안 배양된 후에도 투과성(stable 마이크로채널)을 유지해야 하였다. 적절한 시간 간격(1, 2, 5 및 7일)에서 스캐폴드는 배양 배지에서 꺼내어 여전히 향수를 부리고 있는지 확인하기 위해 테스트했습니다. 그림 4A에서새로 인쇄되고 후처리된 스캐폴드의 단면은 필라멘트 내부에 선명하게 보이는 중공 채널을 표시합니다. 도 4B에서,37°C에서 세포 배양 배지에서 72시간 배양후에도 필라멘트는 전체 스캐폴드 길이를 통해 중공 구조를 유지하는 것이 분명하다.

여러 제형은 인쇄 가능하고, 구조적으로 안정되고, 인쇄된 형상을 보존하고, 향수를 부리고; 그러나, 추가 테스트를 위해 하나의 하나를 선택했다 (즉, 3 wt.% ALG + 3 wt.% CMC + 1.5 wt.% NFC), 최대 10 층과 이연성 스캐폴드의 인쇄를 허용. 사용자 지정 노즐이 있는 인쇄 프로세스는 그림 5A에표시됩니다. 코어/쉘 인쇄는 점성이 적은 제형으로 가능했습니다. 그러나, 더 높은 농도를 가진 젤은 노즐을 통해 연속적인 교류를 허용하지 않았습니다. 1차 가교(코어 재료, 인쇄 시 전달)의 경우 100 mM CaCl_2가 활용되었고, 이는 노즐 내의 겔 응고를 일으키지 않고 중공 필라멘트의 연속형성을 적절히 안정화시켰다. 포스트 프린팅, 스캐폴드는 5 wt.% CaCl₂ 용액에 담가 하이드로겔을 완전히 가교하여 장기적인 형상 충실도를 유지하였다. 완성된 스캐폴드 샘플은 그림 5B에그림으로 되어 있습니다. 최적화 동안, 제형의 공정은 인공 염료를 코어 용액에 사용하였고, 압출 필라멘트의 품질을 시각적으로 평가하고 조사할 수 있도록 하였다. 염료는 세포 파종 및 재배를 위해 제조된 최종 스캐폴드의 제조에 사용되지 않았다.

라이브/죽은 분석
배양 후, 살아있는/죽은 분석기를 사용하여 EC를 시각화하고 인큐베이션된 스캐폴드 내의 살아있는(녹색) 및 죽은(적색) 세포를 구별하는 데 사용되었다. 이는 두 가지 주요 목적인 A) 스캐폴드가 세포에 유해한 영향을 주지 않으면서 성장과 접착을 촉진하는 생체 적합성 환경을 제공하는지 여부를 결정하고, B) 관형 구조의 구조적 무결성을 시각화하고, 내부 채널 시스템을 보다 자세하게 설명합니다.

라이브/죽은 분석의 결과는 그림 6에나와 있습니다. 세포내 에스테르제의 존재에서, 혈장 막 투과성 Calcein-AM은 살아있는 세포에서 녹색 형광광광광을 방출하는 Calcein으로 변환됩니다. 한편, 세포사멸 세포는 DNA 이중 나선에 인터칼화될 때 적색으로 형광되는 막 불투과성 프로피듐 요오드화물에 의해 가시화된다. 중공 채널 내부의 세포를 시각화하는 데 도움이 되는 라이브/죽은 이미지와 스캐폴드의 밝은 필드 사진이 결합되었습니다. 염색용액을 주입하고, 48시간 동안 스캐폴드-세포 배양 후 3D 프린팅 스캐폴드에서 직접 분석법을 수행시켰다.

