대퇴동맥 해부성 협착증에 대한 쥐 모델 개발

요약

여기에서는 대퇴 동맥 문합을 위한 쥐 모델을 제시하여 연구자들에게 혈관 문합 협착증을 연구하고 시뮬레이션할 수 있는 귀중한 동물 모델을 제공합니다. 이러한 발전은 이 질환의 기저에 있는 병태생리학에 대한 이해를 증진하고 혈관 질환에 대한 보다 정확하고 효과적인 연구를 촉진하는 데 매우 중요합니다.

초록

혈관 수술에서 혈관 문합은 혈류를 회복하는 데 사용되는 일반적인 재건 기술입니다. 그러나 문합 재협착은 주로 수술로 인한 혈관 손상, 내막 증식 및 염증 반응으로 인해 발생하는 빈번한 수술 후 합병증입니다. 마우스 대퇴 동맥 문합 모델은 문합 재협착 및 혈관 복구의 메커니즘을 조사하는 데 널리 사용됩니다. 현미경으로 유도되는 종단 간 대퇴 동맥 문합을 통해 수술 후 혈관 손상 및 복구 과정을 정밀하게 시뮬레이션할 수 있어 재협착과 관련된 병리학적 메커니즘을 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 실험 도구를 제공할 수 있습니다. 이 연구는 생쥐의 대퇴동맥 문합에 대한 수술 기술을 개선하는 데 중점을 둡니다. 수술 기법의 개선과 기술적 세부 사항의 최적화를 통해 모델의 성공률과 재현성을 현저히 높일 수 있었습니다. 구체적인 개선 사항으로는 수술 중 개선된 혈관 처리 기술, 봉합사 재료 선택, 문합 누출 및 수술 후 폐색을 최소화하기 위한 봉합 방법 최적화가 있습니다. 이 연구는 또한 내막 증식, 문합 부위의 혈관 리모델링 및 장기 혈관 개통의 관찰을 강조합니다. 이 연구를 통해 마우스 대퇴 동맥 문합을 수행하기 위한 간결하고 효율적인 운영 가이드를 제공하여 혈관 수술의 실험적 연구에 대한 신뢰할 수 있는 기술 지원을 제공합니다. 이 연구는 관련 메커니즘에 대한 후속 조사와 치료 개입의 평가를 위한 견고한 토대를 마련합니다.

서문

혈관 문합은 혈관 재건 절차의 기본 기술로, 혈류를 회복하고 조직 복구를 촉진하는 데 중추적인 역할을 합니다. 그러나 문합 부위에서 내막 증식증(Intimal hyperplasia, IH)이 발생하면 종종 재협착이 발생하는데, 이는 장기적인 혈관 개통을 현저히 손상시키고 임상 결과와 환자 예후에 부정적인 영향을 미친다 ^1,2. IH는 평활근 세포(SMC)의 비정상적인 증식 및 이동, 세포외 기질의 과도한 침착을 특징으로 하는 수술 중 혈관 손상과 밀접한 관련이 있습니다¹. 이러한 복잡하고 상호 관련된 병리학적 과정은 재협착에 대한 예방 및 중재 전략을 알리기 위해 IH의 정확한 메커니즘을 규명해야 할 중요한 필요성을 강조합니다.

대퇴동맥 문합법의 쥐 모델은 재현성과 정밀한 제어로 인해 혈관 복구 및 관련 병리학적 메커니즘에 대한 연구에서 널리 채택되었습니다 ^3,4,5. 마우스의 End-to-end 문합을 통해 수술 후 문합 손상을 정확하게 시뮬레이션할 수 있어 IH 및 혈관 리모델링을 동적으로 관찰할 수 있습니다. 이러한 모델은 수술 후 내피 세포와 척추세포 간의 상호 작용을 연구하고 IH 발달에서 염증 반응의 역할을 평가하기 위한 이상적인 플랫폼을 제공합니다⁶. 조직학적 분석과 분자 바이오마커 검출을 결합함으로써 연구자들은 IH의 주요 동인을 종합적으로 식별하여 기본 메커니즘과 잠재적인 치료 표적에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

IH의 발달은 여러 요인에 의해 주도되며, 혈역학적 변화가 중요한 원인이다 ^1,7,8. 문합 부위에서 낮은 전단 응력 영역과 비정상적인 진동 전단 지수(OSI)는 SMC 증식 및 이동에 대한 주요 자극입니다 ^1,7. 또한, 문합 주위의 순응도 불일치와 난류는 내피 손상을 악화시켜 IH 진행을 가속화한다⁸. 이러한 결과는 문합 부위의 병리학적 변화를 완화하기 위해 수술 기법을 최적화하고 적절한 재료를 선택해야 할 필요성을 강조합니다.

