우리는 기술 지원을, 원고의 비판적 읽기 라이언 길을 박사 제니퍼 Emtage 감사 및 시약 제브라 피쉬의 관리 및 박사 스티븐 C. Ekker (메이요 클리닉, Rochster, 미네소타)와 함께 도움이됩니다. 우리의 작업은 과학 기술의 템플 대학과 국립 보건원 (R01-HD061749)에 의해 지원되었다.

1. 유전자 트랩의 미세 주입에 의한 F0 세대 생산. AB와 튀빙겐 변종이 가난한 생존을 가지고있는 동안 긴 핀 (TLF)이 가장 관대 한 것 - 우리는 서로 다른 유전 적 배경의 배아 애완 동물 매장 기반의 야생형과 튀빙겐으로,이 절차에 다른 허용 오차를 표시하는 것으로 나타났습니다. <ol><li> 트랜스포존 DNA의 준비. GBT-B1 준비 (pDB783, Balciuniene 등. 준비) 표준 QIAprep의 미니 프렙 키트 (Qiagen 사 27106)를 사용하여 플라스미드 DNA. 그것은 그렇지 않으면 미니 프렙 DNA는 트랜스 포사 mRNA의 저하로 이어지는, RNA 분해 효소에 의해 오염 될 것이다, (QIAprep 절차에서 선택 사항입니다) PB 세척 단계를 포함하는 것이 필수적입니다. 주입하기 전에, 10 NG / μL에 RNase가없는 물 (Ambion AM9937)의 DNA를 희석. </li><li> 트랜스 포사 mRNA의 준비. 를 XbaI를 사용 pT3TS/Tol2 (pDB600) (13)를 선형화 mMessage 기계 T3을 이용하여 선형화 된 DNA를 표기시험 관내 전사 키트 (Ambion AM1348). 우리는 RiboLock RNA 분해 효소 억제제 (ThermoFisher Fermentas EO0381)의 0.5 μl를 추가하여 시험 관내 전사 반응을 수정했습니다. DNA 분해 효소 처리 단계 후, MinElute RNeasy 키트 (퀴 아젠 74204)를 사용하여 mRNA를 순화. 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 시험 관내 전사 된 mRNA의의 품질을 평가. 40 NG / μL에 RNase가없는 물에 mRNA의 희석 및 저장 ° C. -80에서 2 μL 씩 분주로 </li><li> 미세 주입 믹스의 제조. 주입하기 전에, 트랜스 포사의 mRNA를 2 μL 나누어지는 희석 트랜스포존 DNA의 8 μl를 추가합니다. </li><li> 미세 주입. 노른자 / 할구 인터페이스를 목표로, 표준 미세 주입 기술을 사용하여 1 셀 제브라 피쉬 배아의 노른자로 DNA / RNA 혼합물의 3 NL를 주입. 1 세포 단계에서 주입을 보장하기 위해 배아마다 20 분을 수집합니다. 우리의 경험, 숙련 된 사람은 쉽게 1 ~ 1.5 시간에 1,000 배아를 주입 할 수 있습니다. </li><li> 주입 한 후, 왼쪽의 5 μl를 실행트랜스 포사 mRNA의 분해가되지 않았는지 확인하기 위해 품질 관리를위한 1 % 아가 로스 겔에 주사액 위에. </li><li> 주입 된 배아의 관리. 늦은 오후에, 미 수정 및 비정상 배아를 제거하고 100mm 페트리 접시 당 60 ~ 80에 배아를 배포 할 수 있습니다. 이상과 죽은 태아 1 일 포스트 수정 (DPF), 2 DPF 3 DPF에서 제거됩니다. </li><li> GFP의 발현을 선별. 3 DPF에서 GFP의 형광 (그림 3)에 대한 명백한 결함이없는 화면 배아. 상영 (우리는 배 Fluar의 목적으로 자이스 AxioImager 사용) 형광이 장착 된 실체에 하나를 수행 (우리는 니콘 SMZ1500 사용) 또는 직립 현미경에있을 수 있습니다. 낮은 GFP 발현으로 인해의 RNase 오염 (그림 3A)에 실패 주입 또는 트랜스 포사의 RNA의 분해 중 하나를 나타냅니다. F보기 비교 (여러 조직에서 또는 특정 조직의 세포의 높은 비율에서 GFP 발현이 어느 밝은 배아의 약 30 %를 선택igures 3B 및 3C). 1,000 배아의 주입에서, 우리는 일반적으로 최대 100 발달 정상, 높은 GFP - 표현 배아있다. </li><li> 표준 제브라 피쉬 사육 절차를 사용하여 선택 F0 배아를 올립니다. 