Modelo crônico da dor da Borne-Isquemia para a síndrome regional complexa da dor tipo-I nos ratos

Resumo

Fornecido aqui é um protocolo que detalha etapas para estabelecer um modelo animal da dor crônica do borne-isquemia (CPIP). Este é um modelo bem reconhecido imitando a síndrome da dor regional complexa humana tipo I. As hipersensibilidades mecânicas e térmicas são avaliadas, bem como comportamentos nocifensivos induzidos por capsaicina observados no modelo de ratazana CPIP.

Resumo

A síndrome regional complexa da dor tipo I (CRPS-I) é uma doença neurológica que cause a dor severa entre pacientes e permaneça uma condição médica não resolvida. No entanto, os mecanismos subjacentes do CRPS-I ainda não foram revelados. Sabe-se que a isquemia/reperfusão é um dos principais fatores que causa crps-i. Por meio de isquemia prolongada e reperfusão do membro traseiro, o modelo crônico de dor pós-isquemia (CPIP) foi estabelecido para imitar crps-i. O modelo CPIP tornou-se um modelo animal bem reconhecido para estudar os mecanismos de CRPS-I. Este protocolo descreve os procedimentos detalhados envolvidos no estabelecimento do modelo de rato da CPIP, incluindo anestesia, seguido de isquemia/reperfusão do membro traseiro. As características do modelo cpip de rato são avaliadas medindo as hipersensibilidades mecânicas e térmicas do membro traseiro, bem como as respostas nocifensivas à injeção aguda de capsaicina. O modelo cpip rato exibe várias crps-i-como manifestações, incluindo edema dos membros traseiros e hiperemia no estágio inicial após o estabelecimento, persistentes hipersensibilidades térmicas e mecânicas, e aumento das respostas nocifensivas à injeção aguda de capsaicina. Estas características tornam-no um modelo animal adequado para uma investigação mais aprofundada dos mecanismos envolvidos na CRPS-I.

Introdução

A síndrome regional complexa da dor (CRPS) reprents os sintomas complexos e crônicos da dor resultando das fraturas, do traumatismo, da cirurgia, da isquemia ou do ferimento de nervo^1,2,3. Crps é classificado em 2 subcategorias: CRPS tipo-I e tipo-II (CRPS-I e CRPS-II)⁴. Estudos epidemiológicos revelaram que a prevalência de CRPS foi de aproximadamente 1:2000^5. Crps-I, que não mostra nenhum dano nervoso óbvio, pode resultar em dor crônica e afeta drasticamente a qualidade de vida dos pacientes. Os tratamentos atuais disponíveis mostram efeitos terapêuticos inadequados. Portanto, crps-i ainda continua a ser um problema clínico importante e desafiador que precisa ser resolvido.

Estabelecer um modelo animal pré-clínico imitando CRPS-I é crucial para explorar os mecanismos subjacentes CRPS-I. A fim de resolver esta questão, Coderre et al. projetou um modelo de rato aplicando isquemia prolongada e refusão para o membro traseiro para recapitular CRPS-I⁶. Sabe-se que a isquemia/lesão em reperfusão está entre uma das principais causas do CRPS-I^7. O modelo cpip rato exibe muitos crps-i-como sintomas, que incluem edema dos membros traseiros e hiperemia no estágio inicial após o estabelecimento do modelo, seguido com persistentes hipersensibilidades térmicas e mecânicas⁶. Com o auxílio deste modelo, propõe-se que a sensibilização central da dor, a ativação periférica do canal TRPA1 e a geração reativa de espécies de oxigênio, etc. contribuam para o CRPS-I^8,9,10. Recentemente, estabelecemos com sucesso o modelo de rato CPIP e realizamos o sequenciamento de RNA dos gânglios radiadores dorsais (DRGs) que internam a pata traseira afetada¹¹. Descobrimos alguns mecanismos potenciais que possivelmente estão envolvidos na mediação das hipersensibilidades da dor do CRPS-I¹¹. Ainda identificamos o canal de vaniloides potenciais do receptor transitório 1 (TRPV1) em neurônios DRG como um importante contribuinte para as hipersensibilidades mecânicas e térmicas do CRPS-I¹².

Neste estudo, descrevimos os procedimentos detalhados envolvidos na criação do modelo de rato da CPIP. Também avaliamos o modelo cpip de rato medindo as hipersensibilidades mecânicas e térmicas, bem como sua capacidade de resposta ao desafio agudo da capsaicina. Propomos que o modelo cpip rato pode ser um modelo animal confiável para uma investigação mais aprofundada dos mecanismos envolvidos no CRPS-I.

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Protocolo

Os protocolos animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade Médica Chinesa de Zhejiang.

1. Animais

1. Obtenha ratos machos Sprague-Dawley (SD) (280-320 g, 8-10 semanas de idade) do Shanghai Laboratory Animal Center. Abrigar os animais em Zhejiang Chinese Medical University Laboratory Animal Center. Observe que as condições de reprodução devem incluir 12 h/ 2h ciclos claros / escuros e manter a temperatura constante em 24 °C. Fornecer água e comida ad libitum. Note-se que um total de 48 ratos são usados neste estudo. Uma nota, neste modelo, precisamos observar a resposta à dor durante todo o processo. Se a medicação para a dor é aplicada, então não podemos estabelecer com sucesso o modelo de dor. Após os experimentos, os ratos são sacrificados.

2. Estabelecimento modelo CPIP

1. Anestesiar todos os ratos (incluindo grupos de modelos falsos e CPIP) com fenobarbital de sódio (50 mg/kg, injeção intraperitoneal [i.p.]). Mantenha anestesia com até 20 mg/kg/h fenobarbital [i.p.], se necessário. Verifique os reflexos de cada animal, beliscando sua pata traseira ou ponta traseira usando fórceps. Certifique-se de que os ratos não são responsivos antes do estabelecimento modelo. Coloque pomada veterinário nos olhos para evitar a secura durante o procedimento. Coloque os ratos anestesiados em uma almofada aquecida mantida em 37 °C para o procedimento seguinte.
2. Isquemia e reperfusão da pata traseira
   1. Lubrifique a pata traseira direita e tornozelo com glicerol uma vez que o rato é anestesiado.
   2. Deslize um nitrile 70 Durometer O-ring com um 7/32" (5,5 mm) diâmetro interno para o lado maior de um tubo eppendorf de 1,5 mL (com a tampa de pressão cortada antes do uso). Insira cuidadosamente a pata traseira no tubo eppendorf oco até chegar ao fundo.
   3. Gradualmente deslize o O-anel do tubo para o membro traseiro direito perto da articulação do tornozelo e coloque por 3 h. Aplicar o mesmo tratamento para um grupo falso de ratos, exceto que um anel O quebrado, que é cortado e não deve induzir isquemia, deve ser colocado ao redor do tornozelo.
   4. Corte o Anel O 3 h após o passo da isquemia. Cuidadosamente assistir o rato até que ele recupera consciência suficiente para manter a recumbency sternal. Note-se que o rato que recebeu anestesia não deve ser colocado de volta para a companhia de outros ratos até que ele se recuperou totalmente.

3. Testes comportamentais nocifensivos

1. Coloque o rato em uma câmara transparente plexiglas que está sentado em um chão de malha. Habituar o rato por 0,5 h antes de qualquer teste comportamental.
2. Allodynia mecânica
   1. Use filamentos von Frey (0,4, 0,6, 1,0, 2,0, 4,0, 6,0, 8,0, 15,0 e 26,0 g filamentos) para o teste. Comece o teste a partir do filamento médio (4,0 g). Aplique verticalmente os filamentos à superfície plantar média da pata traseira. Aplique ligeiramente a força apropriada para dobrar o filamento para até 5 s. Uma súbita retratação da pata traseira em resposta aos estímulos é considerada um comportamento nocifensivo. Realizar o teste de alodynia mecânica nos dias -3, -2, -1, e todos os dias até o dia 13.
   2. Aplique o método de teste para cima para baixo para testar o limite. Aplique o método Dixon para calcular 50% do limite de retirada da pata (PWT)^13,14,15.
3. Hiperalgesia térmica
   1. Use o método de Hargreaves para examinar a hiperalgesia térmica. Apontar diretamente o feixe de luz emitido de uma lâmpada (50 W) para a pata traseira para medir a latência de retirada da pata (PWL). Definir 20 s como o limite de corte para evitar lesões excessivas do aquecimento.
   2. Repita cada teste 3x em intervalos de 5 minutos para cada pata traseira. Tome a média destes três testes como o PWL de cada rato¹⁶. Realizar o teste de hiperalgesia térmica nos dias -3, -2, -1, e a cada dois dias até o dia 13.
4. Comportamento nocifensivo agudo induzido pela capsaicina
   1. Prepare a solução de estoque de capsaicina (200 mM) usando dimetil sulfoxida (DMSO) e diluir ainda mais para 1:1000 em soro soro de soro estéril com fosfato (PBS) para injeção de pata traseira. A concentração final de DMSO em PBS é de 0,1% (veículo contém 0,1% DMSO apenas na PBS). Injete capsaicina ou veículo na pata traseira (injeção intraplantar) a um volume de 50 μL usando uma agulha de 30 G presa a 1 mL seringa.
   2. Registre o comportamento nocifensivo (ou seja, lambendo, mordendo ou vacilando da pata injetada) usando uma câmera de vídeo por 10 min logo após a injeção e quantificou depois disso, como descrito anteriormente^17,18,19.
5. Avaliação do edema da pata traseira: Avalie o edema da pata traseira medindo o aumento no diâmetro da pata. Medir com uma pinça digital e calcular a diferença entre o valor basal e o valor do teste observado em diferentes pontos de tempo. Avalie as mudanças na espessura da pata em 15 min, 24 h, 48 h e 72 h após o estabelecimento modelo.

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Resultados

Depois de colocar o Anel O no tornozelo, a pele da pata traseira ipsilateral mostrou cianose, uma indicação de hipóxia de tecido (Figura 1A). Depois de cortar o Anel O, a pata traseira ipsilateral começou a se encher de sangue e mostrou inchaço robusto, o que demonstrou um sinal intenso de hiperemia (Figura 1A). O inchaço da pata diminuiu gradualmente e voltou ao normal 48 h após o procedimento isquêmico/reperfusional (A...

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Discussão

Este protocolo descreve os métodos detalhados para estabelecer um modelo de CPIP de rato aplicando isquemia/reperfusão aos membros traseiros dos ratos. Envolve a avaliação da aparência do membro traseiro, edema, hipersensibilidades mecânicas/térmicas e comportamentos nocifensivos agudos em resposta à injeção de capsaicina.

A isquemia/reperfusão dos membros é um fator comum que contribui para a CRPS-I em pacientes humanos^12. Este protocolo descreve como estab...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml Eppendorf tube	Eppendorf	22431021
DMSO	Sigma-Aldrich	D1435
Capsaicin	APEXBIO	A3278
Digital caliper	Meinaite	NA
O-ring	O-Rings West	Nitrile 70 Durometer	7/32 in. internal diameter
Plantar Test Apparatus	UGO Basile, Italy	37370
von Frey filaments	UGO Basile, Italy	NC12775