구강 안면 조작 통증 분석을 사용한 쥐의 신경 손상 유발 기계적 과민증 평가

요약

이 프로토콜은 조작 기반 구강 안면 통증 평가 장치를 사용하여 신경 병증 성 구강 안면 통증의 쥐 모델에서 기계적 과민 반응의 평가를 설명합니다.

초록

통증에는 감각적이고 정서적 인 요소가 있습니다. 기존의 반사 기반 통증 분석과 달리 조작적 통증 분석은 설치류 통증의 인지 및 동기 부여 측면을 해결하여 임상적으로 더 관련성 있는 결과를 생성할 수 있습니다. 이 논문은 구강 안면 조작 통증 시스템을 사용하여 쥐에서 안와 신경 (CCI-ION)의 만성 수축 손상 후 기계적 과민증을 평가하기위한 프로토콜을 제시합니다. CCI-ION 수술 전에 쥐는 구강 안면 통증 평가 장치 (OPAD)에서 금속 스파이크 막대 및 릭 튜브와 얼굴 접촉을하면서 가당 연유를 마시도록 훈련 받았습니다.

이 분석에서 쥐는 우유를 양성 강화제로 받거나 보상 접근 구멍의 양쪽에 작은 피라미드 모양의 스파이크가 수직으로 줄지어 생성되는 혐오스러운 기계적 자극을 피할 수 있습니다. OPAD에서 2주간의 훈련 후 CCI-ION 수술 전에 10분 테스트 세션 동안 각 래트에 대해 5일 동안 기준선 기계적 민감도 데이터를 기록했습니다. 세션 중에 조작 시스템은 보상 병 활성화 횟수(핥기) 및 얼굴 접촉, 접촉 시간 및 첫 번째 핥기에 대한 대기 시간 등을 자동으로 기록합니다.

기준선 측정 후, 쥐는 CCI-ION 또는 가짜 수술을 받았다. 이 프로토콜에서는 핥기 횟수, 첫 번째 핥기에 대한 대기 시간, 접촉 수 및 얼굴 접촉에 대한 핥기의 비율(L/F)을 측정하여 기계적 과민성을 정량화했습니다. 데이터에 따르면 CCI-ION은 핥기 횟수와 L/F 비율이 크게 감소하고 첫 번째 핥기에 대한 대기 시간이 증가하여 기계적 과민증을 나타냅니다. 이러한 데이터는 전임상 통증 연구에서 기계적 통증 민감도를 평가하기 위해 조작적 기반 통증 분석의 사용을 지원합니다.

서문

만성 통증은 매년 수백만 명의 미국인에게 영향을 미칩니다¹. 불행히도 만성 통증은 기존 치료법이 만성 통증을 완화하는 데 상대적으로 효과적이지 않고 장기간 사용하면 바람직하지 않은 부작용이 발생하기 때문에 치료하기가 어렵습니다 ^2,3,4. von Frey 분석과 같은 전통적인 전임상 통증 분석은 반사적 결과 또는 통증^{자극 반응에} 의존합니다5. 폰 프레이 분석은 기계적 이질통을 측정하기 위해 수십 년 동안 사용되어 왔지만 몇 가지 교란 요인, 특히 실험자 편향6에 취약^합니다. 구강 안면 통증을 평가하기위한 폰 프레이 (von Frey) 검사의 사용은 얼굴 부위를 성공적으로 테스트하기 위해 동물의 머리를 고정하는 데 필요한 구속 정도가 있기 때문에 문제가되며, 이는 통증 강화 또는 반대로 스트레스 유발 진통과 같은 바람직하지 않은 스트레스 효과를 유발할 수 있습니다.

통증 자극 행동은 또한 위양성 결과⁷에 취약하며 인간의^{통증 경험8}에 필수적인 통증의 정서적 요소를 설명하지 않습니다. 따라서 전임상 테스트에서 내용과 예측 타당성을 개선하기 위해 통증의 감각 및 정서적 구성 요소를 모두 포함하는 통증 우울 행동을 평가하는 조작적 통증 모델을 사용하는 데 관심이 증가하고 있습니다. 여기에 설명된 조작적 구강안면 통증 평가 분석은 보상-충돌 패러다임 9,10,11을 기반으로 합니다. 이 분석에서 설치류는 양성 강화제를 받고 통각 자극을 받거나 보상을 포기하고 통각 자극을 피함으로써 경험하는 통증의 양을 조절할 수 있습니다. 기존의 통증 분석과 달리 조작적 기반 분석은 실험자 독립적이며 바람직하지 않은 진정 효과로 인해 위양성 결과에 취약하지 않습니다.

