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요약

본 연구는 살리드로사이드가 부분적으로 AMPK/Sirt1/HIF-1α 경로를 통해 저산소성 HT22 세포에 미토콘드리아 보호 효과를 발휘하는 독특한 메커니즘을 확인했습니다.

초록

Rhodiola crenulata (Hook. f. et Thoms.) H. Ohba의 활성 성분인 Salidroside(Sal)는 저산소 상태에서 신진대사를 개선하고 뇌세포의 에너지 공급을 향상시켜 미토콘드리아 보호 효과를 발휘하는 것으로 밝혀졌습니다. 그러나 그 작용 메커니즘은 완전히 밝혀지지 않았습니다. 본 연구에서는 뉴클레오티드(ATP, ADP 및 AMP) 수치에 대한 Sal의 영향을 분석하기 위해 고성능 액체 크로마토그래피를 처음 사용했습니다. 그런 다음 다양한 종의 세포 및 조직에서 약물 표적 관여를 검증하고 정량화하는 데 널리 사용되는 분자 상호 작용 방법인 세포 열 이동 분석법(CETSA)을 선택하여 AMPK/Sirt1/HIF-1α 경로 관련 단백질에 대한 Sal의 친화도를 확인했습니다. 그 결과, Sal은 저산소성 HT22 세포의 ATP 및 ADP 수치를 증가시키는 동시에 AMP 수치를 감소시키는 것으로 나타났습니다. 또한, Sal은 AMPKα, p-AMPKα, Sirt1 및 HIF-1α 단백질에 대한 안정적인 결합을 나타냈습니다. 결론적으로, Sal은 AMPK/Sirt1/HIF-1α 경로를 조절하여 뉴클레오티드 함량을 조절함으로써 미토콘드리아 보호 효과를 발휘할 수 있습니다. 이 연구는 세포 샘플의 뉴클레오티드 함량 분석을 위한 방법론적 참고 자료를 제공하고 중국 전통 의학에서 유래한 화합물의 표적을 식별하고 발견하는 데 기여합니다.

서문

뇌는 높은 신진대사 요구량, 제한된 해당작용 능력, 산화적 인산화에 대한 의존성으로 인해 산소에 매우 민감합니다. 결과적으로, 높은 고도에서 저산소 환경에 노출되면 저압성 저산소성 뇌 손상(HHBI)1,2이 쉽게 발생할 수 있습니다. 역학 연구에 따르면 높은 고도에 적응하지 못한 개인이 높은 고도 지역으로 빠르게 올라갈 때 급성 고산병 발병률이 최대 75%에 달할 수 있으며 심각한 경우 치사율은 약 1%에 달합니다. 또한 의료 서비스가 없는 경우 고고도 뇌부종 또는 폐부종으로 인한 사망률이 40%3,4에 달할 수 있습니다.

HHHBI는 광범위한 임상 증상을 나타냅니다. 경증에서 중등도의 경우에는 두통, 현기증,기억 상실 등이 있으며5 중증의 경우 인지 장애, 의식 변화 및 잠재적으로 치명적인 결과를 초래할 수 있습니다5. 고산 지역에서 HHOBI의 예방 및 치료는 의학 연구의 주요 초점이 되었습니다. 예방 전략은 주로 고지대 환경에서 적절한 휴식, 균형 잡힌 식단, 적절한 영양 섭취, 적절한 신체 운동을 포함한 적응형 훈련을 포함한다 6,7. 또한 뇌 세포를 보호하고 대뇌 저산소증을 완화하기 위한 약리학적 개입은 현재 HHBI 연구의 핵심으로 남아 있습니다.

