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요약

긴급한 뎅기열 진단 요구 사항을 해결하기 위해 임상 혈청/혈액 샘플에서 뎅기열 NS1 항원 농도를 정량화하기 위한 스마트폰 앱 통합 뎅기열 NS1 종이 기반 분석 장치(DEN-NS1-PAD)를 소개합니다. 이 혁신은 자원이 제한된 환경에서도 다양한 의료 환경에서 임상적 의사 결정을 지원함으로써 뎅기열 관리를 향상시킵니다.

초록

흰줄숲모기에 의해 전염되는 뎅기열 바이러스(DENV) 감염은 열대 및 아열대 국가에서 주요 공중 보건 문제입니다. 연간 약 1,000만 명의 환자가 발생하고 20,000-25,000명이 사망하는 상황에서, 특히 어린이들 사이에서 실용적인 진단 도구가 시급히 필요합니다. 초기 감염 시 뎅기열 비구조 단백질 1(NS1)의 존재는 사이토카인 방출, 혈관 누출 및 내피 기능 장애와 관련이 있어 중증 뎅기열의 잠재적 표지자가 될 수 있습니다.

측면 유동 분석(LFA) 및 미세유체 종이 기반 분석 장치(PAD)와 같은 종이 기반 면역분석법은 단순성, 신속성, 저렴성, 특이성 및 해석 용이성으로 인해 진단 테스트로 인기를 얻고 있습니다. 그러나 뎅기열 NS1 검출을 위한 기존의 종이 기반 면역분석법은 일반적으로 육안 검사에 의존하여 정성적 결과만 산출합니다. 이러한 한계를 해결하고 감도를 향상시키기 위해 스마트폰 애플리케이션을 비색 및 정량 판독기로 통합하는 종이 기반 분석 장치(PAD), 즉 DEN-NS1-PAD에서 휴대성이 뛰어난 NS1 뎅기열 검출 분석을 제안했습니다. 개발 시스템을 통해 임상 샘플에서 NS1 농도를 직접 정량화할 수 있습니다.

환자로부터 얻은 혈청 및 혈액 샘플을 사용하여 시스템 프로토타입 성능을 시연했습니다. 결과는 즉시 얻어졌으며 시설이 잘 갖춰진 의료 시설과 자원이 제한된 환경 모두에서 임상 평가에 사용할 수 있습니다. 종이 기반 면역분석법과 스마트폰 애플리케이션의 혁신적인 조합은 뎅기열 NS1 항원의 향상된 검출 및 정량화를 위한 유망한 접근 방식을 제공합니다. 육안의 능력을 넘어 감도를 높임으로써 이 시스템은 특히 외딴 지역이나 소외된 지역에서 뎅기열 관리의 임상적 의사 결정을 개선할 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다.

서문

뎅기열 바이러스(DENV) 감염은 가장 빠르게 퍼지는 모기 매개 질병1이며, 전 세계적으로 3억 9천만 명 이상이 9,600만 건의 증상 감염, 200만 건의 중증 질환 사례에 감염되어 있으며, 매년 25,000명 이상이 사망하고있습니다 1,2. 세계보건기구(WHO)에 따르면 약 39억 명이 뎅기열에 걸릴 위험이 있습니다. ~70%는 아시아 태평양 국가와 주로 동남아시아에 거주합니다3. 2019년 WHO에 보고된 뎅기열 발병 건수는 420만 건이며, 태국은 뎅기열 감염으로 최소 136,000건의 뎅기열 발병과 144건의 사망 사례에 기여했다4. 태국의 뎅기열 발병은 4월부터 12월까지 우기에 도시와 농촌 지역, 특히 북동부 지역에서 발생합니다.

