환자 유래 오가노이드를 사용한 중간 처리량의 약물 및 방사선 요법 스크리닝 분석

요약

중간 처리량 치료 민감도 스크리닝을 위해 환자 유래 오가노이드를 사용하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 시험된 치료법에는 화학 요법, 방사선 요법 및 화학 방사선 요법이 포함됩니다. 아데노신 삼인산 수치는 기능적 판독값으로 사용됩니다.

초록

환자 유래 오가노이드(PDO) 모델은 3차원으로 성장하고 거의 네이티브 상태로 자란 일차 상피 세포의 장기 확장 및 유지를 가능하게 합니다. 절제 또는 생검된 종양 조직에서 유래한 오가노이드는 in vivo 종양 형태를 밀접하게 재현하며 in vitro 치료 반응을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.종양 오가노이드의 바이오뱅크는 다양한 임상 종양과 환자를 반영하므로 전임상 및 임상 응용 분야에 큰 가능성을 가지고 있습니다. 이 논문은 두경부 편평세포암과 결장직장 선암종 오가노이드를 사용한 중간 처리량의 약물 스크리닝 방법을 제시합니다. 이 접근법은 정상 및 질환을 포함한 모든 조직 유래 오가노이드 모델과 함께 사용하기 위해 쉽게 채택할 수 있습니다. 오가노이드를 화학요법 및 방사선요법에 체 외 로 노출하는 방법(단일 치료 방식 또는 조합)에 대한 방법이 설명되어 있습니다. 약물 노출 5일 후 세포 생존율은 아데노신 삼인산(ATP) 수치를 측정하여 평가합니다. 약물 감수성은 절반 최대 억제 농도(IC₅₀), 곡선 아래 면적(AUC) 및 성장률(GR) 메트릭으로 측정됩니다. 이러한 매개변수는 오가노이드 배양이 특정 치료에 민감하거나 내성이 있는 것으로 간주되는지에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

서문

성체 줄기세포에서 확립되고 3차원(3D) 세포외 기질(ECM) 및 특정 성장 인자 칵테일(HUB 오가노이드라고도 함)에서 성장한 오가노이드 모델은 전임상 종양학 스크리닝 플랫폼으로 주목받고 있습니다. 환자 유래 오가노이드(PDO) 배양은 정상 조직 생검과 질병 조직 생검 모두에서 1-2주 이내에 확립할 수 있으며 최소 1-2개월에서 최대 무제한까지 확장할 수 있습니다. 냉동 보존을 통해 잘 특성화된 배양을 장기간 사용할 수 있습니다. 클론 유래된 기존의 2차원 세포주 모델과 달리, PDO 모델은 표현형적으로나 유전적으로 원래의 종양 조직을 밀접하게 재현하고 종양 이질성을 보존합니다. PDO에 대한 중간 처리량의 약물 스크리닝은 광범위한 치료법을 테스트하여 맞춤형 의약품을 위한 고유한 플랫폼을 제공합니다.

이전 연구에서는 다양한 유형의 종양에서 확립된 모델에서 치료 스크리닝, 특히 약물 및 방사선 요법을 위한 오가노이드 모델의 사용을 설명하고 오가노이드의 예측 잠재력이 임상적 의사 결정을 안내하는 데 도움이 되는 잠재력을 보여줍니다 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . 이 논문은 중간 처리량 용량에서 PDO를 사용한 종양 요법 스크리닝 방법을 설명합니다(그림 1A). 이 프로토콜은 반자동화(semi-automation)를 통해 384웰 플레이트 형식으로 설정되며, 최대 8개의 오가노이드 모델, 16개의 화합물 및 최대 8개의 384웰 플레이트에 대한 치료 테스트가 가능합니다. 복합 약물 스크리닝 외에도 이 논문은 방사선 요법 감도 및 감작을 분석하는 방법에 대해서도 설명합니다. 또한 약물 스크리닝을 완전 자동화로 업스케일링하기 위한 고처리량 로봇의 사용에 대해 논의합니다. 중요한 것은 서로 다른 조직의 오가노이드는 다른 매체와 다른 취급이 필요할 수 있다는 것입니다.

여기에서는 일반적인 약물 스크리닝 분석 프로토콜에 대해 설명하며, 이는 관심 있는 오가노이드에 따라 조정이 필요할 수 있습니다. 최적화를 위한 시작점 및 제안 사항뿐만 아니라 실험 설정 및 오가노이드 실습에 대한 일반적인 권장 사항도 논의에 포함되어 있습니다. 일반적으로 조밀한 형태를 가질 수 있는 두경부 편평 세포 암종(HNSCC) 오가노이드와 낭성 또는 조밀한 형태를 가질 수 있는 대장암(CRC) 오가노이드를 예로 들 수 있습니다. 1차 오가노이드 확립 및 팽창 배양 방법은 이 프로토콜에서 다루지 않습니다. 기본 오가노이드 기술의 경우 독자는 다른 프로토콜(예: ¹²)을 참조해야 합니다. 이 시각적 프로토콜은 오가노이드 모델을 사용한 중간 처리량의 약물 스크리닝 프로세스에 대한 통찰력을 제공합니다.

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프로토콜

참고: 이 프로토콜을 사용하기 전에 해당 기관의 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따르고 있는지 확인하십시오. 이 프로토콜에 설명된 환자 조직 및 데이터 수집은 EUREC 지침과 유럽, 국가 및 지역 법률에 따라 수행되었습니다. 모든 오가노이드는 동의한 환자로부터 파생되었으며 동의는 언제든지 철회할 수 있습니다.

1. 상영 전

1. 정상 세포 과증식 가능성을 배제하기 위해 새로 확립된 모델(예: 조직학 및/또는 DNA 염기서열분석 ^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11})의 동일성을 확인하고, 종양 오가노이드 배양에 대해 약물 스크리닝이 수행되는지 확인합니다(그림 2D).
2. 논의 섹션에 제공된 일반 권장 사항을 활용하여 실험용 플레이트 설정을 설계합니다( 보충 그림 S1의 예 참조).
3. 필요한 오가노이드 수를 계산하고 0일차에 분리할 수 있는 충분한 오가노이드를 준비합니다( 표 1 을 참조로 사용).
   참고: 오가노이드 유형 및 모델의 GR에 따라 각 전체 384웰 스크리닝 플레이트에 대해 약 1-2개의 전체 6웰 플레이트가 필요합니다. 지침으로, 6웰 플레이트의 전체 웰 하나에는 ±20,000개의 낭포성 오가노이드 또는 최대 50,000개의 조밀한/포도 같은 오가노이드가 포함되어 있습니다.
4. 셀 디스펜서가 리포터 염료를 사용하여 보정되었는지 확인하고 필요한 경우 제조업체의 프로토콜에 따라 보정합니다.

2. 시약 준비

1. 기본 매체 준비: 고급 DMEM/F12+++(aDF+++). 1x L-글루타민 대체물(v/v) 5mL, 1M 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진 에탄술폰산(HEPES) 및 100U/mL 페니실린/스트렙토마이신을 각각 5mL를 고급 DMEM/F12 500mL 병에 추가합니다. aDF+++를 4°C에서 최대 1개월 동안 유지하십시오.
2. 사용 중인 오가노이드 유형에 적합한 오가노이드 확장(즉, 성장) 배지를 준비합니다 ^9,10.
3. 실험 설정에 따라 팽창 배지와 다를 수 있는 스크리닝 배지를 준비합니다. 오가노이드 분주 후 회복을 돕기 위해 5μM의 Rho kinase(ROCK) 억제제(Y-27632)를 스크리닝 배지에 추가합니다.
4. aDF+++에서 Dispase II의 100mg/mL 용액을 준비합니다.
   참고: dispase의 100x 용액은 -20°C에서 2개월 동안 안정적입니다.

3. Day 0: 오가노이드 준비

참고: 아래에 표시된 부피는 1200μL의 오가노이드/ECM(웰당 200μL 오가노이드/ECM)에 해당하는 완전히 잘 자란 6웰 플레이트의 오가노이드에서 시작합니다.

1. 명시야 현미경을 사용하여 오가노이드의 감염 가능성, 밀도 및 일반적인 외관을 검사합니다. 패시징하기 전에 참조용으로 모든 모델의 이미지를 촬영합니다.
2. 다음 단계에 따라 오가노이드와 씨앗을 통과시킵니다. 실온에서 다음 단계를 수행하여 오가노이드 온도 변동을 줄입니다. 오가노이드 현탁액을 취급할 때마다 저유지량 팁 또는 사전 습윤된 피펫 및 플라스틱을 사용하여 오가노이드의 손실을 방지하십시오.
   1. 더 많은 양의 ECM/오가노이드(>1200 μL의 ECM)를 사용하는 경우, ECM에서 오가노이드 제거를 돕기 위해 다음과 같이 디스페이스를 사용한 ECM 분해를 고려하십시오.
      참고: Discase는 ECM을 분해하지만 오가노이드에는 영향을 미치지 않습니다.
      1. 선택 사항: 각 웰에 1mg/mL dispase를 추가하고 평소와 같이 계대성 배양하기 전에 37°C 인큐베이터에서 30분 동안 오가노이드를 배양합니다.
         참고: 디스플레이는 중간 구성 요소에 의해 비활성화되지 않으므로 추가된 디스플레이 부피의 20배 이상으로 씻어내십시오(aDF+++ 사용).
   2. 3개의 15mL 튜브(튜브당 최대 400μL의 ECM)에 오가노이드를 수집합니다. aDF+++를 12mL까지 주입하고 85 × g의 RT에서 5분 동안 원심분리합니다. 적절하게 펠릿화되면 상층액을 흡인합니다. 오가노이드가 명확하게 펠릿화되지 않은 경우 추가로 5분 동안 더 빠른 속도(최대 450× g, 오가노이드 유형 및 크기에 따라 다름)로 원심분리합니다. 펠릿을 다시 현탁시키고 세척을 반복합니다.
      알림: 펠릿 위의 유리와 같은 층은 ECM의 존재를 나타냅니다. 명시야 현미경을 사용하여 ECM에 오가노이드가 갇혀 있지 않은지 확인하고(포획된 오가노이드의 수가 적을 수 있음) p1000 피펫으로 나머지 ECM을 조심스럽게 제거합니다. ECM에 오가노이드가 (너무) 많이 존재하는 경우, dispase dissociation 단계를 반복하거나 펠릿을 세척하고 더 빠른 속도(최대 450 × g)로 회전합니다.
   3. 각 15mL 튜브에 대해 오가노이드 펠릿을 1mL의 aDF+++에 재현탁시키고 적절한 크기에 도달할 때까지 오가노이드를 조심스럽게 해리합니다. 유형/형태에 따라 규칙적인 분할에 사용되는 해리 방법을 사용합니다(표 1).
      1. 낭포성 및 포도 같은 오가노이드의 경우, p2 팁이 위에 있는 p1000으로 위아래로 피펫팅하거나 팁이 화염에 의해 좁아진 미리 젖은 유리 막힌 파스퇴르 피펫으로 기계적으로 절단하여 작은 조각(<100μm)으로 깎습니다.
         참고: 오가노이드가 화면의 크기 범위보다 작거나 범위 내에 있도록 5회마다 위아래로 피펫팅한 후 명시야 현미경을 사용하여 오가노이드 중단을 확인합니다(표 1).
      2. 고밀도 오가노이드의 경우, aDF+++에 TrypLE의 50% v/v 용액 1mL를 첨가하여 세포 펠렛을 재현탁시키고 37°C에서 최소 2분 동안 배양합니다. 그런 다음 튜브를 위아래로 세게 흔들고 명시야 현미경으로 확인합니다. 위와 동일한 접근 방식을 사용하여 피펫으로 오가노이드를 기계적으로 파괴하고 공정 전반에 걸쳐 현미경으로 지속적으로 확인합니다. HNSCC 오가노이드의 경우 TrypLE의 100% 용액에서 5분 동안 배양합니다.
         참고: 배양 유형에 따라 작은 그룹의 세포(예: CRC 오가노이드, >20μm) 또는 단일 세포(예: HNSCC 오가노이드)를 목표로 합니다. 단백질 분해 배양이 15분을 초과하지 않도록 하면 오가노이드 생존력에 영향을 미칠 수 있습니다.
   4. 오가노이드를 10mL의 aDF+++로 세척합니다. 오가노이드를 85×g에서 5 분 동안 회전 시킵니다. 적절하게 펠릿화되면 상등액을 흡입하십시오. 또는 오가노이드를 펠릿화하기 어려운 경우 최대 450× g 까지 5분 동안 원심분리합니다.
   5. 50% 팽창 매체/50% ECM에서 고밀도로 오가노이드를 시드합니다(섹션 4의 ECM에서 쉽게 제거할 수 있음). 일반 분할과 비교하여 약 두 배의 밀도를 목표로 하며, 이는 종종 1:1 분할을 초래합니다( 그림 1의 예 참조). 예열된 6-well 플레이트의 10 μL 액적(웰당 총 200 μL)에 오가노이드를 파종합니다.
      알림: 예열된 플레이트를 37°C의 인큐베이터에서 하룻밤 동안 보관하거나 60°C 오븐에서 최소 1시간 동안 보관하여 ECM의 빠른 응고를 보장하고 ECM 확산을 방지하여 적절한 반구 돔 형성을 보장합니다.
   6. 플레이트를 뒤집어 37분 동안 30°C 인큐베이터에 다시 넣습니다.
   설정할 ECM입니다. 30-60분 후 팽창 매체(실온)를 웰에 부드럽게 추가합니다.

