단백질 티올 산화의 다중화 정량화를 위한 등압 탠덤 질량 태그 라벨링과 결합된 수지 보조 포획

요약

단백질 티올 산화는 정상적인 생리적 및 병리생리학적 조건 하에서 중요한 의미를 갖는다. 자사는 수지 보조 포획, 등압 표지 및 질량분석법을 활용하여 단백질의 가역적으로 산화된 시스테인 잔기의 부위별 식별 및 정량화를 가능하게 하는 정량적 산화 환원 단백질체학 방법의 세부 사항을 설명합니다.

초록

단백질 티올에 대한 가역적 산화 변형은 최근 세포 기능의 중요한 매개체로 부상했습니다. 여기에서는 탠덤 질량 태그(TMT) 등압 라벨링 및 액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석법(LC-MS/MS)과 함께 수지 보조 포획(RAC)을 활용하여 프로테옴 수준에서 산화된 단백질 티올의 멀티플렉스 스토키오메트릭 정량화를 허용하는 정량적 산화 환원 단백질체학 방법의 자세한 절차를 설명합니다. 산화된 시스테인 잔기에 대한 부위별 정량적 정보는 이러한 변형의 기능적 영향에 대한 추가적인 통찰력을 제공합니다.

워크플로우는 배양된 세포(예: 포유류, 원핵생물) 및 전체 조직(예: 심장, 폐, 근육)을 포함한 많은 샘플 유형에 적용할 수 있으며, 이는 초기에 용해/균질화되고 인공 산화를 방지하기 위해 유리 티올이 알킬화됩니다. 산화된 단백질 티올은 티올 친화성 수지에 의해 환원 및 포획되며, 이는 단백질/펩타이드의 추가 전달 없이 진행된 소화, 라벨링 및 세척 절차를 수행할 수 있도록 하여 워크플로우 단계를 간소화하고 단순화합니다. 마지막으로, 표지된 펩타이드를 LC-MS/MS에 의해 용리 및 분석하여 전체 프로테옴에서 티올 산화와 관련된 포괄적인 화학량론적 변화를 나타냅니다. 이 방법은 단백질 티올 산화와 관련된 생리적 및 병리 생리 학적 상태 하에서 산화 환원 의존성 조절의 역할에 대한 이해를 크게 향상시킵니다.

서문

항상성 조건에서 세포는 대사 및 신호 전달 ^1,2,3과 같은 과정을 촉진하는 데 도움이 되는 반응성 산소^, 질소 또는 황 종을 생성하여 원핵생물과 진핵생물 모두로 확장됩니다. 이러한 반응성 종의 생리학적 수준은 'eustress'라고도 하는 적절한 세포 기능에 필요합니다.^1,4. 대조적으로, 산화제와 항산화제 사이의 불균형으로 이어지는 산화제의 증가는 산화 스트레스 또는 '고통'¹을 유발하여 세포 손상을 유발할 수 있습니다. 산화제는 단백질, DNA, RNA 및 지질을 포함한 다양한 생체 분자를 변형시켜 신호를 생물학적 경로로 변환합니다. 특히, 단백질의 시스테인 잔기는 시스테인 상의 티올기로 인해 산화되기 쉬운 반응성이 높은 부위이며, 이는 상이한 유형의^산화제에 대해 반응성이다5. 이는 니트로실화(SNO), 글루타티오닐화(SSG), 술페닐화(SOH), 과황화(SSH), 다황화(SSN_H),아실화 및 이황화물을 포함하여 시스테인에 대한 다양한 범위의 가역적 산화 환원 기반 번역 후 변형(PTM)을 발생시킵니다. 시스테인 산화의 비가역적 형태는 술피닐화 (_SO2H) 및 술포닐화 (_SO3H)를 포함한다.

