HPLC 실험 중에 고압 펌프는 인젝터를 통해 저수지에서 이동 단계를 수행합니다. 그런 다음 부품 분리를 위해 역상 C18로 포장된 열을 통과합니다. 마지막으로, 이동상은 흡수도가 220nm에서 측정되고 폐병으로 끝나는 검출기 세포로 이동합니다. 구성 요소가 인젝터 포트에서 검출기로 이동하는 데 걸리는 시간을 보존 시간이라고 합니다.

이 실험에서는 역상 컬럼에서 분리가 수행되는 액체 크로마토그래프가 사용됩니다. 컬럼 치수는 3mm(즉, 100mm) x 100mm이며 실리카 패킹(3-μm 입자 크기)은 C18 옥타데실린실레인(ODS)으로 기능성된다. Rheodyne 6 포트 회전 사출 밸브는 처음에 작은 루프에 샘플을 저장하는 데 사용되며 밸브의 회전 시 이동 단계에 샘플을 소개합니다.

검출은 220 nm의 파장에서 흡수 분광법에 의한 것입니다. 이 실험은 검출기가 가변적이지 않은 경우 254nm에서 실행할 수 있습니다. 검출기의 데이터에는 디지털 멀티미터(DMM)를 사용하여 측정되고 데이터 수집 프로그램이 로드된 컴퓨터에서 읽는 아날로그 전압 출력이 있습니다. 생성된 크로마토그램은 샘플의 모든 구성 요소에 대한 피크를 가지고 있습니다. 이 실험을 위해, 세 가지 구성 요소는 모두 5 분 이내에 elute.

이 실험은 동위 동위 제일 상이라고 하는 단일 이동 단계 및 펌프를 사용합니다. 분리하기 어려운 샘플의 경우 그라데이션 모바일 단계를 사용할 수 있습니다. 이는 초기 이동 단계가 주로 수성 단계이며 시간이 지남에 따라 두 번째 유기 적인 모바일 단계가 점차 전체 모바일 단계에 추가되는 경우입니다. 이 방법은 시간이 지남에 따라이 단계의 극성을 제기하여 구성 요소의 보존 시간을 낮추고 가스 크로마토그래프의 온도 그라데이션과 유사하게 작동합니다. 컬럼이 가열되는 경우도 있습니다(일반적으로 40°C)는 주변 온도 변화와 관련된 보존 시간 오류를 없애는 경우가 있습니다.

역상 HPLC에서 컬럼 고정 위상 패킹은 일반적으로 C4, C8 또는 C18 패킹입니다. C4 컬럼은 주로 큰 분자량을 가진 단백질을 위한 반면, C18 컬럼은 펩타이드와 저분자량을 가진 기본 샘플을 위한 것입니다.

흡수 분광법에 의한 검출은 성분의 흡수 스펙트럼이 모두 쉽게 사용할 수 있기 때문에 압도적으로 선택의 검출 방법입니다. 일부 시스템은 전도도 또는 암페어와 같은 전기 화학 적 측정을 검출 방법으로 사용합니다.

이 실험을 위해, 이동상은 주로 20% 아세토닐릴과 80% 정제된 디온화(DI) 물이다. 소량의 아세트산이 첨가되어 이동상pH를 낮추어 고정된 패킹 단계에서 실라놀을 유지하여 비소화 상태로 유지합니다. 이렇게 하면 흡착 피크가 테일링에서 감소하여 더 좁은 피크를 제공합니다. 이어서, pH는 40% 수산화나트륨으로 조정되어 pH를 높이고 성분의 보유 시간을 줄이는 데 도움을 줍니다.

각 그룹은 표준 용액의 상이한 농도를 포함하는 7 개의 바이알 세트를 사용합니다(표 1). 처음 3은 각 피크를 식별하는 데 사용되며 마지막 4는 각 구성 요소에 대한 교정 차트를 만드는 것입니다. 표준 1-3은 교정 차트에도 사용됩니다.

표 1. 7개의 제공된 작업 표준을 준비하는 데 사용되는 재고 표준의 볼륨(각 표준의 총 부피는 50mL).

HPLC 크로마토그램은 표준의 교정곡선(그림 3)에기초하여 모든 샘플에 대해 각각 3개의 성분을 정량화할 수 있다.

이 실험 세트에서, 이러한 다이어트 소다의 12 온스 캔각각 성분의 다음 금액을 포함 결정 했다:

다이어트 콜라: 50.5 mg 카페인; 217.6 mg 아스파타메; 83.6 mg 벤조아테.
콜라 제로: 43.1 mg 카페인; 124.9 mg 아스파타메; 85.3 mg 벤조아테.
다이어트 펩시: 34.1 mg 카페인; 184.7 mg 아스파타메; 79.5 mg 벤조아테.