이 연구는 이퍼퍼블 스캐폴드의 코어/쉘 프린팅을 위한 개념 증명으로만 사용되었기 때문에 상대적으로 작은 종자 밀도(340,000셀/mL)가 사용되었다는 점에 유의해야 합니다. 살아있는/죽은 분석의 가장 중요한 결론은 48 시간 후에도 죽은 세포 (빨간색)가 관찰되지 않았으며 스캐폴드 물질 자체도 독성 효과를 나타내지 않았다는 것을 증명한다는 것입니다. 또한, ECs는 실제로 고착하고 비계 내부에 부착 된 남아 있었고 채널 내부에서 성장 할 때 고르게 분산 된 응집체를 형성하는 것처럼 보였습니다. 이는 기재된 제조 방법 및 스캐폴드 제형이 생체 내, 관련, 관상 조직 형태에 대한 건물에 적합한 프레임워크를 제공한다는 것을 시사한다. 세포-ECM 상호 작용 및 모든 3 개의 공간 차원에서 꽉 세포 세포 통신을 모방 외, 복잡 한 조직 공학 또한 그들의 생존을 유지 하기 위해 신선한 매체에 지속적인 세포 노출필요. 이것은 차례로 연속 관류의 밑에 조밀한 채널 네트워크에 의해 달성될 수 있습니다, 이는 미래 작업에 있는 추가 조사를 보증하고, 혈관구조의 장기 조직 공학을 촉진하기 위하여 물질과 성장 매개변수를 최적화하는 것을 요구할 것입니다.

그림 1: 코어/쉘 노즐 프로토타입. (A) 노즐 본체 프로토타입의 전체 적인 디자인과 주요 구성 요소가 표시됩니다. 노즐은 상단을 통해 무딘 엔드 G27 바늘을 삽입하여 완료됩니다. 상단 및 하단 바늘 홀더는 노즐 축으로 바늘을 고정하고 재정렬하여 팁이 노즐에서 중앙으로 확장되도록 합니다.  노즐을 보조 주사기에서 압출된 "쉘" 재료와 연결하려면 루어 잠금 커넥터가 있는 튜브가 측면 입력에 부착됩니다. 여기에서 재료는 좁은 채널을 통해 노즐로 전달됩니다. 언급 된 채널의 제조는 제조 후 캡이 필요한 구멍을 생산, 두 위치에서 드릴링이 필요합니다. (B) 노즐이 삽입된 G27 바늘로 노즐을 클로즈업하여 노즐밖으로 확장합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 최종 코어/쉘 설정. (A) 표시는 하이드로겔(오른쪽)을 포함하는 올바르게 부착된 주사기를 가진 완성된 코어/쉘 노즐이며, "쉘"을 구축하고 가교 용액(왼쪽)을 "코어"로 압출한다. (B) 두 개의 압출기와 Vitaprint 시스템에 설치된 코어/쉘 설정입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 관 형 스캐폴드의 G 코드. 여기서 프린터 소프트웨어의 스크린샷이 도시되고, 특히 경로미리보기(A)및 제1층(B)의원시 g-코드가 도시된다. g-code는 절대 공간 방향(X, Y, Z)의 대상 좌표와 상대 방향으로돌출(A,B)이 있는 명령 집합입니다. G 명령은 명령 유형을 결정하는 반면 G1은 대상 좌표를 향한 선형 이동을 나타내고 G92는 초기 시작 위치를 결정합니다. 또한 다음 명령의 이송 속도는 명령 F(mm/min)로 결정됩니다.

그림 4: 속이 빈 내부가 있는 스캐폴드 가닥의 단면. (A) 도시된 것은 새로 인쇄되고 후가공된 스캐폴드의 단면 슬라이스이다. (B) 72시간 동안 세포 배양 배지에서 배양된 후 스캐폴드의 단면 슬라이스를 나타내고 있다. 노즐 모양은 둥근 단면을 가진 튜브의 압출을 정의하는 반면, 필라멘트는 증착시 다소 평평해 보이는 것처럼 보입니다. 그러나 내부 채널은 그대로 유지되고 인큐베이션 중에 형태를 유지합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 스캐폴드의 코어/쉘 인쇄. 여기서,제조(A)의3층 중공관 스캐폴드와 최종형태(B)가도시된다. 개선된 시각화를 위해 코어의 가교 용액을 적색 염료로 염색했습니다. 제형은 두꺼운 구조 (최대 10 층, 도시되지 않은 데이터)가 제작되더라도 스캐폴드 안정성을 유지하기에 충분한 기계적 안정성을 나타낸다. 최종 구조의 외부 치수는 약 27mm x 27mm x 3.5mm였습니다.

