우리가 그들의 기술 지원에 대한 마블리 실험실과 Narie 스톨러의 회원을 인정하고, 미국 심장 협회 (NCRP 과학자 개발 그랜트 0635363N)과 국립 심장, 폐, 그리고 자금에 대한 혈액 연구소 (부여 SCCOR RFA HL02 - 027).

1 부 : 달걀 생산과 수집 <ol><li> 사전 주사하는 밤, 장소에 디바이더와 탱크를 번식에 물고기를 설정합니다. 원하는 경우 총 계란의 생산을 증가하기 위해 생선 한 남성 두 여성의 비율에서 설정할 수 있습니다. </li><li> 다음날 아침은 객실 조명 후 켜십 여러 탱크에서 디바이더를 뽑아 그대로 짝짓기 시간 약 20 분 동안 수 있습니다. </li><li> 스트레이너를 사용하여 번식 케이지에서 달걀을 수집하고 달걀 물로 그들을 씻어. 계란 물을 페트리 접시에 계란을 붓고 및 전송 피펫과 unfertilized 계란과 부스러기를 제거합니다. 생선은 사출 달걀의 추가 라운드를 생성하기 위해 큰 탱크에 regrouped 수 있습니다. 그들이 단세포 단계를 통과시키는 않고 생산되는 달걀의 최대 숫자 수 있도록 계란 컬렉션의 타이밍을 조정합니다. </li><li> 100mm 페트리 접시의 뚜껑에 거꾸로 현미경 슬라이드를 놓습니다. 하나의 컬럼을 형성 슬라이드의 측면에 대한 계란 라인에 전송 피펫을 사용합니다. 계란 반대 측면에 대한 Kimwipe을 눌러 슬라이드에서 여분의 계란 물을 제거합니다. (그림 1A) </li></ol> 2 부 : 니들이 로딩, 당기 및 준비 <ol><li> micropipette의 풀러와 어리석은 퍼티의 경사로를 통해 누워하여 150mm 페트리 접시에 두 바늘과 가게에 모세관 1.0mm OD 유리를 가져옵니다. 바늘은 사전에 뽑아하실 수 있습니다. </li><li> microloader의 피펫을 사용하여 사출 재료 3 μL와 Backload 바늘. 나머지 거의 또는 전혀 거품이 때까지 바늘 끝 방향으로 볼러스 흔들어. </li><li> 공기 소스와 microinjector를 켜십시오. microinjector에 바늘을 삽입하고 하우징 내에 꽉 인감을 확보. micromanipulator은 움직임과 조정의 광범위한 수 있도록 적절한 위치에 있는지 확인합니다. 무대에서 높은 현미경의 시야 비행기, 그리고 팁의 얇은 영역에 초점에 바늘 끝을 가져와. 바늘은 피어스 chorion와 노른자 정도로 좁은하지만 일관된 비드 크기를 전달할 수 아직도 단풍 지점에서 바늘을 공략하기 날카로운 집게 한 쌍의을 사용합니다. 마이크로 미터에서 미네랄 오일 방울은 각 주입의 볼륨을 계산하는 데 사용할 수 있습니다. 오일에 주입하면, 0.1 mm의 직경을 가진 구슬은 사출 재료 500 PL (그림 1B)를 포함, 500 PL 또는 1nL의 사출 볼륨은 일반적으로 사용됩니다. 발 페달을 우울하게하고 바늘을 트리밍하고 필요에 따라 분사 압력을 조정하는 동안 비드의 크기를 모니터링합니다. 이상적인 분사 볼륨 계란 볼륨의 약 10 %를 채울 것입니다. 바늘 끝의 품질은 주입의 용이성과 결과의 품질과 일관성 모두에게 중요합니다. </li></ol> 파트 3 : 사출 <ol><li> 배아는 네 개의 세포 단계 과거 개발하지 않았습니다. 확인 이상적으로, 태아는 한 세포 단계에서해야합니다. </li><li> 당신의 반대 손으로 장소에서 접시를 들고, 계란의 열 방향으로 바늘을 낮춥니다. </li><li> 피어스 chorion의 표면 및 파쇄 또는 난황의 끊어지고위한 보면서 한 부드러운 스트로크의 노른자를 입력합니다. 난황 (그림 1C)에 주입 물질을 주사. 기포를 주입하거나 중 배아에 치명 수 있으므로 노른자를 스트레칭하지 마십시오. 선을 작업, 피펫 팁을 사용하여 일관성있는 구슬의 크기와를 유지하기 위해 필요한 압력을 조정 unfertilized 모양 또는 사출 과정에서 파괴 계란을 제거합니다. </li><li> 계란의 칼럼을 마친 후, 깨끗한 페트리 접시에 주입 계란을 이동 계란 물을 부드러운 스트림을 사용합니다. 필요에 따라 반복합니다. 컨트롤과 같은 여러 uninjected 배아 보관하십시오. 