1. 샘플 및 열 준비

1. 이 데모에서, 2 단백질의 혼합물은 양이온 교환 컬럼에 분리될 것이다: 헤모글로빈과 사이토크롬 C. 단백질 샘플및 소용돌이에 0.2 mL 평형 버퍼(pH 8.1)를 추가하여 철저히 섞는다. 2 분 동안 원심 분리기는 거품을 제거합니다.
2. 수지침이 정착할 수 있도록 5분 동안 시험관에 양이온 교환 컬럼을 놓습니다. 테스트 튜브를 링 스탠드에 컬럼으로 고정하여 똑바로 세워 있는지 확인합니다.
3. 열의 위쪽 캡을 열고 아래쪽 캡을 엽니다. 컬럼의 버퍼가 중력 하에서 테스트 튜브로 흘러 내도록 합니다.
4. 열 볼륨(이 경우 열 볼륨은 0.3 mL)으로 열을 평형 버퍼로 두 번 세척합니다. 평형 버퍼의 첫 번째 열 부피(0.3 mL)가 두 번째 열 볼륨을 추가하기 전에 폐기물 바이알에 드립하게 합니다. 이 단계를 사용하면 열이 평형 버퍼와 일치할 수 있습니다. 이 단계에서 계피 버퍼를 천천히 추가하여 수지를 방해하지 않습니다.

2. 양이온 교환 컬럼을 통해 단백질 샘플 실행

1. "언바운드 1"이라고 표시된 2mL 원심분리기 튜브에 컬럼을 넣습니다. 단백질 샘플의 0.1 mL을 조심스럽게 컬럼 의 상단에 적재합니다.
2. 샘플이 컬럼 의 상단에 로드되면 컬럼 상단에 버퍼를 추가하고 끝까지 떨어 뜨릴 수 있도록하여 평형 버퍼0.3mL로 세척하십시오. 이 단계4배(총 5개의 세척용)를 반복하고 별도의 2mL 원심분리기 튜브에서 각 세척을 수집합니다. 튜브를 "언바운드 1-5"로 레이블을 지정합니다.
3. 마지막 2 개의 세하의 경우 원심분리기는 1,000 x g에서 10 초 동안 원심분리기를 사용하여 모든 언바운드 종들이 열에서 벗어날 수 있도록 합니다. 열에 바인딩하는 모든 샘플은 이러한 세척에 없어야하지만 바인딩되지 않는 샘플은 유지되지 않고 씻어 내게 됩니다. 원심 분리는 열에서 언바운드 재료를 씻는 데 더 많은 힘을 제공합니다.
4. "바운드 1"이라고 표시된 새로운 2mL 원심분리기 수집 튜브에 컬럼을 넣습니다. 0.3mL의 용출 버퍼(높은 소금, pH 5.5)를 열 위에 놓습니다. 원심 분리는 1,000 x g에서 10 s에 대한 결과 용액을 합니다.
5. 용출 단계를 2회 더 반복하여 컬럼을 새로운 원심분리기 튜브에 넣고 0.3mL를 추가하고 10초동안 원심분리를 합니다. 이 "바운드 2 및 3"에 레이블을 지정합니다.
6. 분수에 대한 색상 변경 또는 관찰을 기록합니다. 헤모글로빈은 붉은 갈색으로 보이는 색의 단백질이며, 사이토크롬 C는 붉은 색입니다.

3. 결과: 헤모글로빈과 사이토크롬 C의 양이온 교환

1. 사이토크롬 C는 pI가 10.5이고 헤모글로빈은 6.8의 pI를 가지고 있습니다. 따라서 pH 8.1 평형 버퍼가 사용되는 경우, 헤모글로빈은 음전하되기 때문에 열에 결합하지 않습니다. Cytochrome C는 이 pH에서 양호하게 충전되며 pH가 pI를 < 때문에 열에 바인딩됩니다.
2. 헤모글로빈은 열에 바인딩되지 않기 때문에 언바운드 분수에서 관찰됩니다.
3. Cytochrome C는 양이온 교환 열에 바인딩되었기 때문에 바운드 된 분획으로 관찰됩니다.

그림 1. 언바운드 분수(헤모글로빈)와 바운드 분수(시토크롬 C)의 그림입니다.