머리와 얼굴의 유해한 감각은 삼차 신경의 안과, 상악 및 하악 가지에 의해 운반됩니다. 삼차 신경의 손상 또는 염증은 열 또는 기계적 자극^12,13,14,15에 대한 감각 뉴런의 민감도를 증가시킵니다. 조작 기반 구강 안면 통증 분석은 설치류 11,12,16,17,18에서 삼차 신경에 의해 전달되는 열 또는 기계적 구강 안면 통증의 자동 측정을 제공합니다. 무해하고 유해한 자극을 사용한 자극은 OPAD를 사용하여 구강 안면 부위의 열 및 기계적 이질통과 통각 과민을 테스트하는 것의 중요한 차이점입니다.

구강 안면 열 분석에서 동물은 보상에 접근하기 위해 부드러운 열화물에 얼굴을 누릅니다. 열화물은 다양한 차갑고 따뜻하며 뜨거운 온도로 설정할 수 있으므로 중성 또는 통각 수용 조건에서 거동을 평가할 수 있습니다. 구강 안면 기계 분석에서 동물은 조작 적 테스트 중에 스파이크 막대에 얼굴을 대고 누릅니다. 이러한 스파이크가 어느 정도의 불편함을 유발하기 때문에 설치류는 얼굴이 스파이크에 닿을 때 보온화물의 매끄러운 표면에 비해 술을 덜 마실 수 있습니다. 따라서, 조작적 구강안면 기계적 분석은 다양한 정도의 기계적 통각자극의 효과를 평가할 수 있다. 우리는 이전에 OPAD가 급성 열⁹, 급성 기계적¹⁹, 통각 및 통각 과민을 평가하는 데 유용하고 신뢰할 수있는 방법임을 입증했습니다.

이 논문은 기계적 통각 및 과민증을 평가하기 위해 새로 개발 된 OPAD 버전의 사용을보고합니다. 또한 검증을 통해 OPAD에서 예측 가능한 반응을 초래하는 만성 신경병증을 유도하는 CCI-ION의 능력을 입증합니다. 또한 OPAD 및 관련 소프트웨어를 사용하여 설치류 행동 데이터를 신속하게 얻고 분석하는 방법도 자세히 설명합니다.

프로토콜

모든 실험 절차는 플로리다 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 국립 보건원 가이드에 명시된 표준을 준수했습니다. 여기서, OPAD를 이용한 기계적 과민증의 평가는 신경병증성 구강안면통증의 래트 모델을 사용하여 기술된다. 연구에 사용 된 타임 라인의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다. 모든 행동 평가는 여성 실험자에 의해 수행되었습니다.

1. 동물

1. 암컷 Sprague-Dawley 쥐 (n = 8 / 그룹, 150-200g)를 12 시간 : 12 시간 명암주기로 온도 조절 실 (22 ° C ± 1 ° C)에서 쌍으로 사용합니다. 음식과 물을 자유롭게 제공하십시오. 실험 전에 순응을 위해 쥐를 5 일 동안 시설에 보관하십시오.
2. 같은 요일과 시간(오전 9시-오전 11시)에 조작적 통증 분석을 수행합니다.
3. 실험이 끝나면 이소 플루 란 마취 후 참수로 쥐를 안락사시킵니다.