최근 몇 년 동안 약물 코팅 풍선(DCB)은 IH를 감소시키는 효능이 입증되었습니다. 파클리탁셀(paclitaxel)과 같은 항증식제는 SMC의 증식과 이동을 효과적으로 억제하여 재협착의 발생을 현저히 감소시킨다⁹. 그러나 동정맥 이식편과 같은 고유량 시스템에서는 전단 응력의 급격한 변동과 높은 혈류량으로 인해 DCB의 효능이 감소할 수 있는 문제가 지속되고 있습니다¹. 향후 연구는 다양한 혈류역학적 환경에서 DCB의 적용 가능성을 개선하는 동시에 생체 재료 과학의 발전을 활용하여 수술 후 재협착을 위한 보다 개인화되고 효과적인 솔루션을 개발하는 데 중점을 두어야 합니다. 국소적 중재 외에도 당뇨병, 죽상동맥경화증, 내피 기능 장애와 같은 전신 요인이 IH 발달에 유의한 영향을 미친다¹⁰. 따라서 임상 전략은 전반적인 혈관 건강을 향상시키기 위해 이러한 전신 질환의 포괄적인 관리를 우선시해야 합니다. 동시에, IH 진행에 대한 새로운 바이오마커의 식별 및 모니터링은 조기 개입의 기회를 제공할 수 있습니다. 인공 지능을 수술 계획에 통합하면 최적화된 문합 구성의 컴퓨터 설계를 가능하게 하여 수술 성공률을 높이고 혈관 개통을 연장할 수 있는 또 다른 유망한 방법을 제공합니다.

수술 후 IH 및 관련 병리학적 메커니즘에 대한 연구에서 대퇴동맥 문합 모델은 정확성과 재현성이 두드러집니다¹¹. 이 모델은 미세수술 기법을 사용하여 생쥐의 대퇴동맥의 종단 간 문합을 생성하며, 문합 부위의 국소 외과적 외상을 정확하게 모방합니다. 이 모델의 장점은 전선으로 인한 부상 또는 기타 대안과 같은 모델과 비교할 때 특히 분명해집니다. 대퇴동맥 문합 모델의 주요 기술적 이점은 고도로 국소적이고 통제된 혈관 손상을 유도할 수 있다는 것입니다¹². 수술 외상은 문합 부위에 집중적인 충격을 가할 수 있으며, 임상 혈관 수술에서 발생하는 부상 패턴을 밀접하게 모방합니다. 이와는 대조적으로, 와이어로 인한 손상 모델은 기법이 더 단순하지만 종종 광범위한 내피 박리를 초래하여 실제 문합 수술에서 관찰되는 국소적 외상을 재현하기 어렵게 만듭니다¹³. 또한, 서로 다른 임상시험에서 와이어로 인한 손상의 깊이와 정도의 가변성은 잠재적으로 결과의 재현성을 감소시킬 수 있습니다. 와이어 손상 모델에서 손상의 광범위하고 확산된 특성으로 인해 문합 영역과 특별히 관련된 국소 IH를 조사하는 데 관련성이 떨어집니다.

본 연구에서는 대퇴동맥 문합의 쥐 모델을 활용하여 모델 성공률을 높이고 문합 부위의 장기적인 개통성을 보장하기 위해 수술 기법을 체계적으로 개선했습니다. 이러한 확립된 기반을 활용하여 본 연구는 SMC의 이동 및 증식을 관장하는 조절 경로와 IH 진행에서 염증 매개체의 역할을 포함하여 IH의 기저에 있는 분자 및 세포 메커니즘을 탐구했습니다. 본 연구를 통해 문합후 재협착의 메커니즘에 대한 새로운 이론적 통찰을 제공하고 IH를 특이적으로 하는 치료 전략 개발을 위한 실험적 기반을 확립하는 것을 목표로 합니다.

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프로토콜

이 연구는 승인되었으며, 동물은 중국 내 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 지침에 따라 처리되었습니다. 이 연구는 동물윤리위원회(Animal Ethics Committee, 승인번호: SWMU20221109-019)의 승인을 받아 동물실험의 윤리적 요건을 엄격히 준수했다. 여기서, 체중이 20-22g 사이인 남녀 모두의 8주 된 건강한 C57BL/6 마우스가 본 연구에 활용되었습니다. 동물들은 사우스웨스트 의과대학(SWMU)의 실험동물센터에 수용되었다.

