쥐에 있는 복잡한 지역 고통 증후군 타입-I를 위한 만성 포스트 허혈 고통 모형

요약

여기에 제공된 프로토콜은 만성 허혈 후 통증(CPIP)의 동물 모델을 확립하는 단계를 상세히 설명합니다. 이것은 인간 복잡한 지역 고통 증후군 유형-I를 모방하는 잘 인식된 모형입니다. 기계적 및 열적 과민성은 CPIP 래트 모델에서 관찰된 캡사이신 유도 노시펜스 거동뿐만 아니라 추가로 평가된다.

초록

복잡한 국부적인 통증 증후군 유형-I(CRPS-I)는 환자 들 사이에서 심한 통증을 일으키는 신경 질환이며 해결되지 않은 상태로 남아 있습니다. 그러나 CRPS-I의 기본 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았습니다. 허혈/재관류는 CRPS-I를 일으키는 주요 요인 중 하나인 것으로 알려져 있습니다. 연장된 허혈 및 뒷다리의 재관류에 의해, 쥐 만성 허혈 후 통증(CPIP) 모델은 CRPS-I를 모방하기 위해 확립되었다. CPIP 모델은 CRPS-I의 메커니즘을 연구하기 위한 잘 알려진 동물 모델이 되었습니다. 이 프로토콜은 마취를 포함하여 CPIP의 쥐 모델의 확립에 관련된 상세한 절차를 설명하고 뒷다리의 허혈 / 재관류를 수행합니다. 랫트 CPIP 모델의 특성은 급성 캡사이신 주입에 대한 항성 반응뿐만 아니라 뒷다리의 기계적 및 열적 과민성을 측정함으로써 더욱 평가된다. 쥐 CPIP 모델은 설립 후 초기 단계에서 뒷다리 부종 및 충혈을 포함한 여러 CRPS-I-유사 증상을 나타내며, 지속적인 열 및 기계적 과민성, 급성 캡사이신 주사에 대한 노시펜성 반응을 증가시켰다. 이러한 특성은 CRPS-I에 관여하는 메커니즘의 추가 조사에 적합한 동물 모델을 렌더링합니다.

서문

복잡한 국소 통증 증후군(CRPS)은 골절, 외상, 수술, 허혈 또는 신경^손상으로인한 복합및 만성 통증 증상을^1,2,3. CRPS는 2개의 하위 범주로 분류됩니다: CRPS 유형 I 및 타입-II (CRPS-I 및 CRPS-II)^4. 역학 연구는 CRPS의 보급이 대략 이었다는 것을 밝혔습니다 1:2000^5. 명백한 신경 손상을 보이지 않는 CRPS-I는 만성 통증을 초래할 수 있으며 환자의 삶의 질에 극적으로 영향을 미칩니다. 현재 사용 가능한 치료는 부적절한 치료 효과를 보여줍니다. 그러므로, CRPS-I는 아직도 해결될 필요가 있는 중요하고 도전적인 임상 문제 남아 있습니다.

CRPS-I를 모방한 전임상 동물 모델을 확립하는 것은 CRPS-I의 근본적인 메커니즘을 탐구하는 데 매우 중요합니다. 이 문제를 해결하기 위해 Coderre 등은 CRPS-I^6을다시 하기 위해 뒷다리에 장기간 허혈 및 재관류를 적용하여 쥐 모델을 설계했습니다. 허혈/재관류 손상은 CRPS-I^7의주요 원인 중 하나인 것으로 알려져 있습니다. 랫트 CPIP 모델은 모델 설립 후 초기 단계에서 뒷다리 부종 및 충혈을 포함하는 많은 CRPS-I-유사 증상을 나타내며, 지속적인 열 및 기계적 과민성^6. 이 모델의 도움으로 중앙 통증 감작, 말초 TRPA1 채널 활성화 및 반응성 산소 종 생성 등이 CRPS-I^8,9,10에기여하는 것이 제안된다. 우리는 최근에 성공적으로 CPIP 쥐 모델을 설치하고 영향을받는 뒷발^(11)을중화시키는 등뿌리 중추 (DRGs)의 RNA 시퀀싱을 수행했습니다. 우리는 CRPS-I^11의고통 과민증을 중재하는 데 아마도 관여하는 몇 가지 잠재적 인 메커니즘을 발견했습니다. 우리는 또한 CRPS-I^12의기계적 및 열 과민성에 중요한 기여로 DRG 뉴런에서 일시적인 수용체 전위 바닐로이드 1 (TRPV1) 채널을 확인했습니다.