2. OPAD 설정

1. OPAD에 우유 드립 트레이, 플렉시 글라스 케이지 및 금속 바닥 그릴을 놓습니다. 케이지에 배선을 부착하십시오. 병 홀더를 장치 뒷면의 금속 기둥에 밀어 넣습니다.
2. 가당 연유 캔을 열고 1L 비커에 부어 보상 용액으로 물과 가당 연유의 2:1 비율을 준비합니다. 우유 300mL에 ~600mL의 수돗물을 추가합니다. 처음에는 스푼을 사용하여 용액을 저어준 다음 교반 막대와 핫 플레이트 교반기를 사용합니다. 그런 다음 보상 병에 우유 용액을 채우고 스톡 우유 용액을 4°C로 유지합니다.
   알림: 육유 용액을 플라스틱 식품 랩으로 덮으십시오. 매번 사용하기 전에 우유 용액을 따뜻하게하십시오. 냉장고에있는 스톡 우유 용액은 일주일 후에 응고 될 수 있습니다. 응고되면 핥기 튜브가 막힐 수 있습니다. 따라서 폐기하고 새로운 저장 용액을 준비하십시오.
3. 보상 우유 병을 병 홀더에 놓고 동물이 스파우트에 닿을 수 있도록 조정합니다. 홀더의 왼쪽 손잡이를 조여 병을 제자리에 고정합니다.
4. 전면 패널의 스위치를 사용하여 케이지를 켭니다.

3. 프로토콜 설정 및 실험 파일 만들기

참고: 먼저 실험을 실행할 프로토콜을 설정합니다. 프로토콜은 ANY-maze 소프트웨어가 실험을 수행하는 방법을 설명합니다.

1. 소프트웨어를 엽니다. 암호를 입력합니다. 로그온을 클릭하거나 Enter 키를 누릅니다.
2. 비어 있는 새 실험 | 프로토콜 메뉴.
   1. 이 프로토콜이 사용할 모드를 선택하고 프로토콜 이름을 지정합니다. 장치에서 이름 없는 프로토콜을 클릭하고 이 프로토콜이 사용할 모드 선택 섹션을 클릭한 다음 장비별 모드에서 OPAD 기계식 케이지 모드를 선택하고 확인을 클릭합니다. 그런 다음 프로토콜의 이름을 지정합니다(예: OPAD 기계식).
   2. OPAD 케이지를 추가합니다.
      1. 장치에서 장치 | 프로토콜 창 위쪽에 있는 항목 추가 | 새로운 OPAD 케이지 | 연결된 모든 OPAD 케이지를 추가합니다.
         알림: 케이지를 추가하기 전에 모든 케이지가 켜져 있는지 확인하십시오.
   3. 실험 테스트 단계를 추가합니다.
      1. 테스트에서 스테이지 | 첫 번째 단계 및 이름 단계(예: 기준 1일차). 테스트 기간으로 10분을 입력합니다. 단계를 더 추가하려면 프로토콜 창 맨 위에 있는 항목 추가를 클릭합니다| 새로운 단계.
         참고: 각 단계는 분석이 수행될 때의 세션을 나타냅니다. 예를 들어, 10 일간의 훈련에는 10 단계가 필요합니다. 테스트 기간은 실험 설계에 따라 늘리거나 줄일 수 있습니다.
   4. 치료 그룹을 지정하십시오.
      1. 추가 정보에서 치료 그룹을 클릭합니다. 치료 그룹 사용 | 확인 사용자는 동물을 그룹에 수동으로 할당합니다.
         참고: 참조된 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하면 동물을 무작위로 또는 특정 순서로 할당할 수도 있습니다. 실험은 블라인드 될 수 있습니다. 할당된 처리 그룹을 보려면 블라인드 실험 실행을 선택 해제합니다.
   5. 동물 신분증(ID)을 지정합니다.
      1. 프로토콜 메뉴를 클릭하십시오. 추가 정보에서 동물 ID를 클릭하고 내 ID를 사용하여 동물 참조를 선택합니다.
3. 실험 메뉴를 클릭합니다.
   1. 실험 제목을 입력합니다.
   2. 치료 보기를 클릭하여 치료 이름을 지정하고 치료 이름을 입력합니다(예: 치료 1: CCI-ION, 치료 2: 가짜).
   3. 동물을 추가하고 동물 | 보기를 클릭하여 처리 및 동물 ID를 할당 합니다. 동물을 추가하고 테스트할 동물 수를 입력한 다음 확인을 클릭합니다. 동물 목록이 나타날 때까지 기다렸다가 각 쥐에 대한 동물 ID와 치료법을 추가하십시오.
      알림: 동물 ID 옆에 나타나는 상태 목록은 연구 시작시 보통 으로 설정됩니다. 동물은 나중에 상태를 은퇴 또는 삭제됨으로 변경하여 테스트 일정에서 제거할 수 있습니다.
4. 프로토콜 메뉴를 클릭하여 프로토콜을 저장합니다| 프로토콜 창 맨 위에 있는 프로토콜을 저장합니다. 파일 이름과 소프트웨어(ANY-maze) 암호를 입력하고 저장을 클릭합니다.
   참고: 저장된 프로토콜은 새 실험에 재사용할 수 있습니다.
5. 파일 | 클릭하여 실험 파일을 저장합니다. Save(저장)를 클릭하고 소프트웨어 암호를 입력한 후 Save(저장)를 클릭합니다.