4. 2일차(범위: 1일 - 3일차): 오가노이드 분주

참고: 오가노이드 GR에 따라 1일 또는 3일째에도 발생할 수 있습니다. 약물 스크리닝 전반에 걸쳐 오가노이드는 현탁액 상태로 유지됩니다. 이를 위해 오가노이드 성장이 유지되는 낮은 농도의 ECM(5-10%)으로 분배되지만 ECM의 응고는 발생하지 않습니다. 이를 통해 자동 분주, 최적의 오가노이드-화합물 상호 작용 및 재현 가능한 세포 용해가 가능하지만 배지를 변경할 수 있는 기회도 제한됩니다.

1. 약물 스크리닝에 필요한 오가노이드 현탁액의 농도와 양을 계산합니다.
   1. 사용 중인 셀 디스펜서에 따라 계산 중 데드 볼륨을 고려하십시오.
      참고: 웰당 40μL의 오가노이드 현탁액을 분주할 때 384 플레이트 1개에는 총 15.4mL의 부피가 필요합니다. 평균적으로 각 Multidrop cell 디스펜싱 튜브의 데드 볼륨은 ~1mL이므로 모든 노즐을 사용할 때 8mL의 데드 볼륨이 발생합니다. 그 결과 전체 384웰 플레이트에 대해 각 오가노이드 모델에 대해 총 23.4mL가 생성됩니다. 따라서 25mL의 오가노이드 현탁액을 준비하면 디스펜싱에 충분한 오가노이드를 확보하고 선택적 후속 조치(단일 뉴클레오티드 다형성, SNP) 분석을 수행할 수 있습니다(4.4.7 참조).
2. 오가노이드 채취 준비
   1. 세척 완충액을 준비하기 위해 ROCK 억제제(Y-27632)를 aDF+++에 최종 농도 10μM까지 추가합니다(스크리닝할 각 오가노이드 배양액에 대해 ±100mL가 필요함).
   2. 명시야 현미경을 사용하여 모든 웰의 오가노이드를 검사하여 계대 배양 후 오가노이드 회수율을 평가하고 잠재적인 감염을 배제합니다. 현미경 이미지를 촬영하고 디지털 스케일 바를 사용하여 오가노이드를 측정하여 오가노이드의 크기가 올바른지 확인합니다(표 1).
      참고: 오가노이드가 올바른 크기가 아닌 경우(너무 크거나 너무 작음) 여과 과정에서 손실되며 약물 스크리닝을 수행하기에 충분한 재료가 없을 수 있습니다. 이 경우 약물 검사를 연기하는 것이 좋습니다.
   3. 각 웰에 1mg/mL dispase를 추가하고 ECM을 분해하기 위해 30-60분(최대 120분) 동안 인큐베이터의 37°C에서 배양합니다. 현미경으로 ECM 해리의 진행 상황을 확인하여 ECM의 입자가 떠 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 소화가 완료되면 쉽게 벗겨질 수 있는 ECM의 물방울 위로 웰의 내용물을 피펫으로 바르십시오.
3. 다음 단계에 따라 384웰 플레이트에 분주할 오가노이드를 준비합니다. 실온(원심분리 포함)에서 다음 단계를 수행하여 오가노이드 온도 변동을 줄입니다.
   1. p1000 피펫을 사용하여 배양 플레이트에서 오가노이드 현탁액을 수집합니다.
   2. 필요한 필터 단계(오가노이드 유형에 따라 표 1 참조)에 따라 해당 단계를 따릅니다.
      참고: 세척 버퍼가 있는 사전 습윤 필터는 오가노이드가 필터에 부착되는 것을 방지하는 데 필수적입니다.
      1. 모든 작은 단편과 단일 세포를 포함할 때( 예: HNSCC 종양 오가노이드, 70μm < 오가노이드에 대한 필터링) 단일 필터링을 수행합니다. 수확된 오가노이드를 15mL 튜브에 넣고 12mL의 세척 버퍼로 두 번 세척합니다. 사전 습윤된 70μm 필터를 통해 오가노이드를 50mL 튜브에 여과하고 3 x 4mL의 aDF+++로 세척한 다음 15mL 튜브로 옮깁니다. 부피가 너무 높으면 85 × g 에서 5 분 동안 회전하고 12mL의 aDF +++에 펠릿을 15mL 튜브로 옮깁니다. 4.3.3으로 진행합니다.
      2. 잔해물 및 대형 오가노이드를 제거하기 위한 이중 필터링을 수행합니다( 예: CRC 종양 오가노이드의 경우 >100μm 및 <20μm 오가노이드를 필터링합니다). 수확된 오가노이드를 사전 습윤된 100/70/40μm 필터(표 1)를 통해 50mL 튜브에 즉시 여과하고 2 x 10mL의 세척 버퍼로 필터를 세척합니다. 오가노이드의 6웰 플레이트에서 3개의 웰당 1개의 사전 습윤 20μm 필터를 사용합니다. 20μm 필터에서 <100μm 오가노이드를 필터링하고 2 x 10mL의 세척 버퍼로 필터를 세척합니다. 깨끗한 50mL 튜브 위에 필터를 뒤집어 놓고 3 x 4mL의 aDF+++로 세척하여 오가노이드를 회수합니다. 오가노이드 현탁액을 15mL 튜브로 옮깁니다. 부피가 >15mL인 경우(더 많은 필터 세척이 필요할 수 있음) 85× g 에서 5분 동안 회전하고 12mL aDF+++의 펠릿을 15mL 튜브로 옮깁니다.
         참고: 필터에 갇힌 오가노이드는 나중에 사용하기 위해 회수할 수 있습니다(패시징). 다음 단계에서는 100μm< 오가노이드가 사용됩니다. 필터를 통과한 세포와 파편은 폐기되며, 필터에 걸린 오가노이드(>20μm, <100μm)는 스크리닝에 사용됩니다.