DENV 감염은 무증상 증상인 경증 뎅기열(DF)에서 중증 뎅기 출혈열(DHF)에 이르기까지 다양한 임상 증상을 보입니다. 중증 DHF 질환의 주요 특징은 혈관 투과성 증가에 이어 쇼크와 장기 기능 장애가 뒤따른다1. 혈관 누출을 유발할 수 있는 분자 경로를 이해하는 것은 효과적인 뎅기열 치료법을 개발하는 데 매우 중요합니다. 뎅기열 비구조적 단백질 1(NS1)은 초기 바이러스 감염 시 분비되는 당단백질(glycoprotein)이다 5,6 바이러스 RNA 복제를 위한 보조인자(cofactor)로 기능한다7. NS1은 사이토카인 방출을 유발하고 톨 유사 수용체 4(TLR4) 및 내피 당칼릭스 8,9에 결합하여 혈관 누출에 기여할 수 있습니다. 체외 연구에 따르면 NS1은 내피 세포와 상호 작용하여 세포 사멸을 유도합니다. 이 상태는 내피 기능 장애와 혈관 누출의 원인이 될 수 있다10. 혈청 인터루킨(IL)-10 수치와 상관관계가 있는 NS1 항원 수치는 중증 임상질환 환자에서 유의하게 증가했다11. 뎅기열 NS1은 또한 IL-10을 유도하고 DENV 특이적 T 세포 반응을 억제하여 질병 발병에 기여합니다12,13. 또한 뎅기열 NS1 단백질은 중증 임상질환과 관련이 있었으며, 발병 후 첫 3일 동안 NS1 > 600ng mL-1의 농도는 DHF14의 발병과 관련이 있었다.

DHF 환자에서 뎅기열 NS1 항원의 지속성은 중증 뎅기열6의 표지자로 사용될 수 있습니다. 임상 샘플에서 NS1을 검출하는 방법에는 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA) 및 신속 검사15와 같은 여러 가지가 있습니다. 임상 환경에서 NS1 단백질의 농도를 측정하기 위한 황금 표준은 ELISA 분석법입니다. 그러나 ELISA 방법은 비용이 많이 들고 숙련된 인력과 실험실 시설이 필요합니다16. 따라서 현장 검사(POCT)에서 NS1 단백질을 검출하고 정량화하는 기술 개발은 여전히 진행 중입니다. 지난 10년 동안 측면 유동 분석법(LFA) 및 미세유체 종이 기반 분석 장치(μPAD)와 같은 종이 기반 면역분석법은 단순성, 신속성, 저렴성 및 특이성으로 인해 진단 검사로 인기를 얻었습니다 17,18,19. 종이 기반 면역분석에서는 금 나노 입자 (AuNP) 20, 자성 나노 입자21,22, 양자점23 및 형광 물질24,25와 같은 여러 표지가 신호를 생성하는 데 사용되었습니다. AuNP는 저렴한 생산 비용, 제조 용이성, 안정성 및 간단한 판독으로 인해 종이 기반 면역분석에 사용되는 가장 일반적인 라벨입니다. 현재 뎅기열 NS1에 대한 측면 유동 분석(LFA)은 임상 환경에서 널리 사용되고 있습니다26,27. 그러나 기존의 LFA 라벨 검출은 일반적으로 육안을 사용하며 정성적 결과만 제공합니다.

지난 10년 동안 전 세계적으로 50억 대 이상의 스마트폰이 널리 사용되었으며 휴대용 감지 기능을 개발할 가능성이 있습니다28,29. 스마트폰은 내장형 물리적 센서, 멀티코어 프로세서, 디지털 카메라, USB 포트, 오디오 포트, 무선 및 응용 소프트웨어와 같은 다기능 용량을 갖기 때문에 다양한 바이오센서 플랫폼(30)에서 사용하기에 적합하다. 또한, 무선 기술을 통해 데이터를 신속하게 전송할 수 있으며 실시간 및 현장 모니터링에 사용할 수 있습니다(31). Mudanyali et al.은 종이 기반 면역분석법과 스마트폰을 결합하여 말라리아, 결핵 및 HIV32에 대한 휴대용, 장비가 필요 없고 빠르고, 저렴하고, 사용자 친화적인 POCT 플랫폼을 개발했습니다. Ling et al.은 우유에서 알칼리성 인산가수분해효소 활성을 정량적으로 검출하기 위해 스마트폰 카메라와 결합된 측면 유동 분석을 보고했습니다33. Hou et al.은 또한 측면 유동 분석에서 색상 또는 형광의 정량적 신호에 대한 스마트폰 기반의 이중 양식 이미징 시스템을 개발했습니다(34). 또한, 스마트폰을 비색 및 정량 판독기로서 사용하는 것은 감도를 향상시킬 수 있는 반면, 육안으로는 표적(35)의 존재를 자신 있게 보고할 수 없다.