4. 교육 및 기본 테스트 세션

알림: 행동 검사실이 동일한 동물 사육 시설에있는 경우 검사 최소 15 분 전에 쥐를 방으로 가져 오십시오. 동물 시설 외부의 시험실로 이송되는 경우 쥐가 방에 적응할 수 있도록 1 시간을줍니다.

1. 기준선 기록 전에 OPAD의 쥐를 2 주 (주 5 일, 10 분 / 일) 동안 훈련시켜 금속 스파이크 막대에 얼굴을 대고 우유 용액을 받도록 훈련시킵니다.
   참고: 스파이크 막대와 분석을 수행하는 쥐의 대표 이미지가 그림 2에 나와 있습니다.
2. OPAD 장비를 설정합니다.
3. 전면 패널의 스위치를 사용하여 케이지를 켭니다. 케이지에서 녹색 표시등을 찾으면 케이지를 테스트 할 준비가되었음을 의미합니다.
4. 저장된 실험 파일을 두 번 클릭하여 엽니다. 암호를 입력합니다. 로그온을 클릭하거나 Enter 키를 누릅니다.
5. 테스트 메뉴가 나타날 때까지 기다립니다. 화면 왼쪽에서 동물 수와 해당 케이지(예: 동물 1은 케이지 1에서 테스트됨), 해당 날짜에 실행될 스테이지 및 테스트 상태("준비")를 기록해 둡니다. 화면 오른쪽에서 핥기와 접촉 횟수를 보여주는 각 동물의 차트를 관찰하십시오.
6. 테스트 할 동물의 ID를 표시하는 케이지의 화면을 관찰하십시오. 각 쥐를 해당 케이지에 넣고 케이지의 버튼을 두 번 누릅니다. 테스트가 시작되면 녹색 표시등이 주황색 표시등으로 바뀌고 테스트 세션이 끝나면 경고음이 들립니다.
7. 훈련 첫 2 일 동안 쥐가 자극에 접촉하지 않고 우유를 마실 수 있도록 우유 병을 새장에 완전히 넣으십시오.
8. 훈련 3-8 일에 동물들이 술을 마시기 시작하면 병을 점차적으로 뒤로 움직여 쥐가 스파이크 막대에 얼굴을 대도록 격려하십시오.
9. 훈련 9-10 일에 동물이 스파이크 막대를 완전히 누르고 핥는 숫자가 일정하면 (500 분 테스트 세션 동안 최소 10 회 핥기) 각 동물의 우유 병 위치를 기록하고이 거리를 기준선 기록에 사용하십시오.
10. 2주간의 교육 후, 기준선으로 5일 동안 기록된 우유병 거리에서 데이터를 수집합니다(10분/일).

5. 구강 안면 신경 병증 성 통증의 유도 및 기계적 과민증의 평가

참고: 기준선 측정에 이어, 쥐는 이전에 설명된 바와 같이 ION의 양측 결찰을 포함하는 CCI-ION 수술을 받았습니다.²⁰. 대조군 쥐는 가짜 수술을 받았습니다. 수술 전 또는 수술 후 진통제는 신경 병증의 시간 경과를 변경할 수 있으므로 절차에 사용되지 않았습니다. 주의 : 폐기물 이소 플루 란은 숯 용기를 통해 청소해야합니다. 메스 블레이드와 바늘은 생물학적 위험 폐기물로 폐기해야합니다.