당연히, 모든 3 벤조아테의 대략 동일한 금액을 했다, 그것은 단지 방부제. 콜라 제품은 카페인이 조금 더 많았고, 콜라 제로는 다른 두 탄산음료보다 아스파탐이 훨씬 적었으며, 일부 향료에 구연산을 함유하고 있습니다.

다음 숫자는 3 다이어트 소다의 12 온스 캔에 카페인과 아스파타메의 실제 금액 (카페인 함량은 코카콜라와 펩시 웹 사이트에서 얻은. 아스파탐 콘텐츠는 LiveStrong.com 및 DiabetesSelfManagement.com 모두에서 얻었습니다.):

다이어트 콜라: 46 mg 카페인; 187.5 mg 아스파타메
콜라 제로: 34 mg 카페인; 87.0 mg 아스파타메
다이어트 펩시: 35 mg 카페인; 177.0 mg 아스파타메

샘플 계산(표 2):

STD#1의 카페인 농도: 카페인성분용 용액은 0.400g의 카페인을 500mL = 0.500 l → 0.800 g/L = 0.800 mg/mL로 희석했습니다.

STD#1은 이 솔루션의 1mL을 50.0 mL로 희석시켰습니다.
0.800 mg/mL * (1.0 mL / 50.0 mL) = 0.016 mg /mL = 16.0 mg / L.

STD#2는 이 솔루션의 2mL를 50.0 mL로 희석시켰습니다.
0.800 mg/mL * (2.0 mL / 50.0 mL) = 0.032 mg /mL = 32.0 mg / L.

세 가지 교정그래프(그림 4)의결과는 다음 방정식을 산출했습니다.

카페인 피크 지역 = 0.1583*[카페인 mg/L] - 0.574
아스파타메 피크 지역 = 0.02696*[아스파타메 mg/L] - 0.405
벤조아테 피크 지역 = 0.1363*[벤조아테 mg/L] - 1.192

다이어트 콜라: 카페인 피크 지역 = 10.68 = 0.1583*[카페인 mg/L] - 0.574

[카페인 mg/L] = (10.68 + 0.574)/ (0.1583) = 주입된 샘플에서 71.1 mg/L.

샘플은 2의 요인에 의해 희석되었기 때문에, 다이어트 콜라는 141.2 mg / L 카페인을 했다.

12 온스 당 금액 = (141.2 mg/L)(0.3549 mL/12-온스 캔) = 50.5 mg 카페인/캔.

그림 3. 5 가지 표준및 3 개의 샘플의 HPLC 크로마토그램.

그림 4. 3개의 구성 요소 각각에 대한 보정 곡선입니다.

표 2. 교정 곡선을 생성하는 데 사용되는 HPLC 평가판의 데이터 테이블입니다.

HPLC는 많은 응용 분야에 대한 분리 및 검출에 널리 사용되는 기술입니다. 가스 크로마토그래피(GC)는 시료가 가스 상에 있어야 하기 때문에 비휘발성 화합물에 이상적입니다. 비 휘발성 화합물은 설탕을 포함, 비타민, 약물, 그리고 대사 산물. 또한, 그것은 비 파괴적이다, 이는 각 구성 요소를 수집 할 수 있도록 추가 분석을 위해 (질량 분광법 등). 모바일 단계는 실질적으로 무제한이며, pH의 극성을 변경하여 더 나은 해상도를 달성할 수 있습니다. 그라데이션 모바일 단계를 사용하면 실제 시험 중에 이러한 변경 이 사항이 가능합니다.

인공 감미료 아스파타메와 관련 될 수 있는 가능한 건강 문제에 대 한 우려가 있다. 현재 제품 라벨링은 식이 음료 내부에 이러한 구성 요소의 양을 표시하지 않습니다. 이 방법은 카페인과 벤조아테와 함께 이러한 양을 정량화 할 수 있습니다.

다른 응용 프로그램은 물에 살충제의 양을 결정하는 포함; 진통제 정제에서 아세트아미노펜 또는 이부프로펜의 양을 결정; 선수의 혈 류에 존재 하는 성능 향상 약물 인지 여부를 결정; 또는 단순히 범죄 실험실에서 약물의 존재를 결정. 이러한 샘플의 농도와 종종 구성 요소의 ID를 쉽게 확인할 수 있지만, 한 가지 제한사항은 여러 샘플이 동일한 보존 시간에 가깝게 유지되어 동례를 할 수 있다는 것입니다.