시스테인 잔기의 가역적 산화 변형은 더 이상의 비가역적 산화를 방지하는 보호 역할을 하거나 하류 세포 경로^6,7에 대한 신호 분자로서 작용할^{수 있다.} 일부 티올 산화 환원 PTM의 가역성은 시스테인 부위가 "산화 환원 스위치"^8,9로 기능할 수 있도록 하며, 여기서 이러한 부위의 산화 환원 상태의 변화는 일시적인 과정에서의 역할을 조절하기 위해 단백질 기능을 변경합니다. 산화 환원 PTMs(10)의 조절 효과는 촉매작용(12), 단백질-단백질 상호작용(¹³), 형태 변화(14), 금속 이온 배위(¹⁵) 또는 약리학적 억제제 결합(¹⁶)을 포함하는 단백질 기능⁽¹¹)의 많은 측면에서 관찰되었다. 또한, 산화 환원 PTM은 전사^{17, 번역 18} 또는 대사¹⁹와 같은 경로를 조절하는 단백질의 시스테인 부위에 관여합니다. 산화 환원 PTM이 단백질 기능 및 생물학적 과정에 미치는 영향을 감안할 때, 산화 환원 상태의 섭동에 반응하여 시스테인 부위가 겪는 산화 정도를 정량화하는 것이 중요합니다.

산화 환원 상태가 변경된 시스테인 부위의 식별은 정상 조건과 교란 조건 사이의 부위 별 수준에서 산화 상태를 비교하는 데 중점을 둡니다. 폴드 변화 측정은 사용자가 연구에서 생리학적으로 중요할 수 있는 시스테인 부위를 해석하는 데 도움이 되기 때문에 어떤 부위가 크게 변경되었는지 결정하는 데 자주 사용됩니다. 또는 특정 샘플 유형에 걸친 가역적 티올 산화의 화학량론적 측정은 세포 산화와 관련된 생리적 상태의 일반적인 그림을 제공하며, 이는 종종 간과되고 활용도가 낮은 중요한 측정입니다. 변형 화학량론은 변형된 티올의 백분율을 총 단백질 티올(변형 및 변형되지 않음)에 대한 비율로 정량화하는 것을 기반으로 합니다.^20,21. 결과적으로 화학량론적 측정은 특히 질량분석법을 사용할 때 접힘 변화보다 더 정확한 측정을 제공합니다. 산화 증가의 중요성은 특정 시스테인 부위의 PTM 점유를 결정하기 위해 화학량론을 사용함으로써 보다 쉽게 확인할 수 있습니다. 예를 들어, 티올 산화의 3 배 증가는 1 %에서 3 %로 또는 30 %에서 90 %로 큰 전이로 인해 발생할 수 있습니다. 3 % 점유 인 부위의 산화가 1 배 증가하면 단백질 기능에 거의 영향을 미치지 않을 수 있습니다. 그러나 휴식 상태에서 30 %의 점유율을 가진 사이트의 경우 3 배 증가가 더 크게 영향을받을 수 있습니다. 총 산화된 티올과 단백질 글루타티오닐화(SSG) 및 니트로실화(SNO)를 포함한 특정 산화 변형 간에 화학량론적 측정을 수행하면 특정 변형 유형에 대한 비율 및 정량적 정보를 나타낼 수 있습니다.

가역적 티올 산화는 전형적으로 낮은 존재비의 번역 후 변형이기 때문에, 생물학적 샘플로부터 이러한 변형을 포함하는 단백질의 농축을 위한 여러 접근법이 개발되었다. Jaffrey와 다른 사람들이 고안 한 초기 접근법 인 비오틴 스위치 기술 (BST) ²²는 변형되지 않은 티올이 알킬화를 통해 차단되고, 가역적으로 변형 된 티올이 초기 유리 티올로 환원되고, 초기 유리 티올이 비오틴으로 표지되고, 표지 된 단백질이 스트렙 타비딘 친화성 풀다운에 의해 풍부 해지는 여러 단계를 포함합니다. 이 기술은 많은 연구에서 SNO와 SSG를 프로파일링하는 데 사용되었으며 다른 형태의 가역적 티올 산화^23,24를 프로브하는 데 적용할 수 있습니다. BST는 다양한 형태의 가역적 티올 산화를 조사하는 데 활용되었지만,이 접근법의 한 가지 우려는 농축이 비 비오틴 화 단백질과 스트렙타비딘의 비특이적 결합에 의해 영향을 받는다는 것입니다. 우리 실험실에서 개발된 수지 보조 포획(RAC)^25,26(그림 1)이라는 대체 접근법은 비오틴-스트렙타비딘 시스템을 통한 티올 그룹의 농축 문제를 우회합니다.

가역적으로 산화 된 티올의 환원에 이어, 초기 유리 티올을 갖는 단백질은 유리 티올 그룹을 공유 적으로 포획하는 티올 친화성 수지에 의해 농축되어 BST보다 시스테인 함유 단백질의보다 특이적인 농축을 가능하게한다. RAC를 최근 등압 라벨링 및 질량분석법의 발전의 멀티플렉싱 능력과 결합하면 프로테옴 전체 수준에서 가역적으로 산화된 시스테인 잔기의 농축, 식별 및 정량화를 위한 강력하고 민감한 워크플로우가 생성됩니다. 질량 분석법의 최근 발전은 티올 산화 환원 프로테옴의 훨씬 더 깊은 프로파일 링을 가능하게하여 단백질 티올 산화²⁷의 원인과 결과에 대한 이해를 높입니다. 부위별 정량적 데이터로부터 얻은 정보는 가역적 산화 변형의 기계론적 영향 및 다운스트림 효과에 대한 추가 연구를 가능하게 한다²⁸. 이 워크 플로우를 활용하면 노화와 같은 정상적인 생리적 사건과 관련하여 가역적 시스테인 산화의 생리적 영향에 대한 통찰력을 얻을 수 있으며, SSG 수준은 연령과 관련하여 다릅니다. SSG에 대한 노화 효과는 미토콘드리아 기능을 향상시키고 노화 마우스의 SSG 수준을 감소시키는 새로운 펩타이드 인 SS-31 (elamipretide)을 사용하여 부분적으로 역전되어 어린 마우스²⁹와 더 유사한 SSG 프로파일을 갖게되었습니다.

나노 입자 노출로 인한 병태 생리 학적 조건은 마우스 대 식세포 모델에서 SSG를 포함하는 것으로 나타났습니다. 질량 분석법과 결합 된 RAC를 사용하여 저자들은 SSG 수준이 산화 스트레스 및 대 식세포 식세포 기능의 손상 정도와 직접적인 상관 관계가 있음을 보여주었습니다. 데이터는 또한 서로 다른 정도의 산화 스트레스를 유발하는 서로 다른 조작 된 나노 물질에 대한 반응의 경로 별 차이를 밝혀 냈습니다³⁰. 이 방법은 또한 원핵 생물 종에서 그 유용성을 입증했으며, 여기서 티올 산화와 관련하여 광합성 시아 노 박테리아에서 일주기의 영향을 연구하는 데 적용되었습니다. 전자 수송, 탄소 고정 및 해당 과정을 포함한 몇 가지 주요 생물학적 과정에서 티올 산화의 광범위한 변화가 관찰되었습니다. 또한, 직교 검증을 통해, 몇몇 주요 기능 부위가 변형되는 것으로 확인되었고, 이는 이러한 산화적 변형의 조절 역할을 시사한다⁶.

여기에서는 표준화된 워크플로우(그림 1)의 세부 사항을 설명하며, 단백질의 총 산화된 시스테인 티올의 농축과 후속 라벨링 및 화학량론적 정량화를 위한 RAC 접근법의 유용성을 보여줍니다. 이 워크플로우는 세포 배양^27,30 및 전체 조직(예: 골격근, 심장, 폐)29,31,32,33을 포함한 다양한 샘플 유형의 산화 환원 상태 연구에서 구현되었습니다. 여기에 포함되지는 않았지만 RAC 프로토콜은 앞서 언급한^25,29,34와 같이 SSG^, SNO 및 S-아실화를 포함한 특정 형태의 가역적 산화 환원 변형의 조사에도 쉽게 적응할 수 있습니다.

프로토콜

동물 또는 인간 샘플 / 조직과 관련된 프로토콜에 설명 된 모든 절차는 인간 및 동물 연구 윤리위원회의 기관 지침에 의해 승인되고 준수되었습니다.

1. 시료 균질화/용해

1. 냉동 조직 샘플
   1. 냉동 조직 (~ 30mg)을 유리 현미경으로 다진 후 미리 냉각 된 면도날과 집게를 사용하여 드라이 아이스 슬라이드에 놓습니다. 다진 조직을 700μL의 완충액 A( 표 1 참조)가 포함된 냉각된 5mL 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브에 옮기고 빛으로부터 보호하면서 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.
   2. 30초 동안 또는 휴대용 조직 균질화기로 완전히 균질화될 때까지 조직을 파쇄합니다. 샘플을 얼음 위에 놓고 거품이 10분 더 가라앉도록 합니다.
      알림: 드라이 아이스 위에 놓인 알루미늄 베이킹 시트는 조직의 초기 처리 / 분쇄를위한 안정적인 작업 표면과 플랫폼을 제공합니다.
2. 또는 100mm 배양 접시의 부착성 세포 배양을 출발 물질로 사용하십시오.
   1. 세포를 얼음 위에 유지하고 혈청학적 피펫을 사용하여 100mM NEM을 함유한 10mL의 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 두 번 헹굽니다.
   2. 차가운 균질화/용해 완충액 1mL를 추가하고 단단한 세포 스크레이퍼로 격렬하게 긁어 세포를 용해시킵니다. 마이크로피펫을 사용하여 용해물을 2mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
      알림: 헹굼 버퍼와 용해 버퍼는 다른 크기의 배양 용기에 따라 확장 될 수 있습니다. 일반적으로 2-5 백만 개의 세포가 필요합니다. 그러나 이는 특정 세포 유형에 대한 용해 효율 및 단백질 수율에 따라 다릅니다. 균질화 완충액은 총 티올에 대해 분석되는 샘플에 대해 NEM 없이 제조될 수 있다.
3. 생성된 균질액(단계 1.1.2 또는 1.2.2)을 마이크로피펫을 사용하여 2mL 원심분리 튜브에 옮기고 4°C에서 10분 동안 전속력(≥16,000× g)으로 원심분리합니다.
4. 마이크로피펫을 사용하여 상청액(~700μL 또는 세포 배양의 경우 ~1mL)을 5mL 원뿔형 미세원심분리 튜브로 옮기고 850rpm으로 흔들면서 어두운 곳에서 55°C에서 30분 동안 배양합니다.
5. 유리 혈청학적 피펫을 사용하여 샘플에 얼음처럼 차가운 아세톤 4mL를 추가하고 단백질을 침전시키고 과량의 N-에틸말레이미드를 제거하기 위해 -20°C에서 밤새 배양합니다.

2. 수지 보조 캡처

1. 침전된 단백질 펠릿을 4°C에서 20,500× g 에서 10분 동안 원심분리하여 아세톤으로 두 번 세척하고, 아세톤을 디캔팅하고, 마이크로피펫을 사용하여 남아 있는 아세톤을 제거하고, 유리 혈청학적 피펫을 사용하여 3mL의 신선한 얼음처럼 차가운 아세톤을 추가합니다. 혼합하려면 여러 번 뒤집습니다. 두 번째 세척 후 펠릿을 1-2분 동안 자연 건조시키고 재현탁이 어려워질 수 있으므로 과도하게 건조되지 않도록 주의하십시오.
2. 마이크로 피펫을 사용하여 버퍼 B ( 표 1 참조)의 1mL를 추가하고 250W의 출력과 짧은 소용돌이를 가진 목욕 초음파 처리기를 사용하여 한 번에 15-30 초 동안 반복 된 초음파 처리를 사용하여 단백질을 가용화합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 비신코닌산(BCA) 분석을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.
3. 추가 처리를 위해 샘플 전반에 걸쳐 단백질 농도를 표준화하고 NEM을 완전히 제거하려면 마이크로피펫을 사용하여 단백질 500μg을 0.5mL 10kDa 원심 필터로 옮기고 재현탁 버퍼를 사용하여 최종 부피 500μL로 조정합니다.
4. 실온에서 14,000 × g 에서 원심 필터의 부피가 100 μL 미만이 될 때까지 원심분리합니다. 수집 튜브에서 필터를 뒤집어 샘플을 수집합니다. 1,000× g 에서 2분 동안 원심분리하고 버퍼 C를 사용하여 최종 부피 500μL로 조정합니다( 표 1 참조).
5. 마이크로피펫을 사용하여 20 μL의 500 mM 디티오트레이톨(DTT)을 최종 농도 20 mM로 첨가하고 850 rpm으로 진탕하면서 37°C에서 30분 동안 샘플을 인큐베이션함으로써 단백질 티올을 감소시킨다.
6. 환원 후, 샘플을 마이크로피펫을 사용하여 0.5 mL 10 kDa 원심 필터로 옮기고, 실온에서 또는 원심 필터의 부피가 100 μL 미만이 될 때까지 14,000 × g 에서 15분 동안 원심분리한다. 완충액 D( 표 1 참조)를 추가하여 원심 필터의 부피를 500 μL로 구성한다.
   1. 단계 2.6에서 500 μL까지 3회 원심분리를 반복하고, 4차 원심분리 후 수집 튜브에 필터를 뒤집어 1,000 × g 에서 2분 동안 원심분리하여 시료를 수집하였다.
7. 제조업체의 프로토콜에 따라 BCA 분석을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.
8. 이 완충액 교환 중에 마이크로 저울을 사용하여 적절한 양의 수지(30mg/샘플)를 칭량하고 50mL 원심분리 튜브로 옮겨 티올 친화성 수지를 준비합니다. 그런 다음 혈청학적 피펫을 사용하여 최종 농도 30mg/mL 레진에 물을 추가하고 레진의 적절한 수화를 위해 교반하면서 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
   참고: 위에서 언급한 티올 친화성 수지는 제조업체에서 단종되었습니다. 이러한 티올-친화성 수지에 대한 가능한 대체물은 시판되고 있다. 그러나 이 대체품은 바인딩 용량이 거의 5배 적습니다( 추가 정보 참조). 대안적으로, 티올-친화성 수지는 2-(피리딜디티오)에틸아민 염산염 및 N-히드록시숙신이미드-활성화 수지를 사용하여 합성될 수 있다(보충 정보 참조).
   1. 수지를 수화시킨 후 스핀 컬럼을 진공 매니폴드 위에 놓고 마이크로피펫을 사용하여 500μL의 수지 슬러리를 각 컬럼으로 옮깁니다. 물 제거를 위해 진공을 적용하십시오. 이 단계를 한 번 반복하여 컬럼당 총 30mg의 수지를 얻습니다. 또는 이 단계와 모든 수지 세척 및 용리 단계에 진공 매니폴드를 사용하는 대신 1,000× g 에서 2분 동안 원심분리합니다.
      알림: 보어 크기를 늘리기 위해 1000μL 피펫 팁의 끝을 절단하면 수지가 전사되는 데 도움이 됩니다. 피펫팅 사이를 분쇄하여 레진이 부유 상태로 유지되고 균질하고 동일한 양의 레진이 각 컬럼으로 전달되도록 하는 것이 중요합니다.
   2. 마이크로피펫으로 초순수 500μL를 첨가하고 물 제거를 위해 진공을 가하여 수지를 세척합니다. 이것을 5 번 반복하십시오. 이어서, 수지를 500 μL의 완충액 E로 5회 세척한다( 표 1 참조).
      알림: 또는 모든 후속 세척 단계에서 진공 매니폴드 대신 1,000 x g 에서 2분 동안 원심분리를 사용할 수 있습니다. 진행되는 모든 세척 단계는 500 μL의 부피로 수행된다. 컬럼에 세척 버퍼를 추가할 때 수지가 튀거나 손실되는 것을 방지하면서 수지를 완전히 재현탁할 수 있도록 충분한 힘으로 조심스럽게 첨가하십시오. 이를 통해 수지를 완전하고 효율적으로 세척 할 수 있습니다.
9. 마이크로피펫을 사용하여 환원된 각 샘플에서 150μg의 단백질을 새 튜브로 옮기고 완충액 C의 최종 부피 120μL로 조정합니다( 표 1 참조). 마이크로피펫을 사용하여 단백질 용액을 수지가 포함된 플러그된 스핀 컬럼으로 옮기고, 컬럼에 캡을 놓고, 850rpm에서 흔들면서 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
10. 수지를 25 mM hepes, pH 7.0으로 5회 세척하고; 8 M 우레아; 2 M NaCl로 5 회 이어서 이어 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)과 함께 80% 아세토니트릴(ACN)로 5회 복용; 최종적으로 단계 2.8.2에 기재된 바와 같이 25 mM HEPES, pH 7.7로 5회 플러그를 교체하였다.
    참고: 샘플은 단계 4.1에 설명된 바와 같이 단백질 수준(예: SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE), 웨스턴 블롯)에서 분석을 위해 여기에서 용리될 수 있습니다.

3. 레진 트립신 분해 및 TMT 라벨링

1. 최종 부피가 샘플당 최소 120μL가 되도록 완충액 C( 표 1 참조)에 0.5μg/μL 농도로 가용화하여 샘플당 6-8μg에 대해 충분한 시퀀싱 등급 변형 트립신 용액을 준비합니다. 마이크로피펫을 사용하여 이 트립신 용액 120μL를 샘플에 추가하고 850rpm에서 흔들면서 37°C에서 밤새 배양합니다.
   알림: 소화 효율을 높이기 위해 다음날 트립신 용액을 제거하고 신선한 용액으로 교체하여 추가 분해 단계를 포함하고 2시간 동안 소화를 계속할 수 있습니다.
2. 수지를 25 mM hepes, pH 7.0으로 5회 세척하고; 이어서 5 회 2 M NaCl; 0.1 % TFA로 80 % ACN으로 5 회; 이어 25 mM 헤페스, pH 7.7로 3회 이어서 복용하였다. 마지막으로 50mM 트리에틸암모늄 중탄산염 완충액(TEAB)으로 수지를 두 번 세척하고 플러그를 교체합니다.
3. TMT 라벨링 시약을 먼저 실온으로 데우고 16,000×g의 원심분리기를 사용하여 잠시 회전시켜 준비 합니다. 마이크로피펫을 사용하여 TMT 표지 시약의 각 바이알에 150μL의 무수 ACN을 추가합니다. 바이알을 실온에서 850rpm으로 설정된 써모믹서에서 5분 동안 인큐베이션하여 시약을 완전히 가용화합니다. 잠시 와동을 일으키고 16,000 × g 에서 스핀 다운하여 시약을 수집합니다.
4. 마이크로피펫을 사용하여 세척된 수지에 100mM TEAB 40μL를 추가한 다음 용해된 TMT 시약 70μL를 추가하고 850rpm에서 흔들면서 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 남은 TMT 시약은 -80 °C에서 보관하십시오.
   참고: 각 생물학적 샘플에 할당된 개별 TMT 라벨을 기록해 둡니다(그림 1).
5. 앞서 설명한 대로 수지를 0.1% TFA의 80% ACN으로 5회, 100mM 중탄산암모늄 완충액(ABC)으로 3회, pH 8.0으로 2회, 물로 2회 세척하고 플러그를 교체합니다.

4. 펩타이드 용출

1. 표지된 펩티드를 마이크로피펫을 이용하여 각 컬럼에 100 mM ABC, pH 8.0의 20 mM DTT 중 100 μL를 첨가하여 용리시키고, 850 rpm으로 설정된 써모믹서 상에서 30분 동안 실온에서 배양한다.
   알림: DTT를 추가하면 수지가 뭉칩니다. 수지는 피펫 팁으로 파쇄되어 덩어리를 분해하고 펩타이드의 완전한 용출을 보장할 수 있습니다.
2. 이 배양 후 고체상 추출(SPE)용 진공 매니폴드에 컬럼을 놓고 진공을 적용한 다음 샘플을 5mL 미세 원심분리 튜브에 용리합니다. 이 단계를 한 번 반복합니다.
3. 마지막으로 0.1% TFA와 함께 80% ACN 100μL를 추가하고 실온에서 10분 동안 배양한 다음 동일한 5mL 원심분리 튜브에 용리합니다. 동일한 5mL 마이크로 원심분리 튜브에서 모든 분획을 수집합니다.
   참고: 샘플 손실을 방지하려면 용출에 낮은 결합 튜브를 사용해야 하며 단일 5mL 튜브의 경우 부피를 4.0mL 이하로 유지해야 합니다.
4. 용리된 샘플을 건조될 때까지 진공 농축기에 넣습니다. 건조 펩타이드를 -80°C에서 보관하고 나중에 재현탁합니다.
   참고: 샘플은 별도로 용리될 수도 있으며, 샘플을 결합하기 전에 펩티드 수준에서 분석을 위해 분취량을 제거하고 SDS-PAGE로 분석할 수 있습니다.

5. 펩타이드 알킬화 및 탈염/클린업

1. 마이크로피펫을 사용하여 소량의 100mM ABC 완충액, pH 8.0(500μL 이하)을 첨가하여 건조된 펩티드를 재현탁시킨다. 250 W의 출력과 와류를 가진 목욕 초음파 처리기를 사용하여 한 번에 15-30 초 동안 반복 초음파 처리를 사용하여 용해시키고 2 mL 튜브로 옮깁니다.
   참고: 추가될 100mM ABC, pH 8.0의 부피는 150mM의 몰 농도에서 DTT를 재현탁하는 데 필요한 부피를 기준으로 합니다. 사용자는 4.1단계에서 원래 추가된 내용을 기반으로 샘플에 존재하는 DTT의 양을 결정해야 합니다.
2. DTT : IAA의 1 : 4 몰비를 달성하기 위해 마이크로 피펫을 사용하여 ABC에 용해 된 요오드 아세트 아미드 (IAA)의 충분한 농축 스톡 용액 (600mM)을 추가하고 샘플을 1 rpm에서 흔들면서 RT에서 850 시간 동안 배양합니다.
3. 마이크로피펫을 사용하여 농축 TFA(10%)를 추가하여 샘플을 pH < 3으로 산성화하고 제조업체의 지침에 따라 역상 세척을 사용하여 샘플 탈염을 수행합니다.
4. 건조 될 때까지 깨끗한 펩타이드를 진공 농축기에 넣으십시오. 추가 분석이 있을 때까지 건조 펩티드를 -80°C에서 보관한다.

6. 액체 크로마토 그래피-탠덤 질량 분석법

1. 250 W의 출력을 가진 목욕 초음파 처리기를 사용하여 한 번에 15-30 초 동안 초음파 처리를 반복하고 3 % ACN을 함유 한 물의 20-40 μL에서 vortexing하여 건조 된 펩타이드를 재현탁하십시오. 펩티드 농도는 제조사의 프로토콜에 따라 BCA 분석을 수행하여 결정한다.
2. 앞서 설명한^대로 역상 LC 및 MS/MS로 샘플을 분리하고 400-2000의 m/z 범위에서 MS1 스펙트럼을 기록합니다. 고에너지 충돌 해리(HCD)를 활용하여 등압 표지된 펩타이드 분석을 위한 리포터 이온 강도 정보를 얻을 수 있도록 합니다. 기기 작동 조건^27,30 및 MS 데이터^{분석 27,31}에 대한 자세한 내용은 이전 보고서의 분석법 섹션을 참조하십시오.
   참고: 펩타이드 샘플을 분석하기 위해 다양한 LC-MS/MS 시스템 또는 설정을 사용할 수 있습니다. 펩타이드 식별의 적용 범위와 민감도는 사용되는 특정 시스템 및 설정에 따라 달라집니다.

결과

프로토콜의 완료는 종종 >95% 특이성 27,35,36을 갖는 이전에 산화된 시스테인-함유 펩티드의 고도로 특이적인 농축을 초래할 것이다. 그러나, 프로토콜의 몇몇 주요 단계들은 특별한 주의를 필요로 하는데, 예를 들어, 인위적으로 산화된 티올(²⁵)의 인공 산화 및 비특이적 농축을 금지하는 샘플 용해/균질화 전에...

토론

수지 보조 포획은 시스테인 잔기^25,29,30의 산화 변형을 조사하기 위해 다양한 샘플 유형 및 생물학적 시스템에 걸쳐 활용되었습니다. 이 방법을 사용하면 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 사용한 단백질 및 펩타이드뿐만 아니라 질량 분석법을 사용하는 개별 시스테인 부위를 포함한 여러 수준 및 판독 값에서 샘플을 평가할 수 있?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride	Med Chem Express	HY-101794	Reagent for in-house resin synthesis
2.0 mL LoBind centrifuge tubes	Eppendorf	22431048
5.0 mL LoBind centrifuge tubes	Eppendorf	30108310
5.0 mL round bottom tubes	Falcon	352054
Acetone	Fisher Scientific	A949-1
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998
Activated Thiol–Sepharose 4B	Sigma Aldrich	T8512	Potential replacement for thiol-affinity resin
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter	Millipore Sigma	UFC5010BK
Ammonium bicarbonate	Sigma Aldrich	09830
Bicinchonicic acid (BCA)	Thermo Scientific	23227	Protein Assay Reagent
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge	Eppendorf	5415R
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Scientific	20291
EDTA	Sigma Aldrich	E5134
HEPES buffer	Sigma Aldrich	H4034
Homogenizer	BioSpec Products	985370
Iodoacetimide (IAA)	Sigma Aldrich	I1149
N-ethylmaleimide	Sigma Aldrich	4259
NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow	Cytiva	17-0906-01	Reagent for in-house resin synthesis
QIAvac 24 Plus vacuum manifold	Qiagen	19413
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S3014
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	L6026
Sonicator	Branson	1510R-MT
Spin columns	Thermo Scientific	69705
Strata C18-E reverse phase columns	Phenomenex	8B-S001-DAK	Peptide desalting
Thermomixer	Eppendorf	5355
Thiopropyl Sepharose 6B	GE Healthcare	17-0420-01	Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details).
TMT isobaric labels (16 plex)	Thermo Scientific	A44522	Peptide labeling reagent; available in multiple formats
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB)	Sigma Aldrich	T7408
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma Aldrich	T6508
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Trypsin	Promega	V5820
Urea	Sigma Aldrich	U5378
Vacufuge Plus speedvac	Eppendorf	22820001	vacuum concentrator
Vortex mixer	Scientific Industries	SI-0236