그림 6: 스캐폴드에서 직접 수행된 라이브/죽은 분석. HUVECs의 현탁액을 내부 스캐폴드 채널에 주입하고, 48 시간 동안 배양하고, 살아있는 /죽은 염료로 처리하였다. 실행 가능한 HUVECs는 이미지의 밝은 반점에 표현되는 녹색 형광광광을 방출합니다. 죽은 세포는 녹색 형광광광을 방출; 그러나 관찰된 스캐폴드에는 아무도 표시되지 않습니다. 세포의 분포는 또한 채널의 모양과 유지 관류 기능을 의미합니다. 사소한 정도에, 살아있는/죽은 분석 해결책은 또한 현미경의 밑에 가벼운 형광을 생성하는 비계 물자를 얼룩지게 했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

노즐 디자인
개발된 코어/쉘 노즐을 사용하여 2압출기 Vitaprint 시스템에 통합된 중공, 관형 스캐폴드는 단일 공정으로 제작되었습니다. 준비된 대부분의 스캐폴드를 통해 튜브 벽의 균일한 두께를 달성하려면 바늘을 외부 압출 링의 축에 중앙에 배치해야 합니다. 표준 게이지 바늘은 종종 축에서 약간, 그러나 중요한 편심을 나타낸다. 따라서, 노즐 본체는 바늘을 두 곳에 고정하도록 설계되었으며, 상단에 한 번(허브 고정) 및 최종 코어/쉘 챔버(캐뉼라 자체를 고정)하기 전에 한 번, 축 정렬을 보정하도록 설계되었습니다. 축 선형의 정밀도는 고정점 사이의 거리에 따라 증가합니다. 그러나 바늘 길이와 사용 가능한 노즐 챔버 볼륨 사이에는 장단점이 있습니다. 설정의 기능을 더욱 향상시키기 위해, 노즐의 특정 수정을 구현할 수 있습니다: A) 향상된 안정성을 갖춘 노즐 마운트, B) 더 넓은 범위의 바늘 호환성을 위한 추가 노즐, C) 바늘을 위한 정밀한 조정 메커니즘 노즐 포지셔닝 및 D) 플라이 재료 준비를 위한 추가 입력 및 미세 유체 장치를 통합합니다.

하이드로겔 최적화
최적의 ALG:CMC 비율을 결정하기 위해 여러 재료 반복을 평가했습니다. 일반적으로 두 구성 요소의 농도가 3wt.% 이상인 코어/쉘 인쇄는 연속적인 하이드로겔 흐름을 허용하지 않거나 노즐의 막힘이 발생했기 때문에 불가능하게 렌더링되었습니다. 특히, 3wt.% 이상의 ALG 농도는 점도를 과도하게 증가시키고 노즐 막힘을 초래한 반면, 낮은 ALG 농도와 높은 CMC(>3 wt.%) 농도는 교차 연결 시간을 늦추어 충분한 공급에 실패했습니다. 비계의 구조적 지지. 코어/쉘 인쇄는 점성이 적은 제형으로 가능했습니다. 그러나 압출 된 겔 점도는 장기적인 형상 충실도를 유지하기에 충분해야합니다. 결국, 1:1 ALG:CMC 비율은 Maver et al.^49에의한 이전 연구를 확인하는 가장 적합한 선택인 것으로 입증되었습니다. NFC의 추가는 코어/쉘 인쇄 스캐폴드의 인쇄 성 및 구조적 강성을 크게 향상했지만 재료의 가교 특성에는 큰 영향을 미치지 않았습니다.