1. 유도 챔버에서 쥐를 O₂ (1 L / min)와 4 % 이소 플루 란의 혼합물로 마취시키고 수술 기간 동안 특수 코 콘으로 마취 상태를 유지하십시오.
2. 마취 된 쥐를 수술대에 놓고 제지하십시오. 가열 패드를 사용하여 체온을 37 ° C로 유지하십시오. 눈이 마르지 않도록 안과 용 연고를 눈에 바르십시오. 발가락을 꼬집어 마취 깊이를 확인하고 발가락 금단 반사가 더 이상 관찰되지 않을 때 절차를 시작하십시오.
3. 실체 현미경으로 수술 절차를 수행하십시오. 견인기를 사용하여 입을 열고 작은 클립을 사용하여 입술을 수축시킵니다.
4. 메스 블레이드 (# 15)를 사용하여 등 잇몸과 입술 사이에 작은 절개를하십시오. 메스 블레이드 끝을 사용하여 연조직을 부드럽게 잘라 ION의 가지를 드러냅니다.
5. 뭉툭하고 구부러진 주사기 바늘을 사용하여 이온 주위에 두 개의 크롬 내장(#5-0) 합자를 놓습니다.
6. 조직 접착제를 사용하여 상처를 닫으십시오.
7. 가짜 수술의 경우 동일한 절차를 사용하여 ION을 노출하되 신경을 결찰하지 마십시오.
8. 수술 후 우유가 부드러워진 설치류 차우를 2일 동안 제공하여 식사를 장려하고 탈수를 예방합니다.
9. 수술 다음 날 연속 3일 동안 OPAD에서 래트를 테스트한 다음 다음 주 동안 주 3일(예: 매주 화요일, 목요일 및 금요일) 동안 핥기 수가 기준선 값에 도달할 때까지 테스트합니다.
   알림: CCI-ION으로 유도 된 기계적 감도의 지속 시간은 성별, 사용 된 설치류의 변형 및 실험자의 성능에 따라 달라질 수 있습니다. 따라서 실험 동물에 대한 특정 기간을 나타내는 것은 정확하지 않을 수 있습니다. 따라서 lick 숫자가 기준 값에 도달할 때까지 테스트하는 것이 더 정확합니다.

6. 장치 청소

1. 테스트가 완료되면 오른쪽 상단 모서리에 있는 x 아이콘을 클릭하여 소프트웨어를 종료하고 데이터가 자동으로 저장될 때까지 기다립니다.
2. 전면 패널의 스위치를 사용하여 케이지를 끕니다.
3. 금속 바닥 격자에서 전선을 뽑습니다. 우유 드립 트레이, 플렉시 글라스 케이지, 금속 바닥 격자 및 병 홀더를 주방 세제로 제거하고 씻으십시오. 모든 것을 건조대에 올려 놓으십시오.
4. 70% 이소프로필 알코올을 사용하여 금속 스파이크 막대, 테스트 장치 및 실험실 벤치를 닦습니다.
   알림: 기기는 주의해서 다루어야 합니다. 우유병을 청소하고 튜브를 핥는 동안 부드러운 솔을 사용하십시오. 장비가 더러우면 박테리아가 축적될 수 있습니다.

7. 데이터 분석

1. 실험 파일을 두 번 클릭하여 엽니다.
2. 결과 메뉴를 클릭합니다. 볼 측정 (예 : 핥기, 접촉) 또는 테스트 날짜를 선택하십시오.
3. 결과 패널 위쪽에 있는 텍스트 또는 그래프 또는 통계를 클릭하여 텍스트, 그래프 또는 통계 분석 보고서를 확인합니다.
4. 원시 데이터를 보려면 데이터 메뉴를 클릭합니다. 데이터 패널 위쪽에 있는 저장을 클릭하여 데이터를 스프레드시트로 저장하거나 보내기 를 클릭하여 전자 메일을 통해 데이터를 받습니다.
5. 표시할 변수를 변경하거나 추가하려면 데이터 선택을 클릭하고 측정값을 선택한 다음 스프레드시트 보기를 클릭합니다.
6. 통계 분석
   1. 소프트웨어에서 핥기 및 연락처 수와 첫 번째 핥기에 대한 대기 시간을 자동으로 도출하고 소프트웨어에서 스프레드시트로 데이터를 내보냅니다.
   2. L/F 비율을 핥는 횟수를 접점 수^21,22,23으로 나누어 과민증 지수로 계산합니다.
      참고: 이 연구에서 가짜 그룹의 쥐 중 한 마리는 수술 전에 낮은 핥기 수(<500회 핥기)로 인해 연구에서 제외되었습니다.
   3. 양방향 반복 측정 ANOVA를 통해 L/F 간의 차이, lick 수와 접촉, 첫 번째 lick까지의 대기 시간에 대한 통계적 유의성을 분석한 다음 Dunnett의 다중 비교 또는 Šídák의 다중 비교 테스트를 수행합니다.
      참고: P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. 데이터는 평균(SEM)의 평균± 표준오차로서 제시하였다.