1. 수술 전 절차

1. 기관에서 승인한 프로토콜에 따라 3% 이소플루란 흡입으로 마우스를 마취합니다. 마취 시작 후 수술을 진행하기 전에 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족과 같은 반사 작용의 완전한 상실을 확인하여 깊은 마취를 확인하십시오. 마취를 유도한 후 이소플루란의 농도를 1%-1.5%로 줄여 마취 상태를 유지하고 수술 과정 내내 동물이 깊은 마취 상태를 유지하도록 합니다.
2. 마우스를 수술 플랫폼에 누운 자세로 놓고 과도하게 기지개하지 않고 뒷다리를 뻗습니다.
3. 허벅지 부위에 제모 크림을 약 1분 동안 바르고 제모제를 한 다음 해당 부위를 철저히 청소하여 잔여 크림과 흩어진 털을 제거합니다.
4. 후속 수술 단계를 준비하기 위해 요오드 용액 3x로 수술 부위를 소독합니다.

2. 대퇴 동맥의 혈관 문합

1. 실체현미경으로 미세한 메스를 사용하여 허벅지 중간 부위의 대퇴골 축을 따라 약 1.5cm 길이의 절개를 만듭니다. 피부를 절개한 후 대퇴 동맥과 대퇴 정맥이 드러날 때까지 피하 조직을 분리하기 위해 둔기 절제를 수행합니다. 대퇴 동맥은 대퇴 정맥의 측면으로 위치하며 신경은 동맥의 상부 및 측면으로 위치합니다.
2. 대퇴 동맥의 1cm 부분이 완전히 노출되도록 조직을 조심스럽게 절개합니다. 지혈 겸자를 사용하여 근육과 깊은 근막을 부드럽게 분리하여 신경, 동맥 및 정맥을 노출시킵니다. 이 과정에서 신경은 가장 바깥쪽에 위치하고, 동맥은 중간에 위치하며, 정맥은 안쪽에 있습니다.
3. 둔기 박리를 사용하여 대퇴 동맥과 대퇴 정맥을 부드럽게 분리합니다. 대퇴 동맥을 완전히 노출시키기 위해 결합 조직을 분리하기 위해 미세한 집게를 사용할 때 주의하십시오. 시술 중 우발적인 바늘 부상을 방지하기 위해 대퇴 동맥 아래에 멸균 패드를 놓습니다. 그 후, 집게로 대퇴 동맥을 부드럽게 조여 혈종을 유도합니다.
4. . 작은 지혈 겸자를 사용하여 대퇴 동맥의 근위부와 원위부 끝을 조입니다. 가는 가위를 사용하여 대퇴 동맥을 깔끔하고 대칭적으로 횡단합니다.
5. 대퇴 동맥 문합 시 주사하기 위해 1mL 주사기에 1% 헤파린 식염수(일반 식염수에 1% 헤파린)를 추출합니다. 식염수를 한 번에 3-4방울씩 첨가하고 동맥에서 혈전을 제거하기 위해 여러 번 반복해서 헹굽니다.
6. 후속 봉합 중에 혈관을 지지하고 가이드와이어 중재로 인한 잠재적 손상을 시뮬레이션하기 위해 1cm 길이의 6-0 외과 봉합사를 대퇴 동맥에 삽입합니다. 봉합 과정을 용이하게 하기 위해 대퇴 동맥의 적절한 정렬과 부드러움을 확인하십시오.
7. 문합을 위해 12-0 외과용 봉합사를 사용하고 현미경으로 바늘 각도를 조정하여 바늘이 혈관의 안쪽에서 바깥쪽으로 나오도록 합니다.
8. 대퇴 동맥의 근위부에 4개, 말단부에 4개, 총 8개의 천자 부위를 만듭니다.
   1. 천자 부위가 혈관의 전방, 후방, 왼쪽 및 오른쪽 지점에 위치하며 해당 부위는 원위 및 근위 끝에 있는지 확인합니다. 이러한 지점을 선택할 때 혈관에 접근할 수 있는지 확인하고, 중요한 해부학적 구조를 피하고, 문합 중에 양호한 혈류를 유지하십시오.
   2. 펑크 직경은 선박 손상을 최소화할 수 있을 만큼 충분히 작지만 필요한 절차를 수행할 수 있을 만큼 충분히 크게 만듭니다. 12-0 봉합 바늘은 일반적으로 천자에 사용됩니다.
9. 각각 3-4cm 길이의 12-0 봉합사 4개 길이를 자르고 해당 천공 구멍을 각각 끼웁니다. 봉합사가 엉키지 않도록 느슨한 매듭을 묶는 것으로 시작하십시오.
10. 선박 지지에 사용되는 6-0 봉합사를 제거하고 매듭을 단단히 묶습니다. 문합이 완료된 후 지혈 겸자를 놓습니다.
11. 근위부에서 말단부까지 구부러진 집게로 대퇴 동맥을 부드럽게 긁어 개통성을 확인하고 혈관을 통해 혈액이 자유롭게 흐르도록 합니다. 또한 문합 부위에 명백한 누출의 징후가 있는지 주의 깊게 검사하십시오.