   3. 450 ×g에서 3 분 동안 원 심분리기를 하고 상층액을 조심스럽게 흡입합니다. 펠릿을 1mL의 스크리닝 배지에 조심스럽게 재현탁하고, 다른 1-9mL 배지(펠릿 크기에 따라 다름, ~75-150 오가노이드/10μL 달성을 목표로 함)를 보충하고, 미리 적신 혈청학적 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 재현탁합니다.
      참고: 스크리닝 배지에 5μM의 ROCK 억제제를 추가하는 것이 좋습니다.
   4. 미리 적신 혈청학적 피펫 5x로 위아래로 피펫팅하여 오가노이드 현탁액을 철저히 혼합하고, 페트리 접시에 라인을 피펫팅하고 현미경으로 계수하여 현탁액의 10μL에 있는 오가노이드 수를 계산합니다. 더 작은 오가노이드(<70 μm)의 경우, 혈구계 그리드가 있는 10개의 챔버 슬라이드에 10 μL의 오가노이드 현탁액을 추가하고 오가노이드의 수를 계산합니다. 제조업체의 지침에 따라 오가노이드/mL의 수를 계산합니다.
   5. 얼음-저온 스크리닝 배지에 5%(v/v) ECM을 추가하여 필요한 양의 디스펜싱 매체를 준비합니다(예: 25mL의 디스펜싱 매체의 경우 23.75mL의 얼음-저온 스크리닝 배지에 1.25mL의 ECM 추가). ECM이 응고되는 것을 방지하기 위해 얼음처럼 차가운 매체에만 ECM을 추가하십시오. 여러 오가노이드 모델을 스크리닝할 때 모든 모델에서 ECM %의 일관성을 보장하기 위해 분배 매체를 대량으로 준비합니다.
   6. 새 15mL 튜브에 필요한 수의 오가노이드(지침 및 참고 사항은 표 1 참조)를 추가하고 450 ×g에서 3 분 동안 원 심분리합니다. 펠릿을 방해하지 않고 조심스럽게 흡입하고 p200 피펫으로 100μL의 스크리닝 배지에 펠릿을 완전히 재현탁합니다. 펠릿이 균질하고 오가노이드 덩어리 없이 완전히 재현탁되는지 확인하십시오. 그런 다음 필요한 양의 얼음처럼 차가운 디스펜싱 매체로 현탁액을 채우고 이제부터 오가노이드 현탁액을 얼음 위에 유지합니다.
4. 세포 디스펜서(예: Multidrop)를 사용하여 오가노이드를 384웰 플레이트로 분주합니다.
   1. 웰당 40μL의 세포 현탁액을 분주하도록 셀 디스펜서를 설정합니다.
      1. 메인 메뉴 | 플레이트 유형 선택 | 확인 | 384 표준 | 그래
      2. 카세트 타입: 표준 튜브 카세트(오른쪽) | 위쪽 및 아래쪽 화살표(40 μL)를 사용하여 부피를 선택합니다.
      3. 플레이트 레이아웃에 따라 Full plate 또는 Columns를 선택합니다.
   2. 튜브를 70% 에탄올(EtOH)로 세척한 다음 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척합니다. 세척 당 >15 mL를 사용하십시오. 각 세척의 시작과 끝을 시각화하기 위해 각 유체 사이에 약간의 공기를 허용합니다. 모든 디스펜싱 헤드가 '스트레이트'로 디스펜싱되는지 확인하고 그렇지 않은 경우 다시 세척하십시오.
   3. Settings 메뉴에서 pre-dispense를 선택하고 60 μL로 설정하여 프라임 후 및 분주 전에 오가노이드 현탁액을 pre-dispense합니다.
   4. 디스펜서를 오가노이드 현탁액으로 프라이밍하고 현탁액을 얼음 위에 유지합니다. p1000 피펫으로 지속적으로 피펫팅하여 다시 부유합니다. 용액에서 기포가 생성되지 않도록 주의하십시오. 프라이밍되고 플레이트가 제자리에 놓이면 Start를 눌러 오가노이드를 분배합니다.
      참고: 이 단계는 두 사람이 함께 하면 더 쉽게 수행할 수 있습니다: 한 사람은 다시 서스펜션하고 다른 한 사람은 디스펜서를 작동합니다.
   5. 필요한 경우, 스크린에 포함된 각 오가노이드 모델에 대해 추가 스크리닝 플레이트에 최소 5개의 웰을 더 분주합니다.
      참고: 이렇게 하면 나중에 T=0 판독이 가능합니다(섹션 7 및 토론 참조). 이 디스펜싱은 원하는 경우 수동으로 수행할 수도 있습니다.
   6. 우물의 오염을 방지하기 위해 즉시 플레이트의 뚜껑을 교체하십시오. 현미경으로 모든 웰이 올바르게 채워졌는지, 오가노이드가 플레이트 전체에 균등하게 분포되어 있는지 확인합니다.
   7. 필요한 경우, 도금이 완료되면 튜빙에서 오가노이드 현탁액을 회수하고( 비어 있음(Empty) 클릭) 나머지 오가노이드를 스핀다운합니다. 1.5mL 튜브로 옮기고 추후 SNP 분석을 위해 급속 동결합니다.
      참고: 분주 중 공기가 튜브에 들어갔을 때 일부 웰이 올바르게 채워지지 않은 경우 웰당 40μL를 추가하여 웰을 수동으로 채웁니다.
   8. 여러 오가노이드 모델을 분주한 경우 PBS, EtOH 및 PBS로 튜브를 헹구고 각 모델에 대해 4.4.4-4.4.8단계를 반복합니다.
   9. 약물 분주 준비가 될 때까지 플레이트를 37°C 인큐베이터에서 5% CO₂ 대기로 옮깁니다. 서로 다른 플레이트 간의 공기 교환 차이를 제거하려면 인큐베이터에 플레이트를 쌓지 마십시오.
   10. 가능한 한 빨리 PBS와 EtOH로 튜브를 청소하십시오. 시스템을 통해 공기를 흐르게 하여 튜브를 완전히 건조시키십시오.