하루에 한의 끝에, 죽은 태아를 제거하고 주입 배아의 수를 기록합니다. 정기적으로 감염의 기회를 줄이기 위해 접시에 계란 물을 교체합니다. </li></ol> 4 부 : 대표 결과 주입되는 내용에 따라 배아들은 uninjected 형제보다 낮은 속도로 살아남을 수 있습니다. 다행히도, 그것이 그들의 큰 숫자를 주입하기 쉬우며, 이것이 거의 문제가 없다 그래서. morphants이 약간 지연 발전을 전시하는 것은 정상입니다. microinjection의 결과를 설명하기 위해, 우리는 유리의 단백질 하트 (Heg)의 수준을 조작하기 위해이 프로토콜을 사용합니다. Heg 정상 심장 개발에 필요한 transmembrane 단백질이다. 의 부재에서 배아는 거대한 유입 책자와 챔버 1 마음을 개발할 수 있습니다. 우리는 500 μm의의 농도에 heg, heg_e3i3_egfr1 및 heg_e4i4_egfr2, 둘은 반대 이전에 undescribed morpholinos를 주입했다. 2 일 게시물 수정에서 uninjected 형제 컨트롤은 (그림 2A와 B) 예상, 정상 나타납니다. heg_e3i3_egfr1 주사 태아가 뇌의 부종 (그림 2C)를했습니다. 이러한 morphants 대부분의 마음은 형태 변경했지만, 그들의 챔버 (그림 2D) 일반적으로 크기입니다. 공룡의 태아가 주입heg_e4i4_egfr2 전시 변수 심장 결함과 함께. 다른 대규모 유입 책자와 적당히 확대 심방 (그림 2E 및 F)를하는 동안 일부는 정상 나타납니다. 로 이전 1보고 heg 돌연변이, 방영 권 확대 유입 트랙트와 아트리움 (그림 2G 및 H)이 있습니다. 우리는 또한 cDNA 전체 길이 heg에서 베꼈는데 400 NG / μL mRNA와 wildtype 배아를 주입했다. uninjected 컨트롤이 정상적으로 개발하는 동안 (그림 3A와 B), 배아는 본체의 축, 머리와 신체의 괴사 및 정중선의 결함 (그림 3C의 단축, mRNA는 wildtype 모양에서 심각한 cyclopia에 이르기까지 phenotypes의 스펙트럼을 전시 heg로 주입 와 D). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%201%20FINAL.png" alt="" /> 주입하는 그림 1. 태아는 배양 접시에있는 현미경 슬라이드 (A) 상대 줄지어 있습니다. 사출 볼륨은 마이크로 미터에 위치 미네랄 오일에 주입에 의해 결정됩니다. 일반적으로 사용되는 500 PL,의 주사 량은 0.1 mm (B)의 직경이 있습니다. 즉시 주사 후 morpholino 또는 mRNA의 노른자 (C)에서 구두점 명소로 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%202%20FINAL.png" alt="" /> 그림 2. 2 일 게시물 수정에서 uninjected 배아는 아무런 총 결함 (A) 또는 심장 표현형 (B)가 없습니다. morpholino heg_e3i3_egfr1 주사 태아가 뇌의 부종 (C, 화살표)하지만 일반적으로 크기의 심장 회의소 (D)를했습니다. morpholino heg_e4i4_egfr2 주사 어떤 배아는 확대 유입 책자 및 심방 (E, F)가. heg 돌연변이 심각하게 확대 유입 책자와 심방을 (G, H) 있습니다. (A), (C), (E) 및 (G) 4X DIC 이미지되며 (B), (D), (F)과 (H) 20x DIC 영상입니다. = 아트리움, 그건 = 유입 트랙트. <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%203%20FINAL.png" alt="" /> 그림 3. 24 시간 게시물 수정에서 배아 그들 (B) 사이에 신경 튜브와 노 괴사 또는 정중선 결함 (A) 두 명확하게 정의된 눈을 가진 긴 직선 신체를 uninjected. heg mRNA 주사 어떤 배아는 반대로, 짧은 몸 축, 괴사, misshaped somites (C), 그리고 cyclopia (D)를 나타냅니다. (A)와 (C) 4X DIC 이미지되며 (B)와 (D) 20x DIC 이미지입니다.