특정 세포 유형 및 실험 설정에 최적화된 맞춤형 애플리케이션에는 조성 및 가교 메커니즘이 다를 수 있는 잘 맞춤화된 스캐폴딩 재료가 필요합니다. 이 작업에 설명된 방법은^Ca2+ 이온을 사용하여 이온적으로 가교되는 알긴산-셀룰로오스 혼합 중합체 용액을 기반으로 합니다. 알긴산 자체는 (1,4)-연결된 β-d-mannuronate (M) 및 α-l-guluronate (G) 잔기의 선형 중합체로, Ca^{2+ 및} Sr 2+ 및 Sr 2+ 및Sr²⁺및 기타 divalent 양이온을 적용하여 가역적으로 상호 연결될 수 있습니다. ²⁺. 그럼에도 불구하고, 알긴산의 가교에 가장 널리 사용되는 이온은_CaCl2의 형태로 Ca^{2 +로} 남아 있습니다. ^Ca2+는 또한 CaSO₄ 또는 CaCO_3의형태로 사용될 수 있다; 그러나, CaCL_2에 상대적인 CaSO_4의 낮은 용해도는 느린 겔화를 의미한다. CaCO_3은 더 느린 겔화 시간을 생성하여 기계적 특성이 약하고 일관되지 않게 될 수 있습니다.

더 긴 겔화 시간은 전형적으로 더 균일한 구화를 생성하지만, 코어/쉘 프린팅과 같은 특정 애플리케이션은 빠른 겔화 속도^50을필요로 한다. Mg²⁺ 이온은 또한 겔화를 유도; 그러나, 그들의 가교 효율은 Ca^{2 +에}비해 약 5x-10배 낮으며, 2-3 시간의 가교 시간이 있습니다. 또한, 마그네슘 이온은 guluronic 단위쪽으로 더 선택적이며, 따라서 가교는 ALG^51의화학 조성에 더 의존한다. 이 경우, 빠른 겔화 속도는 중공 구조가 붕괴되기 전에 연속적인 중공 채널 형성을 보장하는 데 필수적이다. CaCl_2는 중공 필라멘트의 직접 증착에 매우 중요한 가장 빠른 겔화 속도를 산출합니다. 100 mM CaCl_2를 활용하였고, 이는 노즐 내의 겔 응고를 일으키지 않고 중공 필라멘트의 연속형성을 적절히 안정화시켰습니다.

스캐폴드 인쇄 및 후처리
다음 단계는 1) 3D 바이오 프린터를 포함한 모든 솔루션 및 재료가 인쇄 전에 적절하게 멸균되도록 하는 과정을 포함하여 이 부분에서 고려해야 합니다. 2) 하이드로겔을 제조할 때, 재료의 균질성은 연속 인쇄에 매우 중요합니다. 노즐을 막거나 압출을 방해할 수 있기 때문에 불순물이나 기포의 도입은 피해야 합니다. 3) 주사기는 루어 잠금 메커니즘을 통해 코어 / 쉘 노즐에 올바르게 연결되어야하며 그림2A,B에서볼 수 있듯이 압출기 마운트에 올바르게 삽입해야합니다. 4) 복잡한 구조를 인쇄하기 전에, 코어 / 쉘 노즐의 과잉 기포를 지우고 연속 하이드로 겔 흐름을 보장하기 위해 젤 및 가교 용액의 작은 부분을 미리 압출하는 것이 좋습니다. 이는 반복성을 향상시키기 위해 g-코드에 직접 통합될 수 있습니다. 5) 스캐폴드 자체의 인쇄가 시작되기 전에 균일 한 중공 필라멘트의 누워 있는지 확인하기 위해 스캐폴드를 둘러싼 치마를 추가하는 것이 도움이됩니다.