5. 2일차(범위: 1일차 - 3일차): 약물 디스펜서(예 : D300e)를 사용한 약물 조제

메모:. 연구 질문에 따라 약물 프린팅은 파종 후 하루 후에 수행할 수도 있습니다.

1. 약물 디스펜서 설정
   1. 디스펜서 소프트웨어를 시작하고 Plate 1 을 강조 표시하고 연필 도구를 선택하여 플레이트 편집기를 불러와 화면에 사용되는 원하는 플레이트 형식을 선택합니다.
   2. 플레이트 유형을 선택하고 각 웰의 추가 부피(플레이트에 이미 있는 액체(오가노이드 현탁액)의 부피)를 설정합니다. 384-well 형식의 경우 40 μL/well을 사용합니다.
   3. 왼쪽 막대에서 + 기호를 사용하여 화면에 사용할 각 약물 용액을 추가합니다.
   4. 연필 도구를 선택하여 각 유체를 편집합니다. 약물 이름, 약물 등급(예: DMSO 기반 또는 수성(예: 물, PBS)) 및 약물의 재고 농도를 편집합니다.
      참고: 각 약물의 원료 농도가 10mM를 초과하지 마십시오. 이상적으로 용매의 최대 농도는 DMSO의 경우 0.8%, PBS의 경우 3%/0.3% 세제(예: Tween)여야 합니다(아래 정규화 및 논의 참조).
   5. 프로그램에 모든 약물이 추가되면 플레이트 레이아웃에서 웰을 강조 표시하고 드래그하여 약물을 추가할 웰을 선택합니다. 선택한 wells를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 농도를 추가합니다.
      1. 각 약물의 원하는 농도(μM)를 정의하는 값을 설정합니다.
      2. 적정의 경우, 각 약물의 원하는 최고 및 최저 농도(μM), 분포(대수 또는 선형), 수준별 반복(예: 3) 및 적정 패턴을 정의합니다.
      3. 표적 적정을 위해 각 약물의 최고 및 최저 농도, 분포(로그 또는 선형), 목표 농도(μM), 표적 영역(수준), 목표 범위(로그), 수준당 반복(예: 3) 및 적정 패턴을 정의합니다.
   6. 모든 약물 웰을 적절한 용매(예: DMSO 또는 수성 + Tween-20)로 정규화합니다. 수용액에 용해된 약물의 경우 Tween-20(약물 원료의 최종 농도 0.3%)을 추가하여 D300e를 사용하여 분배하기 위한 약물 용액의 적절한 표면 장력을 보장합니다(5.2.6 참조). 약물이 없는 웰(negative control)을 포함한 모든 웰을 선택하고, 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고, Normalization을 선택한 다음 Normalize를 선택합니다. 적절한 용매를 선택하고 Normalize to highest class volume(최고 등급 부피로 정규화 )을 선택하여 선택한 약물의 최고 농도로 정규화합니다.
      참고: 이제 검은색 삼각형이 각 웰의 왼쪽 하단 모서리에 나타나 정규화를 확인합니다. 사용되는 각 약물 용매에 대해 최소 6개(이상적으로는 >9)의 음성 대조군 웰을 갖는 것을 목표로 합니다.
   7. 배양물에 따라 스타우로스포린과 같은 알려진 세포독성 시약을 양성 대조군(1-5μM)으로 사용하려면 최소 3개의 웰(이상적으로는 >6)을 선택합니다. positive control의 세포독성 농도를 알 수 없는 경우, positive control well의 모든 오가노이드를 kill 하는 고농도를 선택합니다.
      참고: 또는 Navitoclax(20μM)를 사용하여 약물 스크리닝 중 오가노이드 사멸을 보장할 수 있습니다.
   8. 플레이트 레이아웃이 완료되면 왼쪽 상단 모서리에 있는 실행 (기계가 켜져 있는 경우)을 선택합니다. 계속하려면 프로토콜을 저장하십시오.