<ol>
	<li>Mably, J. D., Mohideen, M. P. K., Burns, C. G., Chen, J., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=heart+of+glass+regulates+the+concentric+growth+of+the+heart+in+zebrafish.">heart of glass regulates the concentric growth of the heart in zebrafish.</a> Curr. Biol. 13, 2138-2147 (2003).</li></ol>

zebrafish 모델 시스템의 장점 중 하나는 특정 유전자 제품에 추가하거나 microinjection하여 배아에서 제거될 수있는 용이입니다. ubiquitously 특정 단백질을 overexpress하려면, mRNA 인코딩 그것은 1 세포 단계에서 노른자로 주입됩니다. 배아의 후속 개발 과정에서 RNA는 유기체에 걸쳐 분산 및 번역입니다. 반대로, 특정 단백질을 제거하기 위해, morpholinos이 사용됩니다. Morpholinos 특정 RNAS에 안티 센스 complementarity 설계 합성 oligonucleotides 있습니다. mRNAs 마찬가지로, morpholinos는 1 세포 단계에서 노른자에 주입하고 있습니다. 배아 내부 그들은 번역을 방지하는 그들의 목표 RNAS를 바인딩합니다. 각 morpholino 또는 mRNA를 위해 만들어진 있어야 주요 수정 주입 물질의 농도이다. morpholino 또는 mRNA 중 하나 너무 높은 농도가 아닌 특정 독성을 일으킬 수 있으며, 각 morpholino가 아닌 특정 결함을 유발하지 않고 효과적으로 유전자 활동을 허물고 그 최적 농도, 200 μm의 500 μm의 사이에 일반적으로 morpholino의 농도를 결정하기 위해 경험적으로 테스트해야하는 동안. 바늘 오프닝의 정확한 크기는 중요하지 않습니다. 바늘 크기, 분사 압력 및 사출 시간의 범위 내에서 정확한 볼륨 볼러스을 생산하기 위해 조정할 수 있습니다. Morpholinos은 단백질 내에 도메인의 기능 해부 등 많은 애플 리케이션을 보유하고 있습니다. 특정 엑손 - 인트론 분기점을 대상으로 설계하면 morpholinos가 발생 splicing을 방지할 수 있습니다. 우린 두 morpholinos의 영향을 조사되는 heg의 사전 mRNA에 바인딩하는 엑손 - 인트론 분기점. morpholino heg_e3i3_egfr1는 성숙한 성적에 엑슨 3 통합의 splicing 기계 방지, 엑슨 3 인트론 세 사이의 접합을 바인딩합니다. morpholino heg_e4i4_egfr2는 비슷하게 엑슨 사를 제거합니다. exons 3, 4 모두 EGF와 같은 반복을 포함하는 도메인을 인코딩. 일부 배아는 heg_e4i4_egfr2 알맞게 phenocopy 돌연변이와 함께 주입, 추가 실험은 심장 개발에 엑슨 4 Heg의 역할을 이해해야합니다. 놀랍게도, heg_e3i3_egfr1 주사 배아는 뇌 부종, heg 돌연변이에 보지 기능이 있습니다. 이 접합자의 돌연변이에 영향을받지 될 산모 기록을 바인딩하는 morpholinos의 능력으로 인해 발생했을 수 있습니다.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microinjector</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>PLI 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>Tool</td>
<td>Narishige</td>
<td>MN 153</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Puller</td>
<td>Tool</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P 97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Capillaries</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW100 F6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microloader Pipettes</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242956.003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Holder</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>MPH310</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function