결과

단일 쥐가 보상 병을 핥고 기준선과 수술 후 2주, 4주 및 6주에 금속 스파이크 막대와 접촉하는 예가 그림 3에 나와 있습니다. 유해하지 않은 기간 동안 쥐는 일반적으로 긴 음주 세션 (예 : CCI-ION 후 기준선 및 회복시 : 이미지의 6 주)을 가지며 CCI-ION 이후에는 스파이크 막대와 얼굴 접촉을 오랫동안 유지할 수 없기 때문에 핥기 횟수가 감소합니다 (그림 3A), 가짜 그룹의 음주 기간에는 큰 변화가 없습니다 (그림 3B).

CCI-ION을 가진 래트는 수술 후 4주까지 핥기 횟수가 유의하게 감소하였고, 기준선과 비교하여 수술 주(0주) 및 수술 후 1주일에 첫 번째 핥기에 대한 잠복기가 증가하였다. 가짜 그룹에는 큰 변화가 없었습니다 (그림 4A, B). CCI-ION은 접촉 수를 감소시켰지만 이 차이는 유의하지 않았습니다(그림 4C). CCI-ION은 또한 L / F의 현저한 감소를 일으켰으며 CCI-ION 그룹의 감소는 가짜 그룹의 감소보다 컸습니다 (그림 4D).

이러한 결과는 CCI-ION에 이어 쥐가 우유 마시는 행동에 대한 보상이 적고 첫 번째 핥기를 하는 데 시간이 걸리며 통각 행동을 나타냅니다. 그러나 CCI-ION은 우유에 도달하려는 욕구에 영향을 미치지 않습니다. 또한, CCI-ION을 가진 쥐의 L/F 감소는 통증이 없는 상태에서 L/F가 더 높기 때문에 기계적 과민증을 나타냅니다.

그림 1: 스터디 설계의 개략적 표현. 약어 : OPAD = 구강 안면 통증 평가 장치; CCI-ION = 안와 신경의 만성 수축 손상. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 분석을 수행하는 스파이크 막대 및 쥐의 대표 이미지. 스파이크 막대는 스테인레스 스틸 금속으로 만들어집니다. 전체 막대의 길이는 7cm입니다. 스파이크의 높이는 0.3cm입니다. 스파이크 사이의 거리는 0.5cm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 기준선에서 표준 10분 테스트 세션 및 수술 후 2주, 4주 및 6주 동안 단일 CCI-ION 및 가짜 작동 쥐의 대표적인 접촉 시도 및 핥기 데이터. 약어 : CCI-ION = 안와 신경의 만성 수축 손상; AS = 수술 후. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: Sprague-Dawley 쥐에서 CCI-ION에 따른 기계적 과민증의 발달. (A) CCI-ION이 있는 쥐(n=8)는 수술 후 4주까지 핥는 횟수가 유의하게 감소했으며 (B) 수술 주(0주차) 및 수술 후 1주일에 첫 번째 핥기에 대한 잠복기가 증가했습니다(**p < 0.01, *p < 0.05: 수술 후 주 대 기준선. #p < 0.05: CCI-ION 대 가짜). 가짜 그룹에서는 유의한 감소가 없었다(n=7, p > 0.05). (C) CCI-ION 또는 가짜 수술은 접촉 수에 큰 변화를 일으키지 않았습니다. (D) CCI-ION을 가진 래트는 수술 주 및 수술 후 3주에 L/F의 현저한 감소를 보였고 수술 2주 후에 감소 경향을 보였다. 가짜 그룹 쥐와 비교할 때,이 감소는 CCI-ION 쥐에서 유의하게 높았으며 수술 후 1 주일에 시작되어 수술 후 3 주까지 계속되었습니다. 가짜 그룹에서는 유의한 차이가 없었다(**p < 0.01, *p < 0.05: 수술 후 주 대 기준선. #p < 0.05: CCI-ION 대 가짜). 그래프에서 빨간색 선은 CCI-ION 그룹을 나타내고 파란색 선은 가짜 그룹을 나타냅니다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. 유의미한 차이는 이원 반복 측정 ANOVA에 이어 Šídák 또는 Dunnett의 다중 비교 검정으로 적절하게 분석되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