      참고: 이 프로그램은 이제 조제에 필요한 각 약물의 부피를 계산했습니다. 여기에는 피펫팅 오류가 포함되므로 이는 전체 프로토콜에 필요한 정확한 약물 양입니다. 선택 사항: 시뮬레이션 을 선택하면 약물을 추가하지 않고 전체 프로토콜을 시뮬레이션하여 프로토콜이 어떻게 실행되는지 관찰할 수 있습니다. 실행 모드와 시뮬레이션 모드 모두에서 각 웰에 추가된 약물의 시간, 순서 및 양을 문서화하는 보고서가 생성됩니다. 이는 프로토콜이 올바른지 확인하고 실험을 진행하기 전에 필요한 카세트의 정확한 부피와 수를 결정하는 데 유용할 수 있습니다.
2. 의약품 준비 및 인쇄
   1. D300e를 사용하여 분주하기 위한 약물 용액의 적절한 표면 장력을 보장하기 위해 수성(예: 물 또는 PBS) 약물 스톡에 0.3%(v/v) Tween-20을 추가합니다. Tween-20 농도가 3% PBS/0.3% Tween-20(v/v)을 초과하지 않는지 확인하고 Tween-20의 최종 농도를 0.01% 미만으로 유지합니다.
      참고: 의약품 프린터 카세트에 Tween-20을 추가하기 직전에만 Tween-20을 첨가하십시오. DMSO에 용해된 약물에는 이 단계가 필요하지 않습니다. 그러나 각 웰에서 DMSO의 최종 비율이 0.8-1%를 초과하지 않는지 확인하십시오.
   2. D8+ 저용량 및 D4+ 대용량 카세트를 모두 준비하십시오. 확인 : 많은 양의 정규화 유체를 사용할 때 프로그램에서 대용량 카세트를 사용하십시오 .
   3. 프로토콜을 실행하여 약물 투여를 시작합니다.
      참고: 프로그램은 프로토콜을 단계적으로 실행하고 각 화합물을 추가해야 하는 시기와 양을 나타냅니다. 고농도의 약물을 취급할 때는 필터 팁을 사용하십시오. 화학 폐기물 및 사용한 요령은 생물 안전 지침에 따라 처리하도록 주의하십시오.
   4. 프로토콜이 완료되면 접착식 공기 및 액체 투과성 씰(예: 폴리우레탄 의료용 플레이트 씰; 재료 표) 플레이트를 덮고 플레이트를 37 ° C, 5 % CO₂로 되돌립니다.
      참고: 이 씰을 사용하면 "가장자리 효과" 증발을 방지할 수 있습니다(토론 참조). 씰을 사용하지 않는 경우 플레이트의 바깥쪽 가장자리가 약물 스크리닝에 사용되지 않는지 확인하십시오. 플레이트를 서로 겹쳐 쌓지 말고 플레이트가 인큐베이터 뒤쪽을 향하도록 하거나 온도 변화를 피하기 위해 (자주) 열지 않는 인큐베이터를 사용하십시오.
   5. 방사선 요법과 인쇄된 약물을 병행하는 경우 섹션 6으로 진행합니다. 그렇지 않은 경우 플레이트를 인큐베이터에 5일 동안 그대로 두십시오.
      참고: 오가노이드 유형 및 약물 유형에 따라 일부 실험은 5일 이상 소요될 수 있습니다. >7일 동안 지속되는 실험의 경우, 음성 대조군 웰에서 광범위한 세포 사멸을 방지하기 위해 실험 절차의 중간에 배지와 화합물을 조심스럽게 변경(예: 배지의 50%를 새로운 스크리닝 배지로 교체)합니다.

6. 2일차(범위: 2일차 - 4일차): 광자빔 방사선을 사용한 오가노이드 처리

참고: 다음 단계는 오가노이드의 방사선 조사에 대해 설명합니다. 약물 화합물의 방사선 감작 효과를 평가하기 위해 오가노이드가 화학 요법에 노출된 후 24시간 후에 방사선 조사가 수행됩니다. 방사선 조사만으로는 방사선 조사의 효과를 평가하는 데 동일한 프로토콜이 사용되며, 여기서 오가노이드는 파종 후 24시간 후에 파종되고 조사됩니다. 이를 위해서는 가설과 오가노이드 배양에 따라 약간의 최적화가 필요할 수 있습니다. 다음 단계는 특별히 생성된 6MV 광자 빔을 사용하여 오가노이드를 조사하는 데 사용되는 프로세스를 설명합니다(재료 표). 이 기계는 임상 응용 분야에 최적화되어 있으므로 실제 임상 실습을 반영합니다. 다른 기계는 다른 설정이 필요할 수 있으며 효율적인 투여량이 선택한 투여량과 다를 수 있으므로 투여의 최적화가 필요할 수도 있습니다.