공부 zebrafish의 장점 중 하나는 배아에서 단백질 수준을 조작의 용이성과 속도입니다. 대상 RNAS에 안티 센스 complementarity과 합성 oligonucleotides 아르 Morpholinos는, 특정 유전자 산물의 표현을 줄이기 위해 배아에 추가할 수 있습니다. 반대로, 처리 mRNA는 유전자 제품의 수준을 높일 수있는 배 (胚)에 추가할 수 있습니다. 배아에 mRNA 또는 morpholino 중 하나를 추가하는 차량 microinjection입니다. Microinjection은 시간당 배아들 중 수백명의 주입 수있게 효율적이고 빠른 속도입니다. 이 비디오는 microinjection에 관련된 모든 단계를 보여줍니다. 간단히, 달걀이 마련되는 즉시 수집하여 배양 접시에있는 현미경 슬라이드 대항 줄지어 있습니다. 다음 사출 소재로 로드된 미세 스쳐 바늘은 microinjector와 공기 소스에 연결하고 microinjector 컨트롤은 바람직한 사출 볼륨을 생산하기 위해 조정됩니다. 마지막으로, 바늘은 배아의 노른자 속으로 뛰어들었다이며 morpholino 또는 mRNA 퇴학입니다.

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Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

이 동영상은 morpholino 또는 mRNA가 감소 또는 후속 개발 중에 특정 유전자 제품의 수준을 높일 수있는 한 세포 단계에서 zebrafish 배아에 주입 수있는 방법을 보여줍니다.

유전자 기능을 분석 Zebrafish 배아들 중 Microinjection

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

microinjection-of-zebrafish-embryos-to-analyze-gene-function

Research

JoVE Journal

Biology

77.1K 조회수.  Harvard Medical School. 이 동영상은 morpholino 또는 mRNA가 감소 또는 후속 개발 중에 특정 유전자 제품의 수준을 높일 수있는 한 세포 단계에서 zebrafish 배아에 주입 수있는 방법을 보여줍니다.

비디오: Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

트렌스 제닉 모기를 구하는 A. aegypti의 태아의 Microinjection

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

연구

생물학

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Zebrafish 태아의 mRNA와 Morpholino의 안티 센스 Oligonucleotides의 Microinjection.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

이식에 의해 키메라 Zebrafish의 배아를 생성

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

zebrafish의 시각 기능을 연구하기 위해 optokinetic 응답을 사용하여

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

모델 생물체 유전자로 사용하기 위해 Medaka의 태아의 Microinjection

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Zebrafish 태아의 대사 프로필 분석

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional mutagenesis using fluorescent reporters to tag expression of mutated genes. Several laboratories have constructed and tested enhancer- and gene-trap vectors in zebrafish, using fluorescent proteins, Gal4- and lexA- based transcriptional activators as reporters 1-7. These vectors had two potential drawbacks: suboptimal stringency (e.g. lack of ability to differentiate between enhancer- and gene-trap events) and low mutagenicity (e.g. integrations into genes rarely produced null alleles). Gene Breaking Transposon (GBTs) were developed to address these drawbacks 8-10. We have modified one of the first GBT vectors, GBT-R15, for use with Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter and added UAS:eGFP as the secondary reporter for direct detection of gene trap events. Application of Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter provides two main advantages. First, it increases sensitivity for genes expressed at low expression levels. Second, it enables researchers to use gene trap lines as Gal4 drivers to direct expression of other transgenes in very specific tissues. This is especially pertinent for genes with non-essential or redundant functions, where gene trap integration may not result in overt phenotypes. The disadvantage of using Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter is that genes coding for proteins with N-terminal signal sequences are not amenable to trapping, as the resulting Gal4-VP16 fusion proteins are unlikely to be able to enter the nucleus and activate transcription. Importantly, the use of Gal4-VP16 does not pre-select for nuclear proteins: we recovered gene trap mutations in genes encoding proteins which function in the nucleus, the cytoplasm and the plasma membrane.

This protocol describes the method of gene trap insertional mutagenesis using Gal4-VP16 as the primary reporter and GFP/RFP as secondary reporters in zebrafish. Approximately one in ten high-expressing F0 fish yield gene trap progeny co-expressing GFP and RFP. The screening procedure can be readily scaled to adapt to the size of the laboratory performing the insertional mutagenesis screen.

제브라 피쉬의 인 Gal4을 사용하여 유전자 트래핑

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Zebrafish의 유충의 근육 기능을 평가하기 위해 수축하는 동안 힘 측정

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

높은 해상도 전체 마운트<em&gt; 제자리에서</em유전자 발현 및 기능을 연구하는 제브라 피쉬 배아에서&gt; 하이브리드

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...