배양된 초파리 뇌 외래 식물에서 신경 줄기 세포 재활성화

요약

배양된 초파리 뇌 외식편에서 정동작 신경줄기세포를 재활성화시키는 방법이 확립되었다. 이 방법을 사용하여, 전신 신호의 역할은 신경 줄기 세포 정지, 출입의 조절에서 조직 내재적 신호로부터 결합되지 않을 수 있다.

초록

신경 줄기 세포 (NSCs)는 증식, 분화, 아폽토시스를 겪고, 심지어 정지를 출입 할 수있는 능력을 가지고 있습니다. 이러한 과정의 대부분은 NSC 내재적 유전 프로그램과 NSC 외인성 인자, 국소 및 전신 간의 복잡한 상호 작용에 의해 제어됩니다. 유전 모델 유기체에서, Drosophila melanogaster, NSCs, 신경 세포 (NBs)로 알려진, 정지에서 증식 동안 배아에서 애벌레로 전환. 이 기간 동안 애벌레는 달걀 껍질에서 나와서식이 영양소를 찾아 기어 다니기 시작합니다. 동물 먹이에 대한 반응으로, 지질 저장 능력을 가진 내분비 기관 인 지방 몸체는 순환하는 용혈림프로 전신적으로 방출되는 신호를 생성합니다. 지방 신체 유래 신호 (FBDS)에 반응하여 초파리 인슐린 유사 펩티드 (Dilps)가 생성되어 뇌 신경 분비 뉴런 및 글리아교에서 방출되어 NB와 그 아교 및 기관 틈새 시장에서 PI3-키나제 성장 신호 전달의 하류 활성화로 이어집니다. 이것이 NB가 정지에서 확산으로 전환하는 방법에 대한 현재 모델이지만, FBDS 외인성 큐의 본질은 여전히 애매합니다. NB 외인성 전신 단서가 정지로부터의 출구를 조절하는 방법을 더 잘 이해하기 위해, 동물 먹이를 먹기 전에 시험관 내에서 초기 애벌레 뇌를 배양하는 방법이 개발되었습니다. 이 방법을 이용하면, 외인성 인자가 배양 배지에 공급될 수 있고 NB는 정지 분석으로부터 빠져나갈 수 있다. 우리는 외인성 인슐린이 전뇌 외식식물에서 정지로부터 NB를 재활성화시키기에 충분하다는 것을 발견했습니다. 이 방법은 대규모 스크린에 매우 적합하기 때문에 NB 정지 대 증식 결정을 조절하는 추가적인 외인성 단서를 식별하는 것을 목표로합니다. NSC 증식 결정을 조절하는 유전자와 경로가 진화적으로 보존되기 때문에, 이 분석의 결과는 클리닉에서 재생 요법을 개선하는 데 대한 통찰력을 제공할 수 있다.

서문

줄기 세포는 재생 의학 ^1,2에 사용할 수있는 잠재력 때문에 큰 관심이 ^있습니다. 많은 동물, 특히 오래 사는 동물은 성인 조직 내에서 줄기 세포를 유지합니다. 이러한 상주 줄기 세포는 조직 항상성을 유지하는 기능을 하며 신체적 상해 또는 질병 ^3,4 이후의 복구에 활용된다. 성체 동물에서 대부분의 줄기 세포는 정지, 성장 신호 전달의 세포 주기 정지 및 불활성화를 특징으로 하는 비교적 휴면 상태^{이다 5}. 외인성 단서에 반응하여 줄기 세포는 정지에서 빠져 나와 세포주기에 들어가 조직 유형에 특유한 딸 자손을 생성하기 시작합니다. 예를 들어, 효과적인 면역 반응을 탑재하기 위해, 항원-제시 세포는 정지된 나이브 T 세포가 세포 주기로 진입하도록 유도하고 clonally 확장⁶. 골격근 손상에 반응하여, 근육 위성 줄기 세포는 세포주기에 들어가 손상된 myofibrils ^5,7을 대체하기 위해 딸 근....

프로토콜

1. 초파리 유 충 수집

참고 : 시작하기 전에 효모 판, 포도 페이스트 및 플라이 콘도를 준비하십시오.

1. 효모 페이스트 : 작은 용기에 활성 건조 효모 5g을 물 10mL와 섞어 땅콩 버터의 일관성이있는 페이스트를 형성하십시오. 효모 페이스트를 플라스틱 랩으로 덮고 고무 밴드를 사용하여 용기에 단단히 부착하십시오.
   참고 : 신선한 효모 페이스트는 용기에서 팽창하고 단단히 부착되지 않으면 뚜껑에서 튀어 나옵니다. 효모 페이스트는 실온 (RT)에서 며칠 동안 지속됩니다.
2. 포도 접시 : 포도 접시를 만들기위한 조리법을 따르십시오 (표 1). 4°C에 보관된 플레이트를 사용하는 경우, 사용하기 전에 플레이트를 RT에 1시간 동안 배치하여 미리 따뜻하게 해야 합니다.
   1. 물(750 mL)과 한천(18.75 g)을 4 L 플라스크에 섞고, 소용돌이치고, 오토클레이브를 20분 동안 (액체 사이클) 한다.
   2. 포도 주스 (250 mL)와 자당 (25 g)을 가열 된 플레이트 (저열) 위에 큰 교반 막대가있는 1 L 플라스크에 섞는다. 자당이 용해되면 열을 끄고 Tegosept (10 %, 4 mL) 및 프로피온산 ....