얼굴 및 구강 내 점막의 무해한 기계적 자극에 의해 유발되는 통증은 삼차 신경통 및 측두 하악 관절 장애^24,25를 포함한 구강 안면 통증 상태의 두드러진 특징입니다. 삼차 신경 병증 성 통증은 임상 적으로 잘 설명되어 있지만 설치류의 신경 병증 성 통각 수용성 행동의 평가는 어렵습니다. 반사적 행동을 측정하는 통증 분석은 전임상 통증 연구에서 가장 자주 사용되는 방법입니다. 그러나 테스트 장치 관련 스트레스, 정서적 상태를 평가할 수 없음 및 실험자 편향은 반사 분석²⁶의 유용성과 유효성에 대한 우려를 제기합니다.

이 연구는 쥐의 구강 안면 영역에서 기계적 민감도 평가를 소개하여 조작 기반 통증 분석을 사용하여 CCI-ION에 대한 민감성을 입증합니다. 동일한 조작 시스템을 사용하여 마우스의 기계적 감도를 테스트 할 수도 있습니다. 마우스 및 래트 균주는 CCI-ION에 대한 반응에 변화를 나타낼 수 있으며, 따라서 기계적 과민 반응의 수준이 다를 수 있습니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, Sprague-Dawley 쥐는 일반적으로 CCI-ION 후 2 주에 안정적인 기계적 과민증이 발생하고, CCI-ION 후 4 주 후에 회복되기 시작하며, CCI-ION의 6 주 후에 수술에서 회복되는 것을 봅니다.

이 프로토콜에서는 핥기 횟수와 접촉, L/F 및 첫 번째 핥기에 대한 대기 시간을 측정하여 기계적 과민증을 정량화했습니다. 데이터는 CCI-ION이 L/F와 핥는 반응의 수를 감소시키고 첫 번째 핥기 반응에 대한 잠복기를 증가시킨다는 것을 보여주었으며, 이는 동물이 구강 안면 통증 민감도 증가로 인해 스파이크 막대에 얼굴을 누르기를 꺼린다는 것을 나타냅니다.

OPAD는 동물이 맛있는 보상에 접근하기 위해 통각 자극을 견뎌야 하는 보상 충돌 분석입니다. 분석에서 핥는 행동은 식욕을 돋우는 행동의 영향을 받을 수 있습니다. 또한이 연구에서는 얼굴 털이있는 쥐를 사용했습니다. 조작적 통증 분석에 대한 이전 경험에 기초하여, 설치류 중에서 무모 균주가 안면 접촉을 감지하는 데 더 좋습니다¹⁶; 그러나 출판 당시에는 털이 없는 쥐 균주가 더 이상 상업적으로 이용 가능하지 않았습니다. 이것은 연구의 한계로 간주 될 수 있습니다. 우리는 또한 암컷 Sprague-Dawley 쥐 만 사용했기 때문에 통증 반응의 성별 및 긴장 관련 차이를 예상해야합니다.

