실시간 관찰을 위한 미세 유체 진화 가속기에 암 인구에 걸쳐 이기종 약물 그라데이션의 생성

요약

우리는 단일 세포에서 잘 정의 된 환경 조건 내에서 암 역학의 장기 실시간 정량 적 연구를위한 제어 가능한 플랫폼을 제공하는 미세 유체 암 온 칩 모델인 "Evolution Accelerator" 기술을 제시합니다. 수준. 이 기술은 근본적인 연구 또는 전임상 신약 개발을 위한 시험관 내 모델로 작동할 것으로 예상됩니다.

초록

기존의 세포 배양은 암에서 임상 결과를 예측하는 입증된 제한된 능력에도 불구하고 가장 자주 사용되는 전임상 모델로 남아 있습니다. 미세 유체 암 온 칩 모델은 지나치게 단순화된 기존의 2D 배양과 보다 복잡한 동물 모델 사이의 격차를 해소하기 위해 제안되었으며, 이는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 정량적 결과를 생성하는 능력이 제한적입니다. 여기에서, 우리는 포괄적인 방식으로 복잡한 종양 미세 환경의 중요한 분대를 재현하는 microfluidic 암 온 칩 모형을 제시하고, 그러나 암 역학의 강력한 양적 설명을 제공하기 위하여 충분히 간단합니다. 이 미세 유체 암 온 칩 모델, "진화 가속기," 이질적인 화학 요법 스트레스 풍경을 생성 하는 동안 종양 미세 환경의 상호 연결 된 배열으로 암 세포의 큰 인구를 분해. 약물 구배에 반응하는 암의 진행 및 진화 역학은 몇 주 동안 실시간으로 모니터링할 수 있으며, 수많은 다운스트림 실험은 실험 과정을 통해 촬영된 시간 경과 이미지에 상보적으로 수행될 수 있다.

서문

암은 돌연변이 된 세포 집단의 지속적인 dysregulation뿐만 아니라 암세포와 숙주 미세 환경 사이의 중요한 상호 작용에 의존하는 복잡한 생태계로 점점 인식되고 있습니다. 이러한 의미에서, 암은 다양한 숙주 세포와의 이기종 종양 미세 환경 및 누화를 포함한 요인의 조합에 의해 나타나는 적응형 풍경에서 진화하며, 이 모두는 추가 유전적 또는 또는 후성 유전학 변경^1,2,3. 고형 종양의 맥락에서, 화학요법 및 그밖 자원 구배의 고르지 않은 분포는 그들의 분자 이질성에 기여하고 약 저항의 발달에 있는 역할을 할 수 있습니다, 특정 종양에 증가한 혈관 신생 하위 인구, 심지어 전이^4,5,6. 기존의 시험관 내 2D 세포 배양 연구는 대규모의 편리한 실험 능력을 유지하면서 평균 필드, 균일 및 고정 조건을 제공하며, 종종 진정으로 필요한 정확한 공간 및 시간적 환경 제어가 부족합니다. 생체 내 종양 역학에 에뮬레이트합니다. 따라서, 역학 적 스트레스 내에서 약물에 대한 반응뿐만 아니라 암 진행의 더 나은 예측을 위해 약물 개발 파이프 라인에서 동물 모델 이전에 종양 미세 환경을 재현하는 보다 대표적인 ex vivo 모델에 대한 필요성이 있다. 풍경. 미세유체학은 제어 가능한 정량적^연구를지원하지 못할 수 있는 2D 세포 배양 연구와 보다 복잡한 생체내 동물 연구 사이의 격차를 해소하기 위해^7,8,9로제안되었다.