그것은 양육 선택 주입 된 배아의 20 ~ 30 %가 성인으로 생존 할 것으로 기대하는 것이 합리적이다. </li></ol> 2. UAS의 유지 보수 : MRFP 테스터 라인. 우리는 14xUAS를 생성 한 : 렌즈 별 γCry로 표시 MRFP 라인 : GFP. UAS는 DNA 메틸화를 통해 침묵의 대상이기 때문에, 주식을 전파하는 침묵의 낮은 수준으로 물고기를 선택하는 것이 중요합니다. <ol><li> 개인 UAS 설정 : 우리의 가장 신뢰할 수있는 인 Gal4 유전자 트랩 라인 중 하나와 짝짓기에 대한 MRFP 동형 접합자를, NSF tpl6 (Balciuniene 등 준비에.). </li><li> 다음 날, UAS를 전송 : 배아를 수집하는 동안, 개별 정적 탱크에 배아를 준 MRFP 물고기및 청소. </li><li> 1 DPF 3 DPF에서 GFP 및 RFP 형광을위한 화면 배아. </li><li> UAS의 다음 세대를 확립하기 위해 높은 MRFP 식으로 배아를 준 서로 엇 물고기 : MRFP 라인. </li></ol> 3. F0 물고기의 심사. <ol><li> MRFP 물고기 (그림 4) : 동형 접합 UAS 개별 F0을 교차. 우리는 일반적으로 야생 형 또는 표범 염색 패턴과 라인에 우리의 GBTs를 주입하고, 우리의 동형 접합 UAS : MRFP 라인은 황동 배경입니다. 따라서 GBT 주입 F0 물고기는 UAS에서 쉽게 구별 할 수 있습니다 MRFP 물고기, 상영되는 F0는 남성 또는 여성뿐만 아니라 여부를 기록 할 필요가 없습니다 기록 및 / 또는의 성별을 결정하는 실수로 인한 오류 가능성 각 물고기. 매우 제한된 경험, 등 우리 학부 학생들과 인사 따라서 설정하고 물고기의 교배를 분해 할 수 있습니다. 이 방법은 두 개의 다른 유전 배경임을 단점이있다잠재적 기능 표현형의 손실의 해석을 복잡하게 사용된다. </li><li> 다음 날, 황동 UAS를 반환 MRFP의 물고기를 자신의 탱크에. 배아를 수집하고 검사하는 동안 (우리는 하겐 엑소 테라 Faunarium 소를 사용하지만, 어떤 작은 탱크는이 목적을 위해 이용 될 수있다) 개별 정적 탱크에 배아를 준 F0 물고기를 놓습니다. </li><li> 새로운 배양 접시에 깨끗하고 전송 수집 된 배아 0 일의 오후에 (접시 당 &lt;100). </li><li> GFP 및 RFP 형광 1 DPF에서, 2 DPF 3 DPF를위한 스크린 배아. , GFP 및 RFP 중 모두 긍정적 인 배아를 당겨 GFP / RFP 발현 패턴으로 정렬 (하나 이상의 패턴 클러치에서 관찰되는 경우) 및 F1 세대를 확립을 올립니다. </li><li> (50 ~ 100 배아의 총 수 중에서) 유일한 단점 배아를 생성 F0 물고기를 안락사. </li><li> 긍정의 두 번째 배치를 얻기 위해 다시 GFP / RFP 양성 자손을 생산 F0 물고기를 교차. </li></ol> 4.F1 물고기의 심사. F1 물고기는, F2의 가족을 설정하는 유전자 트랩 발현 패턴을 문서화하고 5 &#39;RACE 및 역 PCR에 의해 유전자 트랩 유전자 좌의 분자 식별을위한 배아의 배치를 동결 상영된다. <ol><li> MRFP 물고기 (그림 4) : 동형 접합 UAS 개별 F1 물고기를 교차. </li><li> 다음 날, 배아를 수집하고 검사하는 동안 개별 정적 탱크에 배아를 준 F1 물고기를 놓습니다. </li><li> GFP 및 RFP 형광 1 DPF에서, 2 DPF 3 DPF를위한 스크린 배아. GFP 및 RFP (24) 모두에 대해 긍정적 인 별도의 사진 배아. </li><li> 5 DPF에서 20 GFP / RFP 양성 20 GFP / 역 PCR에 의한 insertionally 변이 유전자의 식별 및 5에 대한 RFP 음성 배아 &#39;RACE 9,10의 배치를 동결. F2 세대를 확립 나머지 GFP / RFP - 긍정적 인 배아를 올립니다. </li></ol>

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이 저자가 공개하는 게 없다.