또한, 6) 인쇄 필라멘트와 기판 사이의 접착력을 향상시키기 위해, 착한 밀착력이 좋은 평평한 표면(즉, 유리 슬라이드 또는 페트리 접시)을 사용하는 것이 좋습니다. 7) 압출 노즐은 하이드로겔의 중단 없는 흐름을 허용하기 위해 기판과 직접 접촉해서는 안됩니다. 초기 거리는 인쇄 품질에 큰 영향을 미치지만 압출 필라멘트의 두께는 초기 설정의 좋은 근사치입니다. 8) g-코드의 시작 인쇄 높이는 개별 요구에 따라 조정되어야합니다. 인쇄 파라미터가 최적화된 후 스캐폴드 g-코드를 플래닛 CNC 소프트웨어로 가져와야 하며 프로토콜에 설명된 대로 인쇄 프로세스가 시작됩니다. 9) 최적의 스캐폴드를 인쇄하려는 의도로 하이드로겔 흐름을 제어하고 최적화하려면 제형 조성 및 인쇄 파라미터가 모두 변화되어야 합니다(즉, 인쇄 속도, 압출 압력, 인쇄 온도, 기판 사이의 거리 및 압출 노즐, 층 높이, 스캐폴드 크기 등).

일반적으로 점도가 높은 제형을 인쇄하려면 유량이 더 높습니다. 언급했듯이, 즉각적인 화학 적 가교에 적합한 모든 하이드로겔 제형은 중공 튜브의 1 단계 제조를 허용하고 설명 된 코어 / 쉘 설정과 함께 사용될 수 있습니다. 인쇄 및 가교 메커니즘은 그에 따라 최적화되어야 합니다. 인쇄 후, 모든 스캐폴드는 5wt.% CaCl₂ 용액과 보조 가교하여 후처리되었으며, 이는 ALG-CMC 성분의 완전한 교차 연결을 보장하고 UV 광 하에서 양쪽에서 적어도 30분 동안 살균했습니다. 가교 용액으로 스캐폴드를 완전히 삼키고 가교 공정을 완료할 수 있을 만큼 오랫동안 배양해야 합니다. 후처리는 사용되는 재료 및 가교 메커니즘에 따라 다르며 사전에 고려해야 합니다. 후처리 후, 스캐폴드는 기판으로부터 조심스럽게 제거하고, 세포 배양 배지로 옮겨지고, 세포 파종 전에 적어도 24시간 동안 조절된 분위기에서 배양되어야 한다. 무색 배지를 사용하여 스캐폴드에 주입하는 동안 세포 현탁액의 가시성을 향상시킬 것이다.

라이브/죽은 분석
살아있는 /죽은 해결책은 표백하기 쉬운 형광 염료를 포함하기 때문에, 분석실험을 실시하기 전에 어둠 속에서 직접 준비하고 유지되어야 합니다. 원하는 배양 시간 후, 세포 배양 배지는 스캐폴드 를 둘러싸는 조심스럽게 폐기하고 PBS로 헹구어야 한다. 이상적으로, 동일한 진입점은 비계에 주입되는 살아있는/죽은 분석에 선행된 세포 파종을 위해 이용되어야 합니다.