또한 분석을 통해 최적의 결과를 보장하기 위한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 정확한 핥기 및 접촉 데이터는 참조된 소프트웨어에서 각각 빨간색과 흰색 블록으로 나타나야 합니다( 그림 3 참조). 스파이크와 우유병 사이의 거리는 실험의 성공에 매우 중요합니다. 우유병의 끝이 너무 앞으로 가면 동물이 스파이크와 접촉하지 않고 소프트웨어가 연락처를 올바르게 등록하거나 번호를 핥지 않습니다. 반대로, 우유 병이 너무 멀리 떨어져 있으면 연락처가 등록되지만 동물은 우유에 도달 할 수 없습니다. 훈련 세션 중에 핥기 데이터는 우유병 끝이 너무 앞쪽에 있기 때문에 단색 흰색 블록으로 나타날 수 있습니다. 우유병을 뒤로 밀면 빨간색 고체 블록으로 바뀝니다. 어떤 이유로 핥기 데이터가 표시된 거리에서 흰색 블록으로 나타나기 시작하면 병을 약간 밀고 우유 홀더를 약간 아래쪽/위쪽으로 움직이면 도움이 될 수 있습니다.

여기에 설명된 구강안면 조작성 통증 시스템의 한계로 몇 가지 점을 고려할 수도 있습니다. 설치류의 훈련이 필요하며 몇 주가 걸립니다. 각 테스트 세션 전에 쥐에서는 음식 제한이 필요하지만 쥐에서는 필요하지 않습니다. 단식되지 않은 마우스는 금식 마우스에 비해 핥는 횟수가 낮고 일관되지 않은 것으로 나타났습니다²⁷. OPAD 시스템은 보상 충돌 모델이기 때문에 동물의 식욕 행동이나 식욕에 영향을 미치는 약물의 영향을받을 수 있습니다. 다중 장치를 갖는 것은 또한 동물을 시험하는 전체 시간을 단축시키는데 유리하며, 이는 비용을 증가시킬 수 있다. 그러나 구강 안면 조작 통증 분석은 동시에 여러 동물을 테스트 할 수 있고 동물 실험자 상호 작용을 제한하기 때문에 기존의 반사 기반 분석보다 여전히 유리합니다.

통증 상태 동안의 조작적 조건화는 결과에 따라 인간과 동물의 행동을 수정합니다²⁸. 따라서 보상-충돌 모델을 사용하면 동물이 조작적 반응을 수행할 수 있기 때문에 통증 상태를 평가하는 데 유리합니다. 이것은 조작적 행동의 특성이 의도, 동기 부여 및 일반적으로 피질 처리²⁹를 포함하기 때문에 임상적으로 더 관련이 있습니다. 동물이 자발적으로 보상 병에 접근하고 언제든지 스파이크 막대에서 자유롭게 철수 할 수 있기 때문에 뇌의 더 높은 중심을 통합하고 통증¹⁰과 관련된 정서적 동기 부여 상태를 평가할 수 있습니다. 따라서 조작적 통증 분석은 생체 내에서 통증 및 진통제를 평가할 때 우수한 데이터를 제공합니다. 그들은 또한 삼차 시스템의 통각 과정을 이해하는 데 도움을 주어 구강 안면 통증 분야의 발전에 기여합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANY-maze Video Tracking Software	Stoelting	60000
Bottle cleaning brushes	ANY	ANY	Different size brushes for bottles and tubes
Chromic gut suture size 5-0	Ethicon	687-G
Dish soap	ANY	ANY	Liquid
Dish sponge	ANY	ANY
GraphPad Prism version 9.3.1	GraphPad Software, San Diego, CA
Hotplate magnetic stirrer	Benchmark Scientific	H4000-HS
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-8440	Pivetal
Isopropyl alcohol	Fisher Scientific	60-001-56
Ophthalmic ointment	Dechra		Puralube Vet Ointment, petrolatum ophthalmic ointment
Operant Pain Assessment Device (OPAD) System	Stoelting	67500
Oxygen tank			Medical
Paper towel	ANY	ANY
Plastic food wrap	ANY	ANY
Polygon stir bars	Fisher Scientific	14-512-124
Reusable glass Berzelius beakers (1 L)	Fisher Scientific	FB1021000
Scalpel blade #15	FST	10015-00
Small animal anesthesia system	VetFlo	VetFlo-1205S
Spoon	ANY	ANY
Sprague-Dawley rats, female	Charles River Laboratories,  USA
Stereo boom microscope	Omano	OM2300S-GX4
Sweetened condensed milk	Borden		Eagle Brand
Tissue adhesive	3M Vetbond	1469SB
Water circulating heating pad and pump	Gaymar	Model TP-500