미토콘드리아는 세포 내 주요 에너지 생산 센터 역할을 하며, 세포 에너지 수요를 충족하기 위해 아데노신 삼인산(ATP)을 합성합니다. 저산소 상태에서는 미토콘드리아 에너지 생산이 감소하여 ATP 수치가 감소하고 세포 기능이 손상됩니다8. 저산소성 손상은 또한 Ca2+ 및 pH 항상성의 미토콘드리아 조절을 방해하여 세포사멸 및 괴사를 유발합니다 9,10. 미토콘드리아 기능 장애와 저산소성 뇌 손상 사이에는 상호 강화 관계가 있습니다. 한편으로, 저산소증으로 인한 미토콘드리아 손상은 세포 에너지 대사를 더욱 감소시켜 산소 결핍을 악화시켜 악순환을 일으킵니다. 반면에, 미토콘드리아 기능 장애는 세포 내 Ca2+ 수치를 상승시켜 세포사멸 폭포를 활성화하고 세포 사멸을 초래합니다11. 저산소성 뇌 손상의 기저에 있는 메커니즘은 여전히 복잡하고 완전히 이해되지 않았지만, 여러 연구에서 손상된 뉴런 미토콘드리아 에너지 대사가 발병의 중요한 요인으로 확인되었습니다12,13. 따라서 미토콘드리아 기능에 대한 추가 연구는 저산소성 뇌 손상에 대한 잠재적인 치료 대상에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

Salidroside(Sal)는 고원 식물인 Rhodiola crenulata(Hook. f. et Thoms.) H. Ohba에서 추출한 활성 성분으로 식품, 건강 제품 및 의약품에 널리 사용됩니다14. Sal의 분자식은 C14H20O7이며 2- (4- 히드 록시 페닐) - 에틸 β-D- 글루코 피라노 시드라고도합니다. 그것은 항 저산소증, 항산화 물질, 항 피로, 항 종양, 면역 조절, 항 염증, 심혈관 및 뇌 혈관 보호 효과15 , 16 , 17 등 다양한 약리학 적 특성을 가지고 있습니다. 이 중, 그것의 반대로 저산소증 효력은 가장 잘 문서화된 것의 한개입니다. 최근 연구에서는 생쥐의 고원 유도 뇌 손상에 대한 예방 및 치료 효과에 대한 잠재적 메커니즘으로 Sal의 중요한 미토콘드리아 보호 효과를 점점 더 강조하고 있습니다14,18. 그러나 Sal이 ATP, ADP 및 AMP 수치에 영향을 미치는 정확한 분자 메커니즘은 아직 잘 알려져 있지 않습니다.

AMP 활성화 단백질 키나아제(AMPK)는 세포 에너지 항상성을 유지하는 데 도움이 되는 핵심 에너지 센서 역할을 합니다. AMPK의 활성화는 Sirtuin 1(Sirt1)을 자극하여 세포 내 NAD+ 수치를 증가시킵니다19. 연구에 따르면 Sirt1은 저산소증에 의한 인자 1-알파(HIF-1α)를 조절하여 저산소증20에 대한 세포 반응을 조정할 수 있습니다. 이전 연구에서는 Sal이 뉴런 미토콘드리아 투과성 전이 기공의 개방을 억제하고, HIF-1α 매개 미토콘드리아 에너지 과정을 조절하고, 뉴런 세포사멸을 약화시키고, 혈액 뇌 장벽 무결성을 유지하여 고원으로 인한 뇌 손상으로부터 쥐를 보호한다는 것을 입증했습니다14,21. 그러나 ATP와 그 대사 산물인 ADP 및 AMP에 대한 Sal의 효과는 여전히 불확실합니다.

이를 조사하기 위해 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 이 세 가지 뉴클레오티드의 수준을 정량화했습니다. 또한, 온전한 세포에서 리간드-단백질 상호 작용을 연구하기 위해 2013년에 도입된 널리 사용되는 생물물리학 기술인 세포 열 이동 분석법(CETSA)이 활용되었습니다22. 이 방법은 일반적으로 다양한 종의 세포와 조직에서 약물 표적 관여를 검증하고 정량화하는 데 적용됩니다. 특히, 설정된 기간 동안 다양한 온도에서 약물과 함께 표적 세포 용해물을 공동 배양한 후 약물 결합 단백질은 열 안정성이 증가하여 변성 및 침전이 덜 발생합니다. 그런 다음 침전된 결합되지 않은 단백질은 원심분리를 통해 제거되고, 이후 상층액22의 웨스턴 블롯 분석을 통해 약물 표적 상호 작용이 확인됩니다. Sal의 잠재적인 분자 표적을 식별하기 위해 CETSA를 선택하여 AMPK/Sirt1/HIF-1α 경로 관련 단백질과의 결합 친화도를 평가했습니다.