3. 수술 후 봉합사

1. 6-0 수술 봉합사를 사용하여 하지 피부를 봉합하고, 중단된 봉합사를 사용하여 조직의 정확한 정렬을 보장하고 근사치를 확보합니다. 상처를 봉합한 후 봉합된 부위에 요오드 팅크를 바르면 상처가 소독되고 감염 위험을 더욱 줄일 수 있습니다.
2. 수술 후 무균 상태를 유지하십시오. 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 동물을 방치하지 마십시오. 수술을 받은 동물이 완전히 회복될 때까지 다른 동물과 함께 돌려보내지 마십시오.

4. 수술 후 관찰 및 샘플링

1. 수술 부위에 염증, 과도한 부기 또는 분비물의 징후가 있는지 정기적으로 검사하십시오. 동물의 상태를 문서화하고 필요에 따라 적절한 치료를 제공합니다.
2. 수술 후 4주가 지나면 승인된 윤리 지침에 따라 마우스를 인도적으로 안락사시킵니다. 안락사의 경우, 펜토바르비탈 나트륨(150mg/kg, 복강내 주사)을 과다 투여하여 통증이 없고 인도적인 종결점을 보장한다. 무의식 상태와 반사 작용의 멈춤이 확인되면 조직 채취를 시작합니다.
   참고: 예비 연구에서^{3주 또는} 그 이전에 샘플을 채취하는 것이 내막 증식증의 형성에 도움이 되지 않는다는 것을 발견했습니다. 반대로, 5^주째 에 검체를 채취한 결과 과도한 내막 증식증이 발생했다. 이러한 과도한 성장은 후속 실험의 관찰을 방해했을 뿐만 아니라 쥐에게 잠재적인 건강 위험을 초래했습니다. 그래서 여기에서 4^주차 가 선택되었습니다.
3. 문합 부위를 중심으로 문합에서 양방향으로 약 1cm 연장된 대퇴동맥 샘플을 수집합니다. 가는 가위를 사용하여 대퇴 동맥과 주변의 모든 근육 조직을 절제합니다.
4. 절제 후 PBS에서 검체를 헹구어 잔류 혈액을 제거한 다음 추가 보존 및 분석을 위해 10% 중성 포르말린으로 1-2일 동안 고정합니다.
   참고: 10% 중성 포르말린은 조직 고정을 위한 고전적인 선택으로, 단백질을 효과적으로 가교하고 조직 구조의 무결성을 보존하여 조직의 장기 보관에 특히 적합합니다. 대조적으로, 4% 파라포름알데히드(PFA)는 세포 내 구조(예: 핵산 및 단백질)의 미세한 보존에 더 적합하고 면역조직화학 또는 면역형광 분석에 일반적으로 사용되는 순한 정착제입니다. 이 연구의 주요 목적은 세포 내 분자 또는 단백질의 정확한 국소화보다는 혈관의 조직학적 변화(예: 내막 증식 및 혈관 리모델링)를 관찰하는 것입니다. 그러므로, 포르말린의 고정 효과는 실험적 요구를 충족시키기에 충분하다. 연구에서 더 높은 분자 충실도가 필요한 경우(예: RNA 또는 단백질의 보존) PFA가 더 나은 선택일 수 있습니다.

5. 대퇴 동맥의 탈수 및 매립

1. 고정 후 샘플을 포딩 상자에 넣습니다. 대퇴 동맥 샘플을 흐르는 물로 6-8시간 동안 헹구고 자동 조직 처리기를 사용하여 조직 탈수를 처리합니다.
2. 녹은 파라핀을 임베딩 몰드에 붓고, 가열된 집게를 사용하여 대퇴 동맥을 조심스럽게 들어올린 다음 용융된 파라핀이 들어 있는 몰드에 수직으로 삽입합니다. 임베딩 박스의 뚜껑과 바닥을 분리하고 바닥을 임베딩 몰드 위에 놓습니다. 소량의 녹인 파라핀을 첨가하여 제자리에 고정하고 파라핀 블록의 기초 역할을 합니다. 기포는 꼼꼼하게 피해야 합니다.
3. 왁스 블록이 표면에 투명한 왁스 필름이 형성되는 지점까지 냉각되면 냉동 테이블에 올려 빠르게 냉각시킵니다.
4. 임베딩 몰드에서 내장된 왁스 블록을 제거하고 날카로운 칼날을 사용하여 조직 블록을 둘러싸고 있는 여분의 파라핀을 조심스럽게 다듬습니다.