1. 37 ° C 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 씰 상단의 각 플레이트에 뚜껑을 다시 넣습니다. 씰을 제거하지 마십시오. 이 과정에서 0 Gy 플레이트를 사용하여 제어 플레이트가 동일한 조건에 적용되었는지 확인하십시오.
2. 오가노이드를 조사기로 운반합니다. 플라스틱 상자에 미지근한 수돗물을 채워 조사 장치를 설치하고 접시가 뜨지 않도록 접시 홀더에 고정합니다.
3. 물이 접시의 윗면과 수평이 되도록 접시를 물에 담그십시오. 플레이트가 뜨지 않도록 하는 장치를 사용하여 플레이트를 제자리에 고정합니다(비디오 참조). 방을 나와 플레이트를 증가하는 용량(예: 1, 2, 4, 6, 8 및 10 Gy)으로 조사합니다. 한 번에 하나의 판만 조사하십시오., 판 더미는 방사선의 균일 한 분산을 허용하지 않습니다.
   참고: 선량-반응 곡선을 달성하기 위해 적절한 방사선 조사 선량이 선택되었는지 확인하십시오.
4. 티슈로 조사 한 후 플레이트를 철저히 건조시키고 단단한 뚜껑을 교체하십시오. 접시를 배양실로 다시 운반합니다. 딱딱한 뚜껑을 열고 EtOH 티슈를 살짝 뿌린 각 플레이트의 외부를 닦습니다. 통기성 씰을 제거하지 마십시오.
5. 문 열림으로 인한 온도 변동을 피하기 위해 인큐베이터 뒤쪽에 플레이트를 놓으십시오. 접시를 쌓지 마십시오.

7. 2일차. 옵션: CellTiter-Glo 3D 세포 생존도 분석(CTG) 측정 플레이트 T=0(GR 분석에 필요)

1. GR 메트릭을 계산하려는 경우(11.3.5 및 설명 참조) 9.1-10.4 단계에 따라 T=0 플레이트의 CTG 값을 측정합니다.

8. 약물 스크리닝 판독 하루 전: 준비

1. 필요한 CTG의 총 볼륨을 계산합니다. 384웰 플레이트의 경우 웰당 40μL의 CTG를 사용합니다(제조업체의 권장 사항에 따라 CTG 1:1 추가). 멀티드롭 분주를 위한 데드 볼륨(튜브당 1mL)을 고려하십시오. 4 °C에서 밤새 CTG를 해동하고 빛으로부터 보호하십시오.
2. 디스펜서에 보정이 필요한지 테스트하십시오.

9. 7일차(범위: 7일 - 14일차): 약물 스크리닝 판독: CTG 분석

1. CTG가 실온에 도달하도록 합니다. 판독 전에 384웰 플레이트의 모든 웰을 육안으로 검사하고 감염이 발생했는지 기록합니다.
2. 명시야 현미경으로 관련 웰을 이미지화합니다. 양성 대조군(스타우로스포린), 음성 대조군(정규화 웰) 및 각 약물의 최고 농도를 포함합니다.
3. 섹션 4.4에 설명된 단계에 따라 멀티드롭 기계를 세척하고 프라이밍합니다. 플레이트 설정에 따라 각 웰에 40μL의 CTG를 분배합니다. 멀티드롭 디스펜서(Shake)의 플레이트 셰이커를 사용하여 5분 동안 흔들고 25분 동안 빛으로부터 보호된 실온에서 배양합니다.
   참고: CTG 반응은 효소 반응이므로 온도 및 배양 시간의 영향을 받습니다. 신호는 30-60분 동안 안정적인 것으로 추정됩니다. 그러나 특히 GR 메트릭을 계산할 때 모든 플레이트에 대해 동일한 배양 시간을 사용하면 정확도가 높아집니다.

10. CTG 생물 발광 측정

1. 384웰 용량의 생물 발광 플레이트 리더와 컴퓨터를 켭니다. 여기서는 Spark 플레이트 리더가 사용되었습니다.
2. Spark Method Editor 소프트웨어를 엽니다( 재료 표 참조). 플레이트 형식 선택: COS384fb-Corning 384 플랫 블랙 | 뚜껑 없음 | 습도 카세트 없음; 측정해야 하는 웰을 선택합니다.
3. 왼쪽 하단 메뉴에서 Detection (감지) | 발광을 선택하고 플레이트 아래로 드래그합니다. 유형: 감쇠, 두 번째 메뉴: 없음. 통합 시간 설정 [ms] : 500.
4. 플레이트를 놓고 선택한 다음 시작을 클릭하여 방법을 실행합니다. 내보낸 스프레드시트를 저장합니다.