암 세포 역학을 특성화하는 이상적인 시험관 내 시스템은 종양에서 일어날 수 있는 적응형 세포 반응을 모방하는 이기종 미세 환경을 생성할 수 있을 뿐만 아니라 이러한 역학의 관찰을 허용해야 합니다. 단일 셀 해상도. 이 기사에서는, 우리는 미세 유체 세포 배양 플랫폼, "진화 가속기"라는 PDMS 기반 장치를 설명 (EA), 즉 세포 해상도에서 암 세포 역학의 병렬 체외 연구를 허용 하는 실시간 데이터 수집 몇 주 동안, 문화 풍경에 걸쳐 스트레스의 그라데이션을 안정적으로 유지하면서. 이 플랫폼의 디자인은 메타 인구에서 유기체의 진화 역학을^10,11가속화 할 수있는 우리의 이전 작업을 기반으로합니다. 특히, 공간적으로 분리된 집단의 그룹에서 어느 정도 상호작용하는 이질적인 응력 풍경에 노출될 때, 가장 적합한 종은 큰 균일한 집단에 비해 지역 집단에서 더 빨리 지배할 수 있다. 유리한 종은 자원과 공간을 찾기 위해 이웃 의 미생물 서식지로 이동하고, 결국 전체 인구를 지배. 도 1에도시된 바와 같이, 미세유체 EA 칩의 패턴은 (i) 한 쌍의 서펜타인 채널로 구성되어 신선한 배지 순환을 제공하고 화학적 확산을 위한 고정 경계 조건을 구성하고, (ii) 육각형 세포 배양 영역을 구성한다. 109 개의 상호 연결된 육각형 과 24 개의 반 육각 형 챔버가 중앙에 들어 있으며 벌집 구조를 닮았습니다. 칩의 깊이는 100 μm입니다. 미디어 채널 및 세포 배양 영역은 작은 슬릿 (약 15 μm 폭)과 연결되어 직접 적인 배지 흐름과 세포 배양 영역 전반에 걸친 전단 응을 방지하면서도 화학 물질이 작은 슬릿을 통해 확산되고 영양소를 교환 할 수 있습니다. 신진 대사 폐기물 등 화학 그라데이션의 생성은 한 매체 채널이 플루오레세인의 0.1 mM을 포함하고 다른 채널에는 불소가 없는 경우 그림 1B에서입증됩니다. 세포는 가스 투과성 멤브레인상에서 배양되고, 칩에 대한 멤브레인에 대한 양압을 통해 미세 구조에 의해 캡슐화된다. 장치 홀더의 구성 요소는 그림 2에도시되어 있으며, 실험 설정은 도 3에도시되어 있으며, 여기서 배양은 37 °C의 반전된 현미경상에서 유지되고, 상대 습도가 85% 이상이며, 아래 조건부로 조절됩니다. 노르목시아 가스 조성.

이 시스템은 브라이트필드 및 형광 채널을 통해 국부적인 세포 상호 작용에 대한 상세한 관찰을 제공하며 면역 형광, 웨스턴 블롯 또는 질량 분석과 같은 공간적으로 해결된 하류 분석법을 허용합니다. 우리는 이전에 상피 및 중간엽 PC3 전립선 암 세포^(12)의 장기 공동 배양뿐만 아니라 약물 내성 폴리 플로이드 거인의 출현에 대한 이 미세 유체 암 온 칩 모델의 원리 증명으로 입증되었습니다. 상피 PC3^{세포주(13)를}이용한 암세포. 우리는 도세탁셀의 스트레스 구배하에서 상피 PC3 및 중간엽 전립선 암 세포의 시공간 역학을 이해하기 위해이 플랫폼의 응용 프로그램을 제시하는 동안, 미세 유체 시스템은 세포주 조합의 모든 조합에 쉽게 적용 될 수있다 및 자원 (즉, 약물, 영양소, 산소) 그라데이션.