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프로토콜

이 연구에 사용된 시약 및 장비의 상업적 세부 사항은 재료 표에 나와 있습니다.

1. 용액 준비

  1. 10%의 소 태아 혈청과 1%의 페니실린-스트렙토마이신을 첨가하여 Dulbecco의 변형 이글 배지(DMEM)를 완전히 준비합니다.
  2. 500μL의 인산염 완충 식염수(PBS)21에 3mg의 Sal을 용해하여 20mM Sal 용액을 준비합니다.
  3. 0.45μm 유기 멤브레인을 사용하여 크로마토그래피적으로 순수한 아세토니트릴(이동상 A) 500mL를 여과합니다.
  4. 탈이온수 1L에 시약 I 3.5mL를 첨가하여 1000mL의 이동상 B를 준비합니다. 뉴클레오티드(ATP, ADP 및 AMP) 함량 분석 키트의 지침에 따라 시약 II를 사용하여 pH를 6.15로 조정합니다( 재료 표 참조).
    참고: 시약 I 및 시약 II는 뉴클레오티드(ATP, ADP 및 AMP) 함량 분석 키트에 포함되어 있습니다.
  5. 0.22μm 수막을 사용하여 이동상 B를 여과합니다.
    참고: 이동상 B는 준비 직후 사용해야 합니다. 이동상 A와 B는 기포를 제거하기 위해 사용하기 전에 30분 동안 초음파 처리해야 합니다.
  6. 1μM ATP, ADP 및 AMP 표준 원액을 탈이온수로 희석하여 0.5μM, 0.1μM, 0.05μM, 0.01μM 및 0.005μM ATP, ADP 및 AMP 시리즈 표준 용액을 얻을 수 있습니다.
  7. 0.22μm 바늘형 미세다공성 필터 멤브레인을 사용하여 일련의 표준 용액을 필터링합니다.
    알림: 갈색 주입 병은 직렬 표준 용액을 보관하는 데 사용해야 합니다. 준비된 일련의 표준 용액은 가능한 한 빨리 사용해야 합니다.

2. 세포 배양

참고: HT22 세포 배양 및 CoCl2 자극 저산소증 모델은 이전 보고서21에 따라 확립되었습니다.

  1. Petri 접시에서 80% 합류점에 도달할 때까지 5% CO2 로 37°C에서 HT22 세포를 배양합니다. 0.25% 트립신으로 1분 동안 세포를 소화합니다.
  2. 2.1단계의 세포 2 × 105 개 세포를 완전한 DMEM(약물 처리가 없는 대조군) 또는 약물을 포함하는 완전한 DMEM(250μM CoCl2, 250μM CoCl2 + 10μM Dor, 250μM CoCl2 + 20μM Sal 및 250μM CoCl2 + 10μM Dor + 20μM Sal)이 있는 6웰 플레이트에 시드합니다. 37 ° C에서 5 % CO2로 24 시간 동안 배양하십시오.
    참고: 각 그룹에 3개의 병렬 샘플이 설정되었습니다.