6. 대퇴 동맥의 파라핀 절편의 준비

1. 마이크로톰에 칼날을 장착하고 절단을 위해 칼이 날카로운지 확인합니다.
2. 파라핀 블록을 홀더에 고정하고 블레이드를 기준으로 블록을 절단을 위한 적절한 위치로 조정합니다.
3. 내장된 조직이 완전히 절제될 수 있도록 블록을 자릅니다. 초기 섹션의 두께를 15-20μm로 설정합니다.
4. 절편 두께를 약 4μm로 조정하고 절편을 진행합니다.
5. 브러시를 사용하여 섹션을 부드럽게 들어 올리고 특수 미세 핀셋으로 따뜻한 물(약 45°C)을 채운 슬라이드 상자로 옮겨 뜨릴 수 있도록 합니다.
6. 스프레드 섹션을 현미경 슬라이드로 옮깁니다. 슬라이드를 45° 각도로 배치하여 과도한 물을 배출합니다. 그런 다음 슬라이드를 오븐에 넣고 일반적으로 37°C에서 2시간 동안 건조시킨 다음 60°C에서 1시간 동안 굽습니다.

7. Hematoxylin-Eosin 염색

1. 절대 에탄올, 95%, 80% 및 70% 에탄올을 포함한 일련의 등급화된 에탄올 농도를 사용하여 섹션을 수화하며 각 단계는 약 5분이 소요됩니다. 그런 다음 증류수로 섹션을 헹구어 잔류 에탄올을 제거합니다.
2. 헤마톡실린으로 섹션을 약 8-10분 동안 염색하고 흐르는 물로 3회 철저히 씻어 과도한 얼룩을 제거합니다.
3. 얼룩진 부분을 구별하려면 1% 염산 알코올 용액을 5-7초의 짧은 기간 동안 바르십시오.
4. 파란색을 강조하려면 1분 동안 1:400 암모니아 용액으로 섹션을 처리합니다.
5. 75% 에탄올에 담근 후 36초 동안 에오신으로 섹션을 염색합니다. 염색 후 에탄올 농도(80%, 90%, 95% 및 100%)의 오름차순으로 섹션을 순차적으로 탈수하고 각 단계는 3-5초 동안 지속됩니다.
6. 마지막으로 37°C의 오븐에서 10분 동안 섹션을 굽고 유리 슬라이드에 밀봉제를 몇 방울 떨어뜨린 다음 표본을 커버슬립으로 덮어 제자리에 고정하고 자연 건조시킵니다.

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결과

혈관 문합 수술에서 혈관 벽의 기계적 손상은 내막 세포를 활성화하고 증식을 유발할 수 있습니다. 문합 후 혈류 속도와 방향의 변화도 내막 세포의 증식을 자극할 수 있습니다. 혈관 리모델링 과정과 장기적인 혈류 불안정은 또한 지속적으로 내막 세포를 자극하여 궁극적으로 두꺼워질 수 있습니다.

대퇴동맥 문합 모델의 성공을 확인하기 위해 적출...

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토론

혈관 문합은 혈관 재건 수술에서 중요한 기술이며, 동물 모델은 수술 후 재협착의 메커니즘을 연구하는 데 중요한 역할을 합니다. 이 모델은 혈관 병리학적 변화를 조사하기 위한 통제된 접근 방식을 제공하며, 특히 재협착 중 신생아에서 과도하게 증식하는 세포의 기원을 이해하는 데 있어 그렇습니다. 증식하는 평활근 세포(SMC)의 원인은 혈관 문합 후 심각한 동맥 손상?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 Nylon Suture with Needle	Ningbo Chenghe	240102
12-0 Nylon Suture with Needle	Ningbo Lingqiao	22064
Electro-heating standing-temperature incubator	Shanghai Boxun	HPX-9272MBE
Eosin Staining Solution	Servicebio	G1005-2
Formaldehyde Solution	KESHI	50-00-0
Hematoxylin Staining Solution	Servicebio	G1005-1
Heparin Sodium	Solarbio	H8060
MAGSCANNER KF-PRO-002	KFBIO	KFPBL00200107003
Mounting medium	Wuxi Jiangyuan	220810
OLYMPUS SZ2-ILST	OLYMPUS CORPORATION	SN 9B40828
Paraffin embedding machine	YAGUANG	YB-7LF
Phosphate-Buffered Saline	Solarbio	P1010