프로토콜

1. 미세 유체 장치의 제조

1. 레이아웃 설계 소프트웨어를 사용하여 원하는 미세 유체 패턴을 생성합니다(보충 재료참조).
2. 포토 마스크를 제작합니다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
   1. 레이저 라이터를 활용하여 100 nm의 Cr과 500 nm의 포토 레지스트 AZ1518로 코팅 된 소다 라임 유리 판에 패턴을 작성합니다.
   2. 60s에 대한 개발자 AZ300MIF와 포토 레지스트를 개발합니다.
   3. Cr-7 크롬 에찬트(Cr-7 크롬 에찬트)를 사용하여 포토레지스트로부터 보호하지 않고 크롬을 에칭합니다.
   4. 70°C에서 포토레지스트 스트리퍼를 사용하여 잔류 포토레지스트를 45분 동안 제거합니다.
3. 포토레지스트 패턴을 패턴화합니다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
   1. 40s에 대한 4000 rpm에서 실리콘 웨이퍼에 HMDS를 스핀 코트.
   2. 40s에 대한 4000 rpm에서 실리콘 웨이퍼에 스핀 코트 포토 레지던트 AZ4330.
   3. 실리콘 웨이퍼를 95°C에서 60s로 부드럽게 굽습니다.
   4. 마스크 얼라이너를 사용하여 실리콘 웨이퍼에 UV를 노출시다.
   5. 4 분 동안 개발자 AZ300MIF와 포토 레지스트를 개발합니다.
4. DRIE 에칭을 수행합니다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
   1. 100 μm 깊이의 실리콘 딥 반응성 이온 에칭(DRIE) 시스템을 사용하여 포토레지스트로 패턴처리된 웨이퍼를 드라이 에칭.
   2. 플라즈마 에칭으로 아세톤과 플라즈마 에칭으로 포토레지스트를 제거합니다.
5. 웨이퍼 산화 및 실란화. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
   1. 1100 °C에서 1시간 동안 용광로에서 에칭된 실리콘 웨이퍼에 열 산화를 수행합니다.
   2. 실리콘 웨이퍼가 식을 때까지 기다린 다음 웨이퍼를 트리클로로-1H,1H,2H,2H-2H-2H-perfluorooctyl-silane(PFOTS) 몇 방울로 웨이퍼 근처의 작은 용기에 떨어뜨리는 데시케이터에 넣습니다.
   3. 건조기의 압력을 실온에서 0.5 atm로 60 분 동안 펌핑합니다. 실리콘 웨이퍼 금형은 적절한 실란화 후 소수성이되어야하며, 웨이퍼에 여러 방울의 물을 추가하여 테스트 할 수 있습니다.
6. 부드러운 리소그래피. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
   1. 프리 폴리머와 크로스 링커(폴리메틸실록산(PDMS) 키트를 10:1 중량 비율로 혼합합니다.
   2. 혼합 PDMS를 부어 10mm 높이의 필름을 실란화 실리콘 웨이퍼 몰드에 만듭니다.
   3. 생성된 PDMS-실리콘 웨이퍼 시스템을 30분 내지 1시간 동안 건조기에서 탈기한다.
   4. PDMS-실리콘 웨이퍼를 70°C 인큐베이터에서 밤새 배양하여 PDMS를 경화한다.
   5. PDMS가 경화되면 PDMS 필름을 실리콘 웨이퍼에서 조심스럽게 벗깁니다.
   6. 생검 바늘을 사용하여 PDMS의 패턴 위치에 따라 입구 포트에서 구멍을 뚫고 원형 펀치를 사용하여 직경 27mm의 칩을 절단합니다.
7. PDMS 층 접합.
   1. 27mm PDMS 실린더의 두 스택 (패터닝없이)을 가열하여 장치의 저장소 층과 캡핑 층이됩니다.
   2. 저수지 층의 입구 주위에 두 개의 7mm 원을 잘라 내고 생검 바늘을 사용하여 캡핑 층의 입구 포트에서 관통 구멍을 펀치합니다.
   3. PDMS의 세 스택을 결합 (패턴 스택, 저수지 층, 캡핑 층) 산소 플라즈마 처리와.
   4. 생검 바늘로 콘센트와 장치의 중앙 포트에서 구멍을 뚫습니다.

2. 미디어 및 세포주 준비

1. PC3-EMT 및 PC3-EPI를 포함한 PC3 세포주 배양용 배지를 준비합니다: RPMI 1640 배지와 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 1x 항생제 항마이코제를 혼합합니다. 앞서 설명한 대로 세포주를^{생성합니다(14)}
   참고: PC3 세포주들은 37°C에서 5%_CO2로가습된 인큐베이터에서 상기 매질에서 유지된다. 세포와 하위 배양을 분할 3 일, 그들은 에 도달하기 전에 100% 합류.
2. 종시질 표지형 형광 마커를 가진 트랜스펙트 세포주,앞서^12일설명한 바와 같이, PC3-EMT는 세포질 GFP를 표현하고 PC3-EPI는 세포질 mCherry를 표현한다. 이 기술은 또한 모든 형광 표지 세포뿐만 아니라 표지되지 않은 세포의 밝은 필드 이미징과 도 호환됩니다.