3. 뉴클레오티드(ATP, ADP 및 AMP) 함량 분석

  1. 2.2단계에서 6웰 플레이트의 각 웰에 추출 시약 I 1mL를 추가합니다.
    참고: 추출 시약 I은 뉴클레오티드(ATP, ADP 및 AMP) 함량 분석 키트에 포함되어 있습니다( 재료 표 참조).
  2. 초음파 세포 파괴 장치 (전력 : 300W, 3 초 동안 초음파, 7 초 간격, 총 시간 : 3 분)를 사용하여 얼음 욕조에서 초음파 처리하여 세포를 용해시킵니다.
  3. 고속 냉장 원심분리기를 사용하여 10,304 × g 에서 4°C에서 10분 동안 용해된 세포를 원심분리합니다.
  4. 3.3단계에서 0.75mL의 상등액을 2.0mL 튜브로 옮깁니다. 추출 시약 II 0.75mL를 넣고 와류 믹서를 사용하여 흔들어 혼합한 다음 4°C에서 10 분 동안 10,304×g에서 다시 원심분리합니다.
    참고: 추출 시약 II는 뉴클레오티드(ATP, ADP 및 AMP) 함량 분석 키트에 포함되어 있습니다.
  5. 3.4단계의 상등액을 피펫으로 주입하고 0.22μm 바늘형 미세다공성 여과막을 사용하여 갈색 바이알에 여과합니다.
    참고: 추출된 샘플의 ATP, ADP 및 AMP는 안정적이지 않습니다. 모든 실험 절차는 저온 또는 얼음 위에서 수행해야 합니다. 샘플은 가능한 한 빨리 처리하고 테스트해야 합니다.
  6. 크로마토그래피 소프트웨어를 열고 다음 매개변수를 설정합니다: 주입량: 10μL; 컬럼 온도: 27 °C; 유속: 0.8mL/분; 감지 파장 : 254 nm; 감지 시간: 70분 그래디언트 용리 절차를 표 1에 따라 설정합니다.
  7. 실행 버튼을 클릭하면 자동으로 샘플을 주입하고 3.6단계에서 설정한 프로그램에 따라 직렬 표준 용액(1.7단계) 및 시료 용액(3.5단계)에서 ATP, ADP 및 AMP의 함량을 검출합니다.
    참고: 실험이 끝나면 크로마토그래피 컬럼을 98% 이동상 B로 세척하여 막힘을 방지합니다.
  8. 그래프 작성 및 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 x축에는 직렬 표준 농도를, y축에는 피크 면적을 사용하여 ATP, ADP 및 AMP의 표준 곡선을 플로팅합니다.
  9. 3.8단계의 표준 곡선 방정식을 사용하여 샘플의 ATP, ADP 및 AMP 함량을 계산합니다.

4. 세포 열 이동 분석법(CETSA)