뎅기열 진단의 돌파구를 제시하는 DEN-NS1-PAD 36,37,38(이하 장치라고 함)은 휴대가 간편하고 효율적인 솔루션을 제공합니다. 왁스 프린팅 미세유체 종이 기반 기술을 사용하는 이 장치는 이미지 처리를 통해 높은 감도와 특이성으로 NS1을 정량화합니다. 그 유용성을 더욱 향상시키기 위해 우리는 비색 및 정량 판독을 위한 사용자 친화적인 스마트폰 앱을 개발했습니다. 태국 병원의 환자 샘플을 사용한 임상 검증은 실시간 환자 평가에 대한 즉각적인 영향을 강조합니다. 당사의 혁신은 간소화된 현장 진료 뎅기열 관리의 중추적인 발전을 의미하며, 자원이 제한된 의료 환경에서 진단에 혁명을 일으킬 것을 약속합니다.

프로토콜

태국 방콕 프라몽쿳클라오 병원(Phramongkutklao Hospital, Phramongkutklao Hospital, Thailand, Royal Thai Army Medical Department, Royal Thai Army Medical Department, Institutional Review Board)의 윤리위원회(Ethics Committee of the Institutional Review Board, Royal Thai Army Medical Department, Phramongkutklao Hospital, Bangkok, Thailand (IRBRTA 1218/2562))는 승인을 승인했습니다. 이 연구를 수행함에 있어 우리는 필요한 모든 윤리 규정을 준수했습니다.

1. 종이 기반 면역분석법의 장치 제작

참고: 종이 기반 면역분석 장치는 이전에 확립된 방법36,37 및 태국 특허 요청 번호 19010081638에 따라 제작되었습니다.

  1. 설계 및 패턴 도면: 컴퓨터에서 18개의 PAD 왁스 패턴으로 종이 분석 장치(그림 1A,B)를 설계합니다.
    참고: 이 디자인은 A5 크기 용지에 맞게 설계되었습니다. PAT 수는 사용자가 요구하는 용지 크기와 관련이 있습니다.
  2. 디자인된 패턴을 왁스 프린터를 사용하여 셀룰로오스 종이에 인쇄합니다(재료 표).
  3. 왁스로 인쇄된 종이를 실험실 오븐에서 150°C에서 75초 동안 녹입니다. 그런 다음 후속 단계에 필요할 때까지 실리카 상자에 보관하십시오.
  4. 0.5μL의 0.025% 폴리-L-라이신(PLL)을 테스트 영역과 대조 영역 모두에 적용합니다. 실리카 상자에서 실온(RT)에서 2분 동안 배양한 다음 65°C의 오븐에서 5분 동안 가열합니다.
  5. 대조군에 염소 항마우스 IgG 항체 1μg-1 0.5μL를 투여하고, 포획 항체 1μL-1 0.5μL를 시험부위에 도포합니다. 방울을 실온의 실리카겔 상자에서 30분 동안 건조시킵니다.
  6. 차단 완충액 2 μL를 샘플 영역에, 3 μL를 접합체 영역에, 2 μL를 검출 영역에 적용합니다. 방울을 실리카겔 상자에서 30분 동안 실온에서 건조시킵니다.
  7. 2μL의 금 나노입자-항체 복합체(AuNPs-Ab) 용액을 접합체 부위에 적용하고 실온의 실리카겔 상자에서 30분 동안 건조시킵니다.