이 연구에서는, 우리는 CPIP의 쥐 모형의 설치에 관련시킨 상세한 절차를 기술했습니다. 우리는 또한 급성 capsaicin 도전에 그것의 반응성 뿐만 아니라 기계및 열 과민성 측정하 여 쥐 CPIP 모형을 평가했습니다. 우리는 쥐 CPIP 모델이 CRPS-I에 관여하는 메커니즘의 추가 조사를 위한 신뢰할 수 있는 동물 모델이 될 수 있음을 제안한다.

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프로토콜

동물 프로토콜은 절강 중국 의과 대학 동물 윤리위원회에 의해 승인되었다.

1. 동물

1. 상하이 실험실 동물 센터에서 수컷 스프라그-도울리(SD) 쥐(280-320g, 8-10주)를 획득하십시오. 저장 성 중국 의과 대학 실험실 동물 센터에서 동물을 집. 사육 조건에는 12 h / 2h 의 빛 / 어두운 사이클이 포함되어야하며 온도를 24 °C에서 일정하게 유지해야합니다. 물과 음식 광고 libitum을제공합니다. 총 48 마리의 쥐가 이 연구에 사용됩니다. 이 모델에서 한 가지 주의 사항에서 전체 프로세스 동안 통증 반응을 관찰해야합니다. 진통제가 적용되면 통증 모델을 성공적으로 설정할 수 없습니다. 실험 후, 쥐는 희생된다.

2. CPIP 모델 설립

1. 나트륨 페노바르비탈 (50 mg/kg, 복강 내 주사 [i.p.])으로 모든 쥐 (샴 및 CPIP 모델 그룹 포함)를 마취시요. 필요한 경우 최대 20 mg/kg/h 페노바르비탈[i.p.]으로 마취를 유지하십시오. 집게를 사용하여 뒷발이나 꼬리 끝을 꼬집어 각 동물의 반사 신경을 확인합니다. 모델 을 수립하기 전에 쥐가 반응하지 않는지 확인하십시오. 시술 중 건조를 피하기 위해 수의사의 연고를 눈에 놓습니다. 다음 절차를 위해 37°C에서 유지된 가열된 패드 위에 마취된 랫트에 놓는다.
2. 뒷발의 허혈 및 재관류
   1. 쥐가 마취되면 오른쪽 뒷발과 발목을 글리세롤로 윤활하십시오.
   2. 7/32"(5.5mm) 내부 직경의 Nitrile 70 듀로미터 O 링을 1.5mL Eppendorf 튜브의 큰 면에 밀어 넣습니다(사용하기 전에 스냅 캡이 잘려있음). 뒷발을 중공 에펜도르프 튜브에 조심스럽게 삽입하여 바닥에 도달할 때까지 넣습니다.
   3. 점차적으로 O-링을 튜브에서 발목 관절 근처의 오른쪽 뒷다리로 밀어 넣고 3 시간 동안 쥐의 가짜 그룹에 동일한 치료를 적용합니다.
   4. 허혈 단계 후 O-링 3시간 절단. 쥐가 흉골 의전성을 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 조심스럽게 보십시오. 마취를 받은 쥐는 완전히 회복 될 때까지 다른 쥐의 회사에 다시 배치해서는 안됩니다.

3. 노시펜제성 행동 테스트

1. 메쉬 바닥에 앉아 투명 플렉시 글라스 챔버에 쥐를 배치합니다. 어떤 행동 시험든지 전에 0.5 시간 동안 쥐를 습관화하십시오.
2. 기계적 알로디니아
   1. 본 프레이 필라멘트(0.4, 0.6, 1.0, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 15.0 및 26.0 g 필라멘트)를 시험에 사용하십시오. 중간 필라멘트 (4.0 g)에서 테스트를 시작합니다. 필라멘트를 뒷발의 중간 발바닥 표면에 수직으로 적용합니다. 필라멘트를 최대 5s까지 구부리기 위해 적당한 힘을 약간 가합니다. 자극에 대한 응답으로 뒷발의 갑작스런 후퇴는 비감퇴 행동으로 간주됩니다. 13일까지 -3일, -2, -1, 격일로 기계적 알로디니아 테스트를 실시합니다.
   2. 업다운 테스트 방법을 적용하여 임계값을 테스트합니다. 50% 발 인출 임계값(PWT)^13,14,15를계산하기 위한 Dixon 방법을 적용합니다.
3. 열 고갈수증
   1. Hargreaves의 방법을 사용하여 열 과민증을 검사하십시오. 발출 대기 시간(PWL)을 측정하기 위해 전구(50W)에서 뒷발로 방출되는 라이트 빔을 직접 조준한다. 가열에서 과도한 부상을 방지하기 위해 컷 오프 임계 값으로 20 s를 설정합니다.
   2. 각 뒷발에 대해 5분 간격으로 각 테스트를 3회 반복합니다. 각^쥐(16)의PWL로서 이 세 가지 시험의 평균을 취한다. 13일까지 -3일, -2일, -1일, 격일로 열과민 검사를 실시합니다.
4. 캡사이신 유발 급성 호민성 행동
   1. 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 사용하여 캡사이신 스톡 용액(200 mM)을 준비하고 뒷발 주입을 위해 멸균 인산완충식염수(PBS)에서 1:1000까지 추가희석합니다. PBS의 최종 DMSO 농도는 0.1%입니다(비차는 PBS에서만 0.1% DMSO를 포함). 1 mL 주사기에 부착 된 30G 바늘을 사용하여 50 μL의 부피에서 캡사이신 또는 차량을 뒷발 (인트라 플란타르 주사)에 주입하십시오.
   2. 주사 직후 10분 동안 비디오 카메라를 사용하여 nocifensive 동작(즉, 주사된 발의 핥기, 물기 또는 플린칭)을 기록하고, 그 후 앞서 설명한 바와 같이^{정량화17,18,19.}
5. 뒷발 부종 평가: 발 직경의 증가를 측정하여 뒷발 부종을 평가한다. 디지털 캘리퍼스로 측정하고 기저값과 다른 시점에서 관찰된 테스트 값 간의 차이를 계산합니다. 모델 설립 후 발 두께의 변화를 15분, 24시간, 48시간 및 72시간으로 평가합니다.

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결과

발목에 O-링을 배치한 후, 동측 뒷발 피부는 청색증, 조직 저산소증의 표시를나타냈다(도 1A). O-링을 절단 한 후, ipsilateral 뒷발은 혈액으로 채우기 시작하고 충혈의 강렬한 징후를 보여 강력한 붓기를 보였다(그림 1A). 발 붓기가 점차 감소하고 허혈성 / 재관류 절차 후 정상 48 시간으로 돌아왔다 (시닥 후- 혹 테스트와 양방향 ANOV...

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토론

이 프로토콜은 쥐의 뒷다리에 허혈/재관류를 적용하여 쥐 CPIP 모델을 확립하기 위한 상세한 방법을 설명합니다. 그것은 뒷다리 외관의 평가를 포함, 부 종, 기계/열 과민성, 그리고 capsaicin 주입에 대 한 응답에서 급성 nocifensive 거 동.

사지 허혈/재관류는 인간 환자^12에서CRPS-I에 기여하는 일반적인 인자이다. 이 프로토콜은 인간 CRPS-I^6을다시 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml Eppendorf tube	Eppendorf	22431021
DMSO	Sigma-Aldrich	D1435
Capsaicin	APEXBIO	A3278
Digital caliper	Meinaite	NA
O-ring	O-Rings West	Nitrile 70 Durometer	7/32 in. internal diameter
Plantar Test Apparatus	UGO Basile, Italy	37370
von Frey filaments	UGO Basile, Italy	NC12775