  1. 세포를 반복적으로 피펫팅하여 프로테아제 억제제 함유 용해물(용해물: 프로테아제 억제제 = 100:1)을 사용하여 페트리 접시에서 정상 HT22 세포를 20분 동안 용해합니다.
    참고: 단백질 분해를 방지하기 위해 얼음 수조에서 이 단계를 수행하십시오.
  2. 4.1 단계의 세포 용해물을 수집하고 초음파 세포 파괴 장치 (전력 : 300W, 3 초 동안 초음파, 7 초 간격, 총 시간 : 3 분)를 사용하여 얼음 수조에서 초음파 처리합니다. 10,304 × g, 4 °C에서 20 분 동안 원심 분리기를 수집하고 상층액을 수집하십시오.
    참고: 상등액을 14개 부분으로 나눕니다: Sal을 사용한 코인큐베이션을 위한 7개 그룹과 PBS를 대조군으로 한 코인큐베이션을 위한 7개 그룹. Sal 처리된 그룹의 경우 샘플당 100μL의 상등액과 0.1μL의 20μM Sal을 추가합니다. 대조군의 경우 샘플당 100μL의 상등액과 0.1μL의 PBS를 추가합니다.
  3. 각 시료를 실온에서 30분 동안 배양한 다음 금속 가열 온도 조절 기기를 사용하여 37°C, 42°C, 47°C, 52°C, 57°C, 62°C 및 67°C에서 3분 동안 추가로 배양합니다.
  4. 4.3 단계에서 10,304 × g 에서 4 °C에서 20 분 동안 샘플을 원심 분리하고 피펫을 사용하여 상층액을 수집하십시오.
  5. 제조업체의 지침에 따라 BCA 단백질 농도 분석 키트를 사용하여 4.4단계에서 상등액의 총 단백질 농도를 측정합니다( 재료 표 참조).
  6. 제조업체의 지침에 따라 PAGE gel rapid preparation kit를 사용하여 10% 분리 gel을 준비합니다( 재료표 참조).
  7. 사전 염색된 색상 단백질 마커 3μL와 시료 14μL를 분리 겔의 웰에 로드합니다(웰당 최종 단백질 양: 20μg).
  8. 분리된 단백질을 얻기 위해 80-100mV에서 1시간 동안 전기영동 버퍼를 사용하여 겔을 실행합니다.
  9. 400mA에서 30분 동안 신속한 멤브레인 전달 용액과 샌드위치 구조(면-여과지-PVDF 막-단백질 겔-여과지-면)를 사용하여 4.8단계의 단백질을 PVDF 멤브레인으로 이동합니다.
  10. 실온에서 4.9-5시간 동안 5% 소 혈청 알부민(BSA) 용액으로 PVDF 멤브레인을 차단합니다.
    참고: 100mL의 TBS 완충액과 0.05% Tween 20을 포함하는 100mL의 TBST 용액에 5mg의 BSA 분말을 용해하여 5% BSA 용액을 준비합니다.
  11. 4.10단계의 PVDF 멤브레인을 5mL 희석된 1차 항체로 4°C에서 밤새 배양합니다.
    참고: BSA 용액(1:1000 비율)에서 기본 항체를 희석합니다.
  12. PVDF 멤브레인을 TBST로 각각 5분씩 3회 세척하여 결합되지 않은 1차 항체를 제거합니다.
  13. 4.12단계의 멤브레인을 희석된 양고추냉이 과산화효소(HRP) 결합 2차 항체로 실온에서 탈색 쉐이커에서 2시간 동안 배양합니다.
    참고: HRP 결합 2차 항체를 BSA 용액(1:10,000 비율)에 희석합니다.
  14. TBST로 멤브레인을 각각 5분씩 3회 세척하여 잔류 2차 항체를 제거합니다.
  15. ECL 화학발광 현상액으로 4.14단계의 멤브레인을 덮은 다음 이미징 시스템을 사용하여 표적 단백질 신호를 이미징합니다.
    참고: 형광 소광을 방지하기 위해 어두운 곳에서 이 단계를 수행하십시오.
  16. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 표적 단백질의 회색 값을 분석하고 정량화합니다(재료의 T able 참조).

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결과

HPLC에 의해 검출된 ATP, ADP 및 AMP의 표준 곡선은 각각 Y = 7006.5X - 222.99, Y = 5217.3X - 17.796 및 Y = 9280.1X + 22.749였습니다(그림 1A-C). HPLC에 의해 각 그룹에서 측정된 뉴클레오티드 함량은 표준 곡선을 사용하여 계산되었습니다(그림 1D-I). CoCl2 는 대조군에 비해 HT22 세포에서 ATP ?...

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토론

미토콘드리아는 HHBI 23,24,25의 치료 예방에 관여하는 주요 세포 기관입니다. 이 그룹의 이전 연구에서는 Sal이 AMPK, Sirt1 및 HIF-1α 단백질 발현을 조절하여 신경 미토콘드리아 기능을 향상시키고 HHBI21,24로부터 보호한다는 것을 확인했습니다. 그러나 저산소 세?...

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공개

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 중국 국가자연과학재단(82274207 및 82474185), 쓰촨성 과학기술부(2024NSFSC1845), 쓰촨성 과학기술부 청년 과학재단(2023NSFSC1776), 닝샤 중점 연구 개발 프로그램(2023BEG02012), 2024-2026년 중국의학협회 청년 인재 지원 프로젝트(2024-QNRC2-B07) 및 Xinglin Scholar Research의 지원을 받았습니다 Chengdu University of TCM의 홍보 프로젝트(XKTD2022013 및 QJJJ2024027).