11. 데이터 분석

1. Z-factor(Z')를 계산하여 화면 품질을 평가합니다.
   1. 음수(Ctrl^neg, 예: DMSO) 및 양수(Ctrl^pos, 예: Staurosporine) 대조군의 평균(Av) 및 표준 편차(SD)를 계산합니다.
   2. Z-factor = 1 - (3 × SD[Ctnl^neg] + 3 × SD[Ctrl pos]/mean[Ctrl^neg] -mean[Ctrl^pos])를 계산합니다.
      참고: Z'는 positive control과 negative control 사이의 비율계량 공간 및 내 변동을 나타내므로 분석(¹³)의 dynamic range에 대한 측정값입니다. Z'가 0.3 미만인 약물 스크리닝 결과를 제외합니다. Z' > 0.5의 데이터를 사용하는 것이 좋습니다. 평균 Z'는 일반적으로 0.5에서 0.7 사이입니다(사용된 오가노이드 모델에 따라 다름). Z'가 정보를 제공하려면 양성 대조군 웰의 모든 오가노이드가 죽었어야 합니다.
2. Ctrl^neg 를 100%로, Ctrl^pos 를 0% viability로 설정하여 각 웰에 대한 상대적 오가노이드 생존도를 계산합니다.
   1. 이 공식을 사용하여 오가노이드 생존율을 계산합니다.
      오가노이드 생존율 = 100% × (실험 웰 값 - Av Ctrl^pos) / (Av Ctrl^neg - Av Ctrl^pos)
      1. 방사선 조사된 오가노이드의 경우 백분율 값을 계산합니다.
         오가노이드 생존율 = 100% ×(x GY의 실험 웰 값) / (Av Ctrl^네거티브 웰 값 0 GY)
   2. 데이터 분석 소프트웨어 프로그램에서 생존 가능성 데이터를 XY-테이블에 복사하고 농도당 적절한 반복 횟수 값을 선택하여 데이터를 시각화합니다.
   3. 로그 약물 농도의 경우 약물 농도를 변환하고 이 값을 테이블의 첫 번째 열에 복사합니다.
   4. 그래프의 서식을 지정하려면 그래프 유형(XY)을 선택하고 평균의 표준 오차(SEM)를 선택한 다음 원점을 왼쪽 하단으로 설정합니다.
3. 상대 IC₅₀, AUC(Area Under the Curve) 및 GR 메트릭을 결정합니다.
   1. 비선형 회귀의 경우 분석 탭에서 비선형 회귀로 곡선 맞춤을 선택합니다. log (inhibitor) vs. normalized response - variable slope 옵션을 선택하여 kill curve를 생성합니다.
   2. 결과 탭을 클릭하여 각 약물에 대한 상대 IC₅₀을 표시합니다.
      참고: 이것은 곡선의 바닥과 상단 사이의 중간에서 반응을 보이는 약물의 농도입니다. 아래쪽과 위쪽은 y축 단위의 고원입니다.
   3. AUC(곡선 아래 영역)의 경우 분석 탭에서 곡선 아래 영역을 선택하고, 미리 정의된 설정을 사용하고, 확인을 선택합니다.
   4. 결과 탭을 클릭하여 각 약물에 대한 AUC(총 면적)를 표시합니다.
      참고: AUC는 측정 가능한 효과의 통합 측정으로, 약물 효과의 누적 측정으로 사용됩니다. 항체와 같은 일부 분자의 경우 용량-반응 곡선이 시그모이드 모양이 아니며 IC₅₀ 값을 해석하기 어렵습니다. 이러한 상황에서 AUC 값은 오가노이드 라인 간의 차이를 비교하기 위한 메트릭으로 더 많은 정보를 제공할 수 있습니다.
   5. 또는 CTG 측정이 2일차에 수행되는 경우(선택적 단계 4.4.5 및 섹션 7) GR 메트릭을 계산합니다. 보다 재현 가능하고 민감한 측정을 보장하기 위해 약물 스크리닝 전반에 걸쳐 오가노이드 모델 간의 증식률 차이를 고려하여 온라인 GR 계산기¹⁴를 사용하여 GR 지표를 분석합니다.

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결과

이 실험의 목적은 단일 제제로서 화학요법 및 방사선 요법에 대한 HNSCC 오가노이드의 민감도를 조사하는 것이었습니다. 또한 일주일 간격으로 실험을 여러 번 실행하여 결과의 재현성을 테스트하여 여러 생물학적 복제(실험 1-3)를 수행했습니다(그림 2). 프로토콜에 따라, 0일차에 HNSCC PDO를 6웰 플레이트의 6웰에서 수확하고 효소 및 기계적으로 단일 ?...

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토론

이 기사와 비디오는 PDO를 사용하여 중간 처리량의 약물 스크리닝을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 최적화를 통해 여기에 설명된 것과 다른 조직 유형에서 파생된 오가노이드를 스크리닝하는 데 채택될 수 있습니다. 스크리닝 전에 이상적인 통과 기간을 결정하는 것은 개별 오가노이드 배양에 따라 다르고 조직 유형에 따라 다르기 때문에 중요합니다. 웰당 ...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Required equipment
384-well bioluminescence platereader; e.g. Tecan Spark 10M plate reader	Tecan
Brightfield microscope with large field of view lens (2.5x)
Digital dispenser; e.g. Tecan D300e	Tecan		Drug dispensing
6 MV photon beam irradiator	Elekta model Synergy, Elekta Sweden
Liquid handler with large nozzle (“standard tube”) cassettes;
e.g. Multidrop Combi Reagent Dispenser	Thermo Scientific
Plastic container with plate holder insert for radiotherapy	Home-made
Spark control method editor software
Standard tissue culturing equipment (LAF cabinet, incubator, centrifuge, waterbath, etc)
Required materials
1.5 mL plastic tubes
15- and 50-mL plastic tubes
5, 10- and 25-mL sterile plastic pipets
6-well cell culture plates
Black 384-well ultra-low-attachment clear-bottom plate; e.g.. Corning 384 flat black	Corning	4588
Breathe-Easy sealing membrane	Merck		pre-cut polyurethane medical-grade membrane with acrylic adhesive
Glasstic slide			10-chambered slide with hemocytometer grid
Multidrop Combi Reagent Dispenser standard tube dispensing cassette	Thermo Scientific
Plugged Pasteur’s pipet of which the tip has been tightened in a flame
Reversible 20/40/70/100 µm filters: PluriStrainer	Pluriselect	e.g. 43-50020-03
Sterile P1000, P200, P20 and P2 pipet tips and low-retention filter tips ( e.g. Sapphire tips)	Greiner	750266
T8 Plus and D4 Plus casettes	HP/Tecan
Required reagents
100 x Glutamax			L-glutamine substitute
1 M HEPES
30% (v/v) Tween-20 diluted in PBS
70% EtOH
Advanced-DMEM/F12	Thermo Scientific	12634-010
CellTiter-Glo 3D cell viability assay	Promega	G9681
Compounds to test screen, including Staurosporin or other positive control
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693
DMSO
ECM for CRC: growth-factor reduced Matrigel, phenol-free	Corning	356231
ECM for HNSCC PDOs: BME, Cultrex RGF Basement membrane extract, Type R1	R&D Systems	3433-005-R1
Expansion growth medium (specific for each organoid type)
Organoid growth factors (specific for each organoid type)
PBS
Pen/Strep (100 U/mL)
ROCK inhibitor: Y-27632	Abmole	M1817
TrypLE
Required Software Packages:
GraphPad Prism
Microsoft Excel