결과의 중요성
ALG와 CMC는 이미 시험관 내에서 혈관 신생을 촉진하는 데 사용되었습니다. ECM-모방 기능, 물리적 교차 연결 및 생체 적합성을 기반으로 ALG는 혈관 신생 성장 인자(예: bFGF, HGF, VEGF164 및 Ang-1*)의 전달 및 제어 방출을 위한 구성 요소로 일반적으로 사용되어 왔습니다^{52 ,53,54}. 더욱이, 젤라틴과 조합하여, CMC는 또한 생리적 조건 하에서 급속히 가교 기능으로 인해 혈관 내피 세포를 캡슐화하는 데 사용되어^{왔다 55.} NFC는 스캐폴드의 기계적 안정성 및 형상 충실도를 더욱 높이기 위해 첨가되었다. 혈관 을 강화하는 것이 아니라 코어 / 쉘 방식으로 인쇄 된 이연성, 중공 ALG-CMC 스캐폴드를 생성 할 수있는 가능성을 보여주기 위한 것이 목표였으며, 이는 또한 혈관의 부착과 확산을 용이하게합니다. 휴브. ALG-CMC 혼합물을 사용하는 선택은 중공 채널의 코어/쉘 프린팅을 가능하게 할 수 있는 일반적으로 사용되고 쉽게 접근할 수 있고 생체 적합성이 있는 기재의 연구 결과에 기반을 두었습니다. 다른 많은 물질은 혈관 신생을 향상시키기위한 더 실행 가능한 옵션이 될 수 있습니다; 그러나 일부는 이 접근 방식에서 중요한 신속한 겔화/가교 를 용이하게 하지 않기 때문에 코어/쉘 인쇄에 적합하지 않습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alginic acid sodium salt	Sigma-Aldrich (Germany)	180947	powder; Mw ~80,000
ATTC HUV-EC-C [HUVEC]	LGC Standards (UK)	ATCC-CRL-1730	Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) and unidentified factors from bovine pituitary, hypothalamus or whole brain extracts are mitogenic for this line; the cells have a life expectancy of 50 to 60 population doublings.
Axiovert 40 inverted optical microscope	Carl Zeiss Microscopy GmbH (Germany)		three contrastingtechniques in one objective – e.g. brightfield,phase contrast and PlasDIC
Calcium chloride	Sigma-Aldrich (Germany)	C1016	anhydrou; granular; ≤7.0 mm; ≥93.0%
Cellulose nanofibrils suspension (NFC, 3% (w/v))	The Process Development Center, University of Maine (Maine, USA)		nominal fiber width of 50 nm; lengths of up to several hundred microns
ELGA Purelab water purification system	Veolia Water Technologies (UK)
EVOS FL Cell Imaging System	ThermoFisher Scientific Inc. (Germany)	AMF4300	a fully integrated, digital, inverted imaging system for four-color fluorescence and transmitted-light applications
Gibco Advanced Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Advance DMEM)	ThermoFisher Scientific Inc. (Germany)	12491015	high glucose; no glutamine; phenol red
Gibco Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	ThermoFisher Scientific Inc. (Germany)	21063029	high glucose; L-glutamine; HEPES; no phenol red
Gibco Fetal Bovine Serum (FBS), qualified	ThermoFisher Scientific Inc. (Germany)	10270106	FBS origin: Brazil; 5 % (w/v) FBS
Hypodermic Sterican needle	B. Braun Melsungen AG (Germany)	9180117	0.40 x 25mm, 27G x 1''
L-glutamine	Sigma-Aldrich (Germany)	G3126	ReagentPlus®, ≥99% (HPLC)
Live/Dead Cell Double Staining Kit	Sigma-Aldrich (Germany)	4511	contains calcein-AM and propidium iodide (PI) solutions; suitable for fluorescence
Nunc EasYFlask cell culture flasks	ThermoFisher Scientific Inc. (Germany)	156367	Nunclon Delta certified for monolayer formation, cloning efficiency, non-cytotoxic, non-pyrogenic, and sterility; filter caps; culture area of 25 cm2
Omnifix syringe	B. Braun Melsungen AG (Germany)	4617053V	5 mL Luer Lock
Penicillin G sodium salt	Sigma-Aldrich (Germany)	P3032	powder; BioReagent; suitable for cell culture
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich (Germany)	P4417	tablet; one tablet dissolved in 200 mL of deionized water yields 0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4, at 25 °C
Sodium carboxymethyl cellulose	Sigma-Aldrich (Germany)	419338	powder; average Mw ~700,000
Streptomycin sulfate salt	Sigma-Aldrich (Germany)	S9137	powder; BioReagent; suitable for cell culture
Ultra-pure water	Veolia Water Technologies (UK)		18.2 m? cm at 25?C
VitaPrint 3D bio-printer	IRNAS (Slovenia)