여기에 설명 된 유전자 트랩 벡터와 방법론은 이미 여러 독립적 인 실험실에서 사용하고 있습니다. 우리의 경험, 그 과정에서 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째 중요한 단계는 주입 F0 배아의 유전자 트랩 통합의 높은 속도를 달성하는 것입니다. 이 단계에서 실패는 종종 주입 시약의 RNase 오염, 특히 미니 프렙 DNA에 기인 할 수있다. 그것은 유전자 트랩 실험 한 세포 단계에서 배아를 주입하는 것이 매우 중요합니다. 우리의 경험에서, Tol2 - 매개 형질 전환은 낮은 품질의 DNA 나중에 1 세포 단계 이상 또는 주입하는 경우에도 가능 형질 전환 라인을 얻을 수있다, 매우 효율적입니다. 유전자 트랩 돌연변이 유발을 수행 할 때 벡터 통합의 작은 부분이 효과적인 유전자 트랩 이벤트가 발생하기 때문에 이하의 주사는 훨씬 더 문제가된다. 두 번째 중요한 단계는 우리의 UAS에 교차에 의해 유전자 트랩 이벤트를 확인하는 것입니다 MRFP 라인. MRFP 표현의 부재입니다거의 항상 인핸서 트랩 이벤트 나타낸다. 그러나, 때때로 MRFP 발현의 부족 14X UAS의 침묵을 의미 할 수있다. 그것은 UAS를 유지하는 것이 중요하다 : NSF tpl6에 교차 할 때 높은 RFP 발현과 개인을 사용하여 다음 세대를 전파하여 비 침묵 상태에서 MRFP 라인. 우리는 우리의 유전자 트랩 벡터 및 프로토콜에 몇 가지 개선을 예상 할 수 있습니다. 제 유전자 트랩 컨스 적은 반복 UAS를 사용하는 것이다. 그것은 배 UAS는 세포 배양 실험에서 전체 활성화를 달성하기에 충분하며, 더 적은 반복 UAS 시퀀스 메틸화와 6,25를 침묵에 덜 민감 있다는 것으로 나타났습니다. 또한 국제 마우스 유전자 트랩 컨소시엄에 의해 사용되는 최근 지브라 피쉬 2,26,27 적응 벡터들과 유사하게, 완전 조건부 돌연변이 유발을위한 유전자 트랩 벡터를 설계 할 수있다. 또 다른 개선은 다른 t를 사용하는 것MRFP 기자 라인 : UAS를 생성하는 미 (美) 28 자, 예를 들어 ransposon 시스템. 이 직접 기자 라인과 incrossing로 F0s의 심사에 Tol2 기반 유전자 트랩의 주입을 가능하게합니다. 또한,이 기능 표현형의 손실의 해석은 더 간단하게, 두 개의 서로 다른 유전 적 배경의 사용을 제거한다. 심지어 이러한 개선으로, 여기에 제시된 일반 인 Gal4 유전자 트랩 프로토콜은 아직 완벽하게 적용 할 수있다.

Insertional 돌연변이는 마우스와 식물과 같은 다세포 생물로 세균과 효모 같은 단세포 생물에서 여러 모델 시스템에서 유전자 기능을 해부에 대한 강력한 접근 방법으로 입증되었습니다. 모든 외래 DNA (바이러스, 트랜스포존 플라스미드) 등의 엑손 또는 발기인으로 유전자의 필수 요소를 차단하여 돌연변이로 역할을 할 수있다. 엑손은 일반적인 척추 동물 게놈의 1 ~ 3 %를 차지하기 때문에 이러한 간단한 방식의 유효 대상, 큰 복잡한 게놈에 상당히 작습니다. 제브라 피쉬 (11, