가중 상관 관계 네트워크에 따라 다른 서식지에서 루트 미생물의 발산

요약

네트워크 분석은 토양, 물 및 뿌리 부와 같은 다양한 생태 미생물 공동체의 연관성을 평가하기 위해 적용되었다. 여기에 제시된 WGCNA 알고리즘을 사용하여 다양한 생태 환경으로 인해 미생물 커뮤니티에서 발생할 수 있는 상이한 동발생 네트워크를 분석하는 방법에 대한 프로토콜이 제시된다.

초록

뿌리 미생물군유전체는 식물 성장과 환경 적응에 중요한 역할을 합니다. 네트워크 분석은 지역 사회를 연구하기위한 중요한 도구이며, 이는 다른 환경에서 다른 미생물 종의 상호 작용 관계 또는 동발생 모델을 효과적으로 탐구 할 수 있습니다. 이 원고의 목적은 다양한 생태 환경으로 인해 미생물 공동체에서 발생할 수 있는 상이한 공존 네트워크를 분석하기 위해 가중 상관 관계 네트워크 알고리즘을 사용하는 방법에 대한 세부 정보를 제공하는 것이다. 실험의 모든 분석은 WGCNA 패키지에서 수행됩니다. WGCNA는 가중 상관 네트워크 분석을 위한 R 패키지입니다. 이러한 방법을 입증하는 데 사용되는 실험 데이터는 쌀 (Oryza sativa) 뿌리 시스템의 세 틈새 에 대한 NCBI (생명 공학 정보 센터) 데이터베이스에서 미생물 커뮤니티 데이터였다. 우리는 3개의 틈새 시장 각각에 있는 미생물 지역 사회의 공동 풍요로운 네트워크를 구축하기 위하여 가중 상관 관계 네트워크 알고리즘을 이용했습니다. 이어서, 내피, 뿌리부, 뿌리부 및 뿌리부구 토양 간의 차동 공동 풍부 네트워크가 확인되었다. 또한 네트워크의 핵심 제네라들은 네트워크 기능에서 중요한 규제 역할을 하는 "WGCNA" 패키지에 의해 획득되었습니다. 이 방법을 통해 연구자들은 미생물 네트워크의 반응을 환경 장애에 대한 분석하고 다른 미생물 생태 반응 이론을 확인할 수 있습니다. 이러한 방법의 결과는 내구, 뿌리 부평면 및 쌀의 뿌리 부구 토양에서 확인된 중요한 차동 미생물 네트워크가 있음을 보여준다.

서문

미생물군유전체 연구는 생태계 프로세스 를 이해하고 조작하는 데 중요한 영향을 미칩니다^1,2. 미생물 인구는 환경 변화에 미생물의 반응에 영향을 미칠 수있는 생태 네트워크를 상호 작용하여 상호^연결3,4. 더욱이, 이들 네트워크의 특성은 미생물 공동체의 안정성에 영향을 미치고, 토양 기능^5와밀접한 관련이 있다. 가중 유전자 상관 네트워크 분석은 지금 유전자와 미생물 지역 사회 사이 관계에 대한 연구를 위해 널리 적용되었습니다^6. 이전 연구는 다른 유전자 또는 인구의 네트워크와 외부 세계 7 사이의 연관성에 주로 초점을^{맞추고있다.} 그러나, 다른 환경 조건하에서 미생물 인구에 의해 형성된 상관 관계 네트워크의 다름은 거의 조사되지 않았습니다. 이 논문에 제시된 연구의 목적은 WGCNA 알고리즘의 신속한 구현에 대한 통찰력과 세부 정보를 제공하여 다양한 환경 조건에서 수집된 미생물군유전체 샘플의 공존 네트워크를 구성하는 것입니다. 분석 결과에 기초하여, 우리는 인구의 조성및 다름을 평가하고 다른 미생물 인구 사이 관계를 더 토론했습니다. 가중치 상관 관계 네트워크 알고리즘^8의 다음과 같은 기본 흐름이 적용되었습니다. 첫째, OTU(운영 분류장치) 식 프로파일 간의 Pearson 상관 계수를 계산하여 유사성 매트릭스를 구성해야 했습니다. 이어서, 인자 기능(힘 또는 시그마이드 어자능 함수)의 파라미터는 스케일 프리 토폴로지 기준으로 채택되었고, 유사성 매트릭스는 인자계 매트릭스로 변형되었고, 각 공동 발생 네트워크는 인자계 행렬에 대응하였다. 일관된 식 프로파일을 모듈로 그룹화하는 TOM 기반 유사성과 결합된 평균 연결 계층 클러스터링을 사용했습니다. 또한, 우리는 보수적 인 통계와 관련 매개 변수 분석 모듈 사이의 관계를 계산, 마지막으로 모듈의 허브 OTU를 식별. 이러한 방법은 다양한 환경 조건하에서 다양한 미생물 집단 간의 네트워크 구조의 차이 분석에 특히 적합합니다. 본 원고에서, 우리는 모듈 간의 유사점 분석, 공동 발현 네트워크 개발 방법, 모듈 간의 유사성 분석에 대해 자세히 설명하고, 다른 모듈 네트워크에서 핵심 종을 얻기 위해 적용된 절차의 단계에 대한 간략한 개요를 제공했다.

프로토콜

1. 데이터 다운로드

1. 액세스 PRJNA386367의 데이터를 다운로드하여 NCBI 데이터베이스를 형성한다. 2014년 캘리포니아 주 아버클의 침수된 논에서 14주 동안 재배된 쌀 식물의 뿌리근류, 뿌리근, 내구 미생물군유전체 데이터를 선택한다.
   참고: 뿌리 부피, 뿌리 부동 및 내구 미생물군유전체 데이터는 인가 PRJNA386367에서 OTUs 테이블에 의해 제시되었다.

2. 최적의 전력 값 결정

참고: WGCNA 패키지에는 다음 기능 매개 변수가 모두 포함되어 있습니다. WGCNA는 가중 상관 네트워크 분석을 위한 R 패키지입니다. 키 명령줄은 보충 S1을참조합니다.

1. R 언어 환경에서Rstudio 소프트웨어를 열고 WGCNA 패키지를 설치합니다.
2. 데이터를 로드하고 goodSamplesGenes 함수를 사용하여 데이터의 정확성을 확인합니다. 명령줄을 실행합니다.
   "gsg = 좋은 샘플 유전자 (datExpr0, 자세한 = 3)
   gsg$allOK"
   실행 실행을클릭합니다.
3. 이상값을 확인하고 요구 사항을 충족하는 샘플을 저장합니다. 검사 결과가 TRUE인 경우 다음 단계로 계속 이동합니다. 결과를 저장합니다.
4. PickSoftThreshold 함수를 사용하여 서로 다른 전력 값아래 데이터의 두 그룹의 저울 없는 인덱스 R^2를 계산합니다. 명령줄을 실행합니다.
   "sft = 픽소프트문턱(datExpr0, 파워벡터 = 파워, 자세한 = 5)"
   실행 실행을클릭합니다.
5. 결과를 시각화합니다(그림1). 명령줄을 실행합니다.
   "플롯(sft$fitIndices[,1], -sign(sft$fitIndices[,3])*sft$fitIndices[,2],
   xlab="소프트 임계값(전원)", ylab="스케일 프리 토폴로지 모델 핏, 서명된 R^2", 유형="n",
   메인 = 붙여 넣기 ("독립"ES_Scale));
   텍스트(sft$fitIndices[,1], -sign(sft$fitIndices[,3])*sft$fitIndices[,2],
   레이블 =힘, cex=cex1, col="빨간색");
   abline(h=0.9, col="빨간색")
   플롯 (sft$ fitIndices[,1], sft$fitIndices[,5],
   xlab="소프트 임계값(전원)", ylab="평균 연결성", 유형="n",
   메인 = 붙여넣기("연결 ES_Mean"))
   텍스트(sft$fitIndices[,1], sft$fitIndices[,5], 라벨=파워, cex=cex1, col="red")"
   실행 실행을클릭합니다.
   참고: 가중 상관 관계 네트워크 알고리즘의 전제는 확립된 공동 발현 네트워크 구조가 스케일 프리 토폴로지 기준의 표준을 준수하여 견고성을 증가시키는 것입니다. 1에 가까운 확장없는 인덱스는 확장이 없는 네트워크에 가까운 네트워크 구조를 나타냅니다.
6. 스케일 프리 인덱스 R^2가 0.9보다 큰 제곱할 때 전력 값을 선택하고 다음 분석 단계로 진행합니다.
   참고: 스케일 프리 인덱스가 1에 가까울 때 네트워크 구조는 스케일 프리 네트워크에 더 가깝습니다. 두 개 이상의 네트워크를 분석할 때, 각 네트워크를 확장없는 네트워크의 전력 값에 가깝게 만들어 공동 표현 된 네트워크 간의 비교가능성을 충족하도록 선택해야 합니다.

3. 공동 식 네트워크 및 모듈 식별의 건설

참고: 위의 계산된 전력 값을 기반으로 공동 발생 네트워크가 구성됩니다. 키 명령줄은 보충 S2를참조합니다.

1. WGCNA 패키지의 인자 기능을 사용하여 기호 공동 발생 네트워크 구성을 위한 서명된 매개 변수를 추가합니다. 명령줄을 실행합니다.
   "인접 = 인접성(datExpr0, 전력 = 소프트 파워)"
   실행 실행을클릭합니다.
2. TOM 유사성 함수를 적용하여 토폴로지 중복 네트워크를 개발하고 유사성 네트워크를 계산합니다. 명령줄을 실행합니다.
   "TOM = TOM유사성(인자)
   dissTOM = 1-TOM"
   실행 실행을클릭합니다.
   참고: 서명된 매개 변수가 추가되어 토폴로지 중복 네트워크 유형을 설정했습니다.
3. hclust 함수를 사용하여 계층 클러스터링을 위한 평균 연결 계층 클러스터링 방법을 선택합니다. 명령줄을 실행합니다.
   "geneTree = hclust (dissTOM으로), 방법 = "평균");"
   실행 실행을클릭합니다.
4. cutreeDynamic 함수를 사용하여 동적 분기 절단을 수행하고 minClusterSize 매개 변수를 30으로 설정합니다. 모듈 인식 결과를 가져옵니다. 명령줄을 실행합니다.
   "다이내믹 모드 = 큐트리다이내믹(덴드로 = geneTree), distM = dissTOM, 딥스플리트 = 2, pamRespectsDendro = FALSE, minClusterSize = minModuleSize);"
   실행 실행을클릭합니다.
   참고: 최소 모듈 크기는 30보다 낮을 수 없습니다.
5. 모듈Eigen 함수에 의해 각 OtUs 모듈의 모듈 아이젠을 계산합니다. 명령줄을 실행합니다.
   "MEList = 모듈 아이젠젠 (datExpr0, 색상 = 동적 색상)
   MEs = MEList$eigengenes"
   실행 실행을클릭합니다.
   참고: 모듈 eigen은 모듈의 전체 OTU 식 수준을 나타냅니다. 특정 OTU가 아니라 단일 네트워크 값 분해에 의해 얻어진 각 클러스터의 첫 번째 주성분이었다.
6. 모듈 eigen의 상관 계수를 기반으로 클러스터 함수를 수행합니다. 병합닫기 모듈 함수를 사용하여 모듈을 0.25보다 낮은 값으로 병합합니다. 명령줄을 실행합니다.
   "병합 = 병합클로즈모듈(datExpr0, 동적색상, 컷하이트 = MEDissThres, 자세한 내용 = 3)"
   실행 실행을클릭합니다.
7. 마지막으로, 각 공동식 네트워크의 모듈 할당 디스플레이 다이어그램을 얻기 위해 시각화를 위한 플롯DendroAndColors 함수를사용합니다(그림 2). 테이블 함수를 사용하여 각 OTin 모듈 할당 테이블에 해당하는 모듈 기여도를 추출합니다. 명령줄을 실행합니다.
   "플롯덴드로앤컬러스(geneTree, 병합색상, "병합된 동적", dendroLabels = FALSE,
   hang = 0.03,addGuide = TRUE, guideHang = 0.05,
   메인 = "ES_Gene 덴드로그램 및 모듈 색상")"
   실행 실행을클릭합니다.
   참고: 공동 표현 네트워크의 모듈 할당 다이어그램에서 다른 색상은 서로 다른 모듈을 나타내고 회색은 모듈로 분류할 수 없는 OtUs를 나타냅니다. 회색 모듈의 더 많은 수의 OtUs는 표현행렬의 초기 단계 전처리 품질이 좋지 않은 것을 나타냅니다.

4. 모듈 비교

참고: 이 방법은 두 생태 미생물 커뮤니티의 네트워크 모듈을 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 이 문서에서는 내구와 뿌리 부평면, 내구 및 뿌리 부피, 뿌리 부피 및 뿌리 부류 사이의 미생물 네트워크 모듈의 차이를 비교합니다.

1. 보존 테스트
   1. 이전 단계에 저장된 두 데이터 집합의 매개 변수 및 결과를 로드합니다.
   2. 다른 그룹이 테스트 그룹으로 있는 반면, 미생물 데이터 그룹의 네트워크 모듈 할당 결과를 참조 그룹으로 설정합니다.
   3. 모듈 보존 함수를 사용하여 Z_summary 및 중앙값의 보수적 통계 파라미터값을 계산합니다. 명령줄을 실행합니다.
      "system.time({mp=모듈 보존(멀티엑스프,
      멀티 컬러, 참조네트웍스=1,
      nPermutation=100, 랜덤시드=1, 퀵코르=0,verbose=3)}""
      실행 실행을클릭합니다.
      참고: 이 결과는 모듈 간의 보수적 성을 정량화할 수 있습니다. Z_summary>10은 두 모듈이 매우 보존된 반면 Z_summary<2는 보존되지 않은 모듈을 나타냅니다. medianRank는 순위에 의해 평가된 모듈의 상대적 보존을 표현합니다. 값이 높을수록 비보존 모듈을 나타냅니다. (키 명령줄은 보충 S3를참조하십시오.)
   4. 플롯 함수를 사용하여 결과를 시각화합니다(그림3). 매개 변수Z_summary 및 중앙값(표 1)을가져옵니다.
      참고: 2미만의 Z_summary 값과 상단의 중간 랭크 값을 모두 충족하는 네트워크 모듈은 두 생태 미생물 커뮤니티에서 가장 높게 보존되지 않은 모듈입니다.
   5. 앞서 언급한 두 개의 통계 적 매개 변수의 결과에 기초하여 두 네트워크의 가장 높게 보존되지 않은 모듈로 모듈을 식별합니다.
2. 모듈 멤버십의 상관 관계 분석
   1. 두 네트워크의 모듈 할당 결과를 각각 참조 및 테스트 그룹으로 설정했습니다.
      참고: 설정은 보존 테스트와 같아야 합니다.
   2. corPvalueStudent 함수를 사용하여 여러 후보 모듈에서 각 OTU의 kME(모듈 멤버십) 값을 추출합니다.
      명령줄을 실행합니다.
      "Pvalue = as.data.frame(corPvalueStudent(as.matrix)
      (모듈 멤버십), 샘플)"
      실행 실행을클릭합니다.
      참고 : kME는 모듈 멤버십의 정도를 의미합니다. ME는 모듈에서 전체 OTU 식 수준을 나타내는 모듈 eigen을 의미합니다. kME는 각 OTU와 ME 사이의 상관 관계 계수입니다. OTU의 kME 값으로 네트워크에서 OTU의 중요성을 정량화합니다. (키 명령줄은 보충 S4를참조하십시오.)
   3. 이어서, 두 네트워크에서 해당 OtUs의 kME 값의 상관 계수를 계산하고 상관 관계 분석 다이어그램(도4)을그리는 상사Scatterplot 함수를 사용합니다.
      명령줄을 실행합니다.
      "자세한 스캐터플롯(복근(T모듈 멤버십)
      [TmoduleGenes, Tcolumn]),
      복근(N모듈멤버십[N모듈유전자, Ncolumn]),
      xlab = 붙여 넣기 ("kME in", "ES"),
      ylab = 붙여 넣기 ("kME in", "RP"),
      메인 = 페이스트("밝은 노란색"),
      cex.main = 1.7, cex.lab = 1.6, cex.axis = 1.6, 콜 = 모듈색상)"
      실행 실행을클릭합니다.
   4. 두 네트워크의 OTU 값의 가장 작은 상관 관계 계수를 가진 모듈을 선택합니다. 이 모듈이 두 네트워크의 가장 큰 차이를 갖는 것으로 간주합니다.

5. 미생물 차동 네트워크 모듈 분석

1. 가장 큰 차이를 가진 모듈의 OTU 서열 세트의 통계 분석을 통해 지배적 인 박테리아 필라의 데이터를 얻을.
   참고: 가장 큰 차이를 가진 모듈의 OTU 서열 세트는 필라의 분류에 의해 합산됩니다. 지배적 인 박테리아 필라는 10 % 이상을 차지했습니다.
2. 그런 다음, 내보내기NetworkToCytoscape 함수를 사용하여 가장 큰 차동 모듈에서 OTU의 상호 작용 관계 정보를 포함하는 파일을 가져옵니다.
   명령줄을 실행합니다.
   "시트 = 수출네트워크토키토스케이프(modTOM,
   edgeFile = 붙여넣기("NEW-ES_CytoscapeInput-edges-", 모듈, ".txt", 9ep="),
   nodeFile = 붙여넣기("NEW-ES_CytoscapeInput 노드-", 모듈, ".txt", 9월="),
   가중 = TRUE,임계값 = 0.5, 노드 이름 = modProbes,
   altNodeName = modGenes, nodeAttr = 모듈색상[inModule])"
   실행 실행을클릭합니다.
3. 파일을 사이토스케이프로 가져옵니다. 임계값을 0.5로 설정하고 필요에 따라 다른 매개 변수를 조정합니다.
4. 차동 미생물의 상응발생망구축(도 5).
5. 네트워크에서 가장 중요한 규제 역할을 하는 핵심 속의 정보를 획득했습니다.
   참고: OUT의 kME 값에 따라 코어 속을 정의할 수 있습니다.
6. 마지막으로, 핵심 속의 기능을 평가하고 전체 차이 네트워크에 미치는 영향을 분석했습니다.

결과

이 문서의 대표적인 결과는 NCBI 데이터베이스(PRJNA386367)^9에서2014 캘리포니아 애버가 쌀 뿌리 미생물군유전체 데이터로부터 다운로드되었다. 이 데이터는 침수된 논에서 14주 동안 자란 쌀 식물의 뿌리부, 뿌리근, 내구 미생물군유전체 샘플을 포함한다. 우리는 WGCNA 알고리즘을 사용하여 스케일 프리네트워크(그림 1)에가까운 세 개의 네트워크를 만족시키는 ?...

토론

상관 관계 네트워크는 생물 정보학 응용 분야에서 점점 더 사용되고 있습니다. WGCNA는 생물학적^{계통(12)의}다양한 원소 간의 관계를 설명분석하기 위한 시스템 생물학 방법이다. R 소프트웨어 패키지는WGCNA^13,14,15의이전 작업에서 사용되었습니다. 이 패키지에는 네트워크 구성, 모듈 감지, 토폴로지 속성 계산, ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
R	The University of Auckland	version 4.0.2	R is a free software environment for statistical computing and graphics. It compiles and runs on a wide variety of UNIX platforms, Windows and MacOS.
RStdio	JJ Allaire	version 1.4.1103	The RStudio IDE is a set of integrated tools designed to help you be more productive with R and Python.
Cytoscape		version 3.7.1	Cytoscape is an open source software platform for visualizing complex networks and integrating these with any type of attribute data.
NCBI database			The National Center for Biotechnology Information advances science and health by providing access to biomedical and genomic information.