작성자 기여:
Xiaobo Wang, Yating Zhang, Ya Hou, Rui Li 및 Xianli Meng이 이 프로젝트를 구상했습니다. Yating Zhang, Ya Hou 및 Tingting Kuang은 실험을 수행하고 데이터를 분석했습니다. Yating Zhang과 Hong Jiang이 원고를 썼습니다. Xiaobo Wang과 Xianli Meng은 원고를 수정했습니다. 모든 저자가 최종 원고를 읽고 승인했습니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetonitrileAladdinA104440
0.22 µm aqueous membraneJintengJTMF0445
0.22 µm needle type microporous filter membraneJintengJTSFM013001
0.45 µm organic membraneJintengJTMF0448
Agilent OpenLab software  AgilentVersion 2.X
Antibody-AMPKαCell Signaling Technology#2532
Antibody-HIF-1αCell Signaling Technology#41560
Antibody-p-AMPKαCell Signaling Technology#50081
Antibody-Sirt1Cell Signaling Technology#2028
Antibody-β-actinCell Signaling Technology#4970
BCA protein concentration assay kitBoster Biological Technology17E17B46
Bovine serum albuminCywin Innovation (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.SW127-02
Broad-spectrum phosphatase inhibitor (100×)Boster Biological TechnologyAR1183
Chromatographic columnAgilentSB-C18
CoCl2Sigma15862
Decolorization shakerKylin-BellTS-2
DorsomorphinMedChemExpress (MCE)HY-13418A
Dulbecco's modified eagle mediumGibco8121587
Electrophoresis bufferNCM Biotech20230801
Fetal bovine serumGibco2166090RP
Goat Anti-rabbit IgG H&L (TRITC)ZenBioScience Co., Ltd.511202
GraphPad Prism softwareGraphPad software, LLCVersion 9.0.0
High performance liquid chromatographyAgilent1260 Infinity II Prime 
High speed refrigerated centrifugeThermo Fisher ScientificLegend Micro 17R
HRP conjugated affinipure goat anti-rabbit IgG(H+L)Boster Biological Technology Co., Ltd.BA1054
HT22 cellsGuangzhou Jennio Biotech Co., Ltd.JNO-02001
Hypersensitive ECL chemiluminescence kitNCM BiotechP10300
Image J softwareNational Institutes of Healthv1.8.0
Metal heating temperature control instrumentBaiwan Electronictechnology Co., Ltd.HG221-X3
MethanolAladdinM116118
Nucleotide (ATP, ADP, and AMP) content assay kitBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.BC5114
PAGE gel rapid preparation kitBiosharpPL566B-5
Penicillin-streptomycinNCM BiotechC125C5
Phosphate buffered saline (1×)Gibco8120485
Pre-stained color protein marker (10-180 kDa)Cywin Innovation (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.SW176-02
Protein loading buffer (5x)Boster Biological TechnologyAR1112
PVDF (0.45 μm)Cywin Innovation (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.SW120-01
Rapid membrane transfer solutionCywin Innovation (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.SW171-02
RIPA lysateBoster Biological Technology Co., Ltd.AR0105
SalidrosideChengdu Herbpurify Co., Ltd.RFS-H0400191102
TBS bufferNCM Biotech23HA0102
Transmembrane bufferNCM Biotech23CA2000
Trypsin (0.25%, 1×)HyCloneJ210045
Tween 20Shanghai Canspec Scientific Instruments Co., Ltd.PM12012
Ultrasonic cell disruption apparatusNingbo Xinyi ultrasonic equipment Co., Ltd.JY92-IIDN
Visionworks imaging systemAnalytik JenaUVP ChemStudio
Vortex mixerKylin-BellXW-80A

참고문헌

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