3. 실험 설정

1. 금속 판 홀더 의 제조
   1. 가공 또는 3D 프린팅을 통해 병렬 실험을 위해 동시 가스 투과성 배양 접시를 보관하기에 충분한 플레이트 홀더를 제작합니다. 3D CAD 파일("3웰 플레이트. FCStd")는 GitHub에서 참조(https://github.com/kechihl/3-well-plate)로 찾을 수 있습니다.
   2. 드라이버로 홀더의 구성 요소를 풀습니다(그림2). 자외선 노출을 통해 성분을 최소 1시간 동안 소독하고 멸균 된 환경에 둡니다.
      참고: 홀더는 공기 흐름을 허용하는 가스 채널 입구와 함께 열 평형 및 이상적인 가스 조성에 대한 실질적인 조건을 제공하도록 설계되었습니다. 자세한 내용은 전작^12에서확인할 수 있습니다.
   3. 세포 배양 막이 상대적으로 유연하다는 3 개의 가스 투과성 배양 접시를 준비합니다.
2. 세포주 시딩
   1. 실험 시작 24시간 전에, 5분 동안 트립시네이징으로 PC3-EPI 및 PC3-EMT 세포를 수확합니다.
   2. 각 PC3-EPI 및 PC3-EMT의 세포를 혈전계를 사용하여 카운트하고 각 가스 투과성 배양 접시에 대해 각 세포 유형의 총 2.5 x 10^4를 분리합니다.
   3. 2 mL의 배양 배지에서 두 세포 유형을 혼합하고 재중단하고 각각의 가스 투과성 배양 접시에 세포를 시드한다.
   4. 세포가 부착할 수 있도록 전체 플레이트 홀더를 밤새 인큐베이터에 둡니다.
   5. 적어도 1 시간 동안 UV 노출을 통해 PDMS 장치를 소독하고 멸균 환경에 둡니다.
3. 열 제어 장치 및 가스 공급 시스템 설정
   1. 그림 3에표시된 것처럼_CO2 및_O2 제어 장치, 가스 펌프, 가스 혼합 챔버, 가습기 또는 버블러, 가스 밸브 및 압력 게이지 3개로 구성된 가스 공급 시스템을 설정합니다. 자세한 내용은 전작^12에서확인할 수 있습니다.
   2. CO 2 및 N 2_탱크 및_O2 소스로부터 가스의 혼합 속도를 조정하도록 CO₂ 및_O2 제어 유닛을 설정합니다. 또는 노르목시아 조건하에서 가스를 공급하는 모든 가스 공급 시스템이 작동합니다.
   3. 상대 습도가 최대 85%(상대 습도 모니터에서 판독)되도록 혼합 챔버에 결합되어 버블러에 의해 가습되는 가스가 압력 게이지가 있는 3개의 독립적인 가스 밸브로 연결되는지 확인하십시오. 제어 하고 플레이트 홀더의 가스 유량을 모니터링합니다.
   4. 전체 플레이트 홀더를 뚜껑과 바닥 판에 별도의 가열 하위 장치가 있는 단계 의 인큐베이션 열 제어 장치에 놓고 모든 장치를 37°C로 설정합니다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
4. 미세 유체 장치의 설치. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
   1. 그림 2와같이 3웰 플레이트 홀더의 상세 구성 요소가 순서대로 되어 있는지 확인합니다. 세 개의 우물은 각각 동일하고 독립적이며, 각 우물에 대한 가스 채널 쌍이 있습니다. 모든 우물은 가스 투과성 배양 접시 홀더, PDMS 칩 홀더, 유리 창 홀더 및 35mm 유리 창 쌍을 보유하고 있습니다. 이러한 구성 요소는 장착 된 나사를 사용하여 조립 할 수 있습니다.