결과

갓 부화한 오레곤R 야생형 뇌를 해부하고 인슐린으로 보충된 슈나이더 배지(SSM)에서 24시간 동안 배양하였다. Tissues는 프로토콜에 따라 고정되고 염색되었다. NBs를 검출하기 위해 데드판(Dpn)에 대해 생성된 일차 항체와 세포막을 표지하기 위한 낙서가 사용되었다. 티미딘 유사체 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(Edu)을 첨가하여 S상 진입 및 NB 재활성화를 검출하였다. 우리는 배양물에서 24 시간 후에 큰 크?.......

토론

뇌 외식편을 배양하기 위해 여기에 기술된 방법은 대부분의 실험실 환경에서 수행될 수 있다. 필요한 도구와 절차 및 데이터 수집은 간단하고 간단합니다. 이 방법을 이용하면, NB 재활성화 및 증식을 조절하는 세포 신호전달 캐스케이드 및 외인성 인자와 관련된 것들을 포함하는 다양한 가설을 시험할 수 있다. 여기에서, 야생형 OregonR 동물을 사용하여, 우리는 외인성 인슐린이 다른 동물 특이적 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 µL Pipette tips	Denville Sci	P2102
1000 µL Pipette tips	Denville Sci	P2103-N
1000 µL Pipettor	Gilson	P1000
16% paraformaldehyde (10 x 10 mL)	Electron Microscopy Sciences	2912.60.0000	Used for Fixation of Larval Brains
20 µL Pipette	Gilson	P20
200 µL Pipette tips	Gilson	P200
200 µL Pipette tips	Denville Sci	1158U56
24-well multiwell culture plates	Fisher Scientific	50-197-4477
35 mm Petri dishes	Fisher Scientific	08-757-100A	Grape Plate Ingredients
4 °C refrigerator	Fisher Scientific		Provides an ideal temperature for >24 h incubations in antibody solution
63x Objective	Lecia
Active dry yeast	Most supermarkets
Agarose	Fisher Scientific	214010	Grape Plate Ingredients
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye	Thermo Fisher Scientific	C10340	to label proliferating cells
Confocal Microscope	Leica	SP8
Coverslips 22 mm x 22 mm x 1 mm , 10 pack of 4 oz	Fisher Scientific	12-544-10	Two Coverslips are super glued to the ends of the microscope slide. This creates a space that allows for the brains to float in antifade while being imaged.
Coverslips, 22 mm x 50 mm x 1 mm	Fisher Scientific	12-545E	The coverslip is placed on two square coverslips on the microscope slide ensuring that the brain in the antifade does not move while imaging.
Dissecting microscope	Zeiss	Stemi 2000
Ethanol 200 proof (100%), Decon Labs, 1 gallon bottle	Fisher Scientific	2701	Used to wash off the larvae before the 24 hr hold in culture medium
Fetal Bovine Serum (10%)	Sigma	F4135-100ML	Supplement for cell culture media.
Fine forceps for dissection	Fine Science Tools	11295-20	Forcepts used in disections. They work best when sharpened.
Fly Bottles for Crossing	Genessee Scientific	32-130	This bottle is used as a container that lets the flies lay eggs on the grape plate.
Glass Dissection Dish (3 well)	These are no longer available
Glutathione	Sigma	G6013	Provides oxidative protection during cell culture.
Goat Serum	Sigma	G9023- 10ML	Blocking Agent
Grape Plates	Made in house	Made in house	Grape juice/agarose plates for collecting freshly hatched eggs
Image J	Imagej.net/fiji/downloads	Free Download:  https://fiji.sc	Imaging platform that is used to count cells and Edu reactivation
Incubator	Thermo Fisher Scientific		Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment.
Insulin	Sigma	I0516	Independant variable of the experiment
Laminar flow hood			For aliquoting culture media
L-Glutamine	Sigma	G7513	Provides support during cell culture
Nunc 72-well Microwell Mini Trays	Fisher Scientific	12-565-154	Immunostaining steps are performed in this tray
Parafilm	Fisher Scientific	S37440	Film used to seal plates in order to prevent evaporation
Pen-Strep	Sigma	P4458-100ml	Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture.
Phosphate Buffer, pH7.4	Made in house	Made in house	Solvent used to wash the brains after fixing and staining steps
Pick	Fine Science Tools	10140-01	Used to pick larvae off of the grape plate
Propionic acid	Fisher Scientific	A-258	Grape Plate Ingredients
Rabbit 405	Abcam	ab175653	Antibodies used for immunostaining
Rat 555	Abcam	ab150166	Antibodies used for immunostaining
Rb Scribble	A Gift from Chris Doe		Antibodies used for immunostaining
Rt Deadpan	Abcam	ab195173	Antibodies used for immunostaining
Schneiders Culture Medium	Life Tech	21720024	Contains nutrients that help the cells grow and proliferate
SlowFade Diamond Antifade (5 x 2 mL)	Life Tech	S36963	Reagent that provides protection against fading fluorophores
Sterile Water	Autoclave Milli-Q water made in house		Needed for Solutions
Sucrose	Fisher	S2-12	Grape Plate Ingredients
Superfrost Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-7
Superglue	Most supermarkets
Tegosept	Genesee Scientific	20-259	Grape Plate Ingredients
Triton-X 100	Sigma	T9284-100ML	PBT
Welch's 100% grape grape juice	Most supermarkets		Grape Plate Ingredients