2. 종이 기반 면역분석의 조립

  1. 접착 플라스틱 백킹 카드의 뒷면에 있는 보호 필름을 조심스럽게 제거하여 접착제가 노출되도록 합니다.
  2. 처리된 셀룰로오스 종이를 접착 플라스틱 백킹 카드에 맞추고 두 층을 함께 단단히 누릅니다.
    알림: 장치의 오염이나 손상 위험을 최소화하기 위해 친수성을 만지지 마십시오.
  3. 플라스틱 필름을 붙여서 종이를 코팅하고 함께 누릅니다.
  4. 완전히 조립된 장치 시트에서 가위를 사용하여 원하는 장치를 자릅니다.
  5. 이제 DEN-NS1-PAD(그림 1C)를 사용할 준비가 되었습니다. 장기 안정성을 위해 4 °C에서 보관하십시오.

3. AuNPs-Ab 접합체의 제조

참고: AuNPs-Ab는 이전에 Prabowo et al.36에 의해 기술된 바와 같이 제조되었다.

  1. PBS에 10μL의 1mg mL-1 anti-NS1 항체, 1mL의 40nm AuNP 콜로이드 및 0.1mL의 0.1M 붕산염 완충액(pH 8.5)을 결합합니다.
  2. 혼합물을 50rpm에서 60분 동안 회전시키고 상온에서 배양합니다.
  3. BBS에 0.1mL의 10mg mL-1 BSA를 적용하고 50rpm으로 회전하고 실온에서 15분 동안 배양합니다.
  4. 용액을 20,187× g 및 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다.
  5. 조심스럽게 피펫팅하고 침전된 AuNPs-Ab에서 상층액을 분리합니다.
  6. AuNPs-Ab를 500 μL의 BBS에 재현탁시키고 초음파 처리를 사용하여 분산시킵니다.
  7. 20,187× g 및 4°C에서 30분 동안 원심분리를 반복합니다.
    알림: 분산 및 원심분리 과정을 3번 반복합니다.
  8. 50μL의 conjugate buffer를 현탁액에 추가하여 conjugate 영역에 적용할 수 있도록 합니다.

4. 모바일 애플리케이션 개발

  1. 이미지 처리 및 기계 학습 개발
    1. DEN-NS1-PAD의 900개 이상의 자동 초점 이미지를 수집하고 다양한 농도, 카메라 브랜드(12-13메가픽셀), 회전(90° 및 180°) 및 조명 설정과 같은 다양한 조건을 캡처하여 지도 이미지 모델에 대한 데이터 세트를 수집합니다. 각 특정 조건에서 30개의 이미지를 목표로 합니다.
    2. Identifying two regions of interest(관심 영역 2개를 식별하고 지도 학습을 위해 수집된 이미지 내의 테스트 및 제어 영역으로 주석을 달아 실측 자료에 레이블을 지정합니다).
    3. 배경 스트립을 식별하는 알고리즘을 설계합니다. 테스트 영역과 제어 영역 사이의 중심선을 찾고, 중간점을 계산하고, 동일한 회전 방향을 유지하면서 두 주 영역의 평균 크기에 비례하는 정사각형 영역을 설정합니다.
    4. 4.1.1단계와 4.1.2단계의 데이터셋과 실측 자료 레이블을 사용하여 이미지 분할 모델을 생성하여 관심 영역을 식별하기 위한 이미지 분할 모델을 훈련시킵니다.
  2. 응용 프로그램 알고리즘
    1. 훈련된 영상 분할 모델을 새 영상에 적용하여 테스트 영역, 대조 영역, 배경 영역을 자동으로 찾습니다.
    2. 기본 이미지 처리 기술을 사용하여 세 가지 관심 영역(테스트, 제어 및 배경) 각각에 대한 단일 강도 값을 얻을 수 있습니다.
    3. 이미지를 3D 배열 표현(y, x 채널)으로 변환하여 픽셀 값에 액세스합니다.
    4. RGB 값을 평균화하여 이미지를 회색조로 변환하고 수식 (255-x)를 사용하여 반전을 적용합니다.
    5. 배경 영역 값을 빼서 테스트 영역과 제어 영역의 값을 정규화합니다.
    6. 미리 설정된 보정 곡선을 사용하여 NS1의 농도를 계산합니다.
    7. 정규화된 그레이스케일 강도37에서 파생된 컷오프 값 0.1103을 기준으로 결과를 양성 또는 음성으로 분류합니다.

5. 교정 곡선 및 감도

  1. 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 및 1.0μg mL-1 농도의 보정을 위해 인간 혈청에서 NS1 샘플을 준비합니다.
  2. 각 농도의 50μL를 샘플 영역에 떨어뜨리고 세 번에 걸쳐 측정을 수행합니다.
  3. 샘플을 장치에 완전히 심우하면 결과를 얻는 데 20-30분이 걸릴 수 있습니다.
  4. 배양 5분 후 디지털 카메라나 스마트폰을 사용하여 장치의 이미지를 캡처합니다.
  5. ImageJ 및 사용자 지정 모바일 애플리케이션을 사용하여 테스트 및 제어 영역을 분석합니다.
  6. ImageJ 및 모바일 애플리케이션의 데이터를 기반으로 검량선을 구성합니다.
  7. 아래 방정식 (1-3)을 사용하여 블랭크 한계 (LOB), 검출 한계 (LOD) 및 정량화 한계 (LOQ)를 계산하십시오.
    LOB = 빈 데이터의 평균 + 1:645* ð(빈 데이터의 표준 편차) (1)
    LOD = LOB +1:645*ð (최저농도 데이터의 표준편차) (2)
    LOQ = 빈 데이터의 평균 + 10*ð(빈 데이터의 표준 편차) (3)

6. 임상 샘플로 종이 기반 면역분석 수행

  1. 입원 첫날 30명의 환자로부터 300μL의 말초 혈액을 수집하여 우수한 임상 관행에 따라 보라색 상단 EDTA 튜브로 처리합니다.
  2. 혈액을 2,884× g , 4°C에서 20분 동안 원심분리합니다.
  3. 피펫을 사용하여 액체 성분(플라즈마)을 깨끗한 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다.
  4. 후속 분석을 위해 혈장을 -20°C의 냉동고에 즉시 보관합니다.
  5. 20μL의 플라즈마를 장치 상단의 샘플 영역에 적용합니다. 그런 다음 세척 완충액 30μL(1x 인산염 완충 식염수에 0.05% v/v 트윈 20)를 추가합니다.
  6. 샘플을 장치에 완전히 심우하면 결과를 얻는 데 20-30분이 소요될 수 있습니다.
  7. 실온에서 5분 배양 후 디지털 카메라 또는 스마트폰을 사용하여 장치의 이미지를 캡처합니다.
  8. ImageJ 및 사용자 지정 모바일 애플리케이션을 사용하여 테스트 및 제어 영역을 분석합니다.

7. 모바일 어플리케이션을 통한 정량화

참고: 종이 기반 면역분석법의 강도는 모바일 애플리케이션에서 분석됩니다(그림 2).

  1. 개발된 모바일 애플리케이션을 스마트폰에서 엽니다.
  2. 카메라 사용 또는 갤러리에서 업로드를 선택하여 데이터 원본을 선택하거나 업로드합니다. 카메라 캡처를 통해 또는 장치의 갤러리에서 이미지를 선택하여 이 작업을 수행합니다.
  3. 분석 섹션으로 이동하여 화면에서 분석 버튼을 터치합니다.
  4. 응용 프로그램이 데이터를 분석하고 결과를 표시할 때까지 기다립니다.

결과

제조 방법을 선택하는 것은 종이 기반 면역분석 장치에서 재현 가능한 분석 성능을 보장하는 데 매우 중요합니다. 이 연구에서는 종이 기반 면역 분석을 시연하는 맥락에서 다양한 제조 공정과 재료를 탐구했습니다. 우리가 선택한 방법은 왁스 인쇄 시스템을 사용하여 종이 기반 미세 유체 장치 내에 소수성 장벽을 만듭니다. 이 접근 방식은 단순성, 속도 및 일관된 결과로 인해 두드러집니다. 참?...

토론

스마트폰 기반 리더 시스템의 중요한 설계 파라미터 중 하나는 샘플의 재현 가능한 이미징 처리를 제공하는 기능입니다. 이 연구에서는 단순성과 편의를 위해 이미징 박스나 액세서리를 사용하지 않고 12-13MP 카메라가 장착된 세 가지 스마트폰 브랜드에서 이미지를 캡처했습니다. 카메라의 해상도, 이미지 캡처 시간, 조명 조건 및 환경과 같은 이미지 캡처의 다양한 조건은 장치의 테스트 및 제어 ...

공개

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

MHP는 Universitas Islam Indonesia (UII)의 장학금 연구 기금에 감사드립니다. 저자들은 모바일 애플리케이션 개발 전반에 걸쳐 귀중한 전문 지식과 도움을 주고 원고에 기여한 Mr. Nutchanon Ninyawee에게 감사를 표합니다. 또한 저자들은 태국 과학 연구 및 혁신(TSRI), 기초 연구 기금: 2023 회계연도(프로젝트 번호. FRB660073/0164) King Mongkut's University of Technology Thonburi의 프로그램 Smart Healthcare에 따라.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Materials
0.1 M phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2) 
BBS containing 0.1% Tween 20, 10% sucrose, and 1% casein  the conjugate area treatment and blocking buffer
Borate buffered saline (BBS) (25 mM sodium borate and 150 mM sodium chloride at pH 8.2) supplemented with 1% BSA the washing buffer during the conjugation process AuNPs with the antibody
Boric acidMerck10043-35-3
Bovine serum albumin fraction V (BSA)  PAA Lab GmbH (Germany)K41-001 
CaseinMerck9005-46-3
Chromatography paper Grade 2 GE Healthcare3002-911 
Clear laminate film3M (Stationery shops)
Disodium hydrogen phosphateMerck7558-79-4
Double tape sideStationery shops
Goat anti-mouse IgG antibody MyBiosource (USA)MBS435013
Gold nanoparticles (40 nm)  Serve Science Co., Ltd. (Thailand)
Human IgG polyclonal antibody  MerckAG711-M
Mouse dengue NS1 monoclonal antibody MyBiosource (USA)MBS834415
Mouse dengue NS1 monoclonal antibody MyBiosource (USA)MBS834236
NS1 serotype 2 antigensMyBiosource (USA)MBS 568697
PBS 1X containing 0.1% Tween 20 was used as telution buffer
Plastic backing card 10x30 cmPacific Biotech Co., Ltd. (Thailand)
Poly-L-lysine (PLL)Sigma AldrichP4832
Potassium ChlorideMerck104936
Potassium monophosphateMerck104877
Sodium ChlorideMerck7647-14-5
Sodium tetraborate Sigma Aldrich1303-96-4
SucroseMerck57-50-1
Tween 20Sigma Aldrich9005-64-5
Instruments
CytationTM 5 multimode readerBioTek
Mobile phonesHuawei Y7, iPhone 11, Samsung a20
Photo scannerEpson Perfection V30
OvenMemmert
Wax printer Xerox ColorQube 8880-PS
Software
Could AutoML Vision Object Detection documentationGoogle Cloud
ImageJNational Institute of Health, Bethesda, MD, USA
Inkscape 0.91 Software

참고문헌

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