      참고: 유리 창은 가스 투과성 배양 멤브레인과 웰 사이에 열 절연 공간이 있는지 확인하여 인터페이스의 온도 차이로 인해 물 결로가 발생하지 않도록 합니다. 3개의 웰은 독립적이며 3개의 실험을 별도로 수행할 수 있습니다.
   2. 37°C에서 예온 배양배지를 20분 동안 진공 챔버에서 탈기하였다.
   3. 친수성을 유지하기 위해 30s의 산소 플라즈마 시스템을 사용하여 PDMS 칩을 치료하십시오.
   4. 주사기 시스템을 설정합니다. 성장 매체와 관심의 원하는 시약 (미디어, 약물이있는 매체 등)으로 두 개의 주사기를 천천히로드하십시오. 각 개별 주사기를 50cm 튜브(0.020" x 0.060"OD)에 23G 디스펜싱 바늘로 하나의 중공 스틸 핀에 연결합니다. 튜브의 다른 쪽 끝에 중공 강철 핀을 삽입합니다.
   5. 튜브를 프라이밍하고 강철 핀을 캡핑 층을 통해 각 PDMS 칩에 삽입합니다. 저장소 층을 채우고 PDMS 패턴 레이어 패턴을 용지로 적시다. 저수지 층은 온칩 버블 트랩으로 작동하여 기포가 미세 유체 패턴으로 들어가는 것을 방지합니다.
   6. 배양 배지로 1mL 주사기를 로드합니다. 주사기를 5cm 튜브(0.020" x 0.060"OD)에 23G 디스펜싱 바늘로 하나의 중공 스틸 핀에 연결합니다. 튜브의 다른 쪽 끝에 중공 강철 핀을 삽입하고 튜브를 프라이밍합니다.
   7. 칩 의 중앙 구멍에 중공 강철 핀을 삽입하여 칩 밀봉 공정 중에 나중에 칩에서 과도한 용지를 추출할 수 있습니다.
   8. 각 PDMS 장치에는 주사기 펌프에 적재된 4개의 10mL 주사기가 필요하므로 전방 데크에 칩당 2개의 10mL 주사기를 적재합니다. 다른 두 주사기를 주사기 시스템의 인출 데크에 놓습니다.
   9. 가스 투과성 배양 막 위에 칩을 직접 놓습니다 (세포가 이미 멤브레인에 부착된 경우). 미세 유체 패턴에 마이크로 버블이 갇히지 않도록 하기 위해 조립 전에 35mm 가스 투과성 배양 접시에 미리 따뜻해지고 탈기된 매체 1mL를 분배한 다음 칩이 15도 기울기 각도로 액체 표면에 접근하는지 확인하십시오.
   10. PDMS 칩 홀더를 아래쪽으로 밀어 내면서 각 칩에 대한 가스 투과성 배양 접시 홀더와 우물의 가스 투과성 배양 접시를 클램프합니다.
   11. 칩이 마르지 않도록 PDMS 장치 위에 실러 시트를 테이프로 고정하고 PDMS 칩 홀더로 클램프합니다.
   12. 어레이 주변의 미디어 유량을 20μL/h로 설정합니다.
   13. 반전 된 현미경의 전동 단계에 무대 인큐베이터에서 전체 플레이트를 설정합니다. 가스 공급 시스템을 가스 채널에 연결하고 설치된 PDMS 칩에 대해 가스 투과성 배양 막을 가압하여 장치의 밀봉을 보장합니다. 0.2 psi (1.4 x 10⁴ Pa)에서 게이지 압력을 유지합니다.
   14. 중앙 구멍에서 1 mL 주사기를 사용하여 칩에서 과도한 매체를 천천히 추출합니다. 매체를 추출하는 동안 현미경 으로 칩을 관찰한 다음 칩이 밀봉되면 추출을 중지합니다. 칩 밀봉은 세포의 일부가 미세 구조에 의해 분쇄될 것이기 때문에 명백해야 한다.
   15. 온스테이지 인큐베이터의 온도 감지 장치를 3웰 플레이트에 연결하고 37°C로 설정합니다.

4. 단세포 시간 경과 화상 진찰

1. 역현미경을 활용하여 타임랩스 이미지 수집을 위한 이미징 소프트웨어를 설정합니다. EA 실험에는 완전히 전동된 x-y 단계, 초점 노브, 셔터 및 필터 큐브가 있는 반전형광 현미경이 필요합니다.
2. 자동 초점 한 라운드 후 자동 이미지 스티치와 각 칩에 대한 10배 배율로 두 채널에 걸쳐 이미지를 획득하도록 소프트웨어를 구성합니다. Perfect Focus와 같은 자동 보정 시스템이 만족스러운 이미지 품질을 보장하지는 않습니다. 칩 전체의 자동 초점 또는 수동 포커스를 기반으로 장기적인 이미지 수집을 위해 사용자 지정된 포커스 표면을 생성하는 것이 좋습니다.
3. 매시간 이미지를 찍고 실험을 몇 주 단위로 실행합니다. 매일 이미지 품질을 모니터링하고 필요한 경우 초점 표면을 업데이트합니다.
4. 앞서^13일설명한 바와 같이 후속 면역형광 분석을 위해 PDMS 칩 및 가스 투과성 배양 접시를 준비한다.

5. 이미지 처리 및 분석

1. 실험 후 처리
   1. 피지/ImageJ를 활용하여 이미지 처리 및 측정을 위해 이미지를 TIFF 형식으로 변환합니다.
   2. TIFF 파일을 압축하여 추가 이미지 처리를 용이하게 합니다.
2. 피지/이미지J 분석
   1. 세포를 식별하려면 배경 빼기 및 입자 분석을 수행하여 세포 위치 감지 및 자동 세포 계수를 위한 형광 밝은 반점을 식별합니다.
   2. 플러그인 (수동 추적, 화학 요법, 마이그레이션 도구, Trackmate)를 활용하여 세포 운동성 및 마이그레이션을 분석합니다.

결과

칩에서 최적의 세포 성장 검증
실험 플랫폼의 주요 목표는 복잡한 종양 미세 환경에서 중요한 구성 요소 와 상호 작용을 포괄적으로 재현하면서도 정량적이고 신뢰할 수 있고 재현 가능한 데이터를 제공하기에 충분합니다. 이 목표는 우리가 물리적 및 생화학적 환경 요인을 완전히 통제할 수 있는 경우에만 달성할 수 있습니다. 우리는 원하지 않는 요인을 ?...

토론

종래의 세포 배양은 거의 100년 전에 개발되었으며, 암^17에서임상 결과를 예측하는 능력이 제한적이라는 입증된 능력에도 불구하고 생물의학 연구에서 가장 자주 사용되는 전임상 모델로 남아 있다. 동물 모델은 인간에게 가장 높은 생리학적 관련성 및 합리적인 유전적 유사성을 제공하지만, 인간의 결과를 예측하는 데 상당한 한계가 있다고 오랫동안 인정되어 왔다

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL BD Luer-Lok tip syringes	BD	14-823-16E
Antibiotic-Antimycotic	Sigma-Aldrich	A5955	1x anti-anti
AZ 300 MIF	Merck KGaA	18441123163	Photoresist developer
AZ1518	Merck KGaA	AZ1518	Photoresist
AZ4330	Merck KGaA	AZ4330	Photoresist
Cr Chromium Etchant	Sigma-Aldrich	651826
Fetal bovine serum (FBS)	Life Technologies Corporation	10437028
Heidelberg DWL 66+ laserwriter	Heidelberg Instruments	DWL66+	Writing photomask
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Sigma-Aldrich	379212	For photoresist adhesion enhancement
Hollow steel pins	New England Small Tube	NE-1300-01	.025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard
ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame	ibidi	10929	On-stage incubator
Luer-Lok 23 G dispensing needle	McMaster-Carr	75165A684	To connect syringes and tubings
Lumox dish 35	Sarstedt	94.6077.331	Gas-permeable cell culture dish
Microposit Remover 1165	Dow Electronic Materials	Microposit Remover 1165	Photoresist stripper
Microseal B Adhesive Sealer	Bio-Rad Laboratories	MSB1001	Adhesive sealer
O-Ring (for Lumox plate sealing)	McMaster-Carr	9452K114	Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70
O-Ring (for bottom glass window sealing)	McMaster-Carr	9452K74	Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70
Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System	Plasmatic Systems, Inc	Plasma-Preen	Oxygen plasma system
RPMI 1640	Life Technologies Corporation	11875-093
Samco RIE800iPB DRIE	Samco	RIE800iPB	Deep reactive-ion etching system
Suss MA6 mask aligner	SUSS MicroTec	MA6	Mask aligner
Sylgard 184 Silicone Elastomer	Fisher Scientific	NC9285739	PDMS elastomer
TePla M4L plasma etcher	PVA TePla	M4L	Plasma etcher
Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS)	Sigma-Aldrich	448931	For silicon wafer silanization
Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD)	Cole-Parmer	EW-06419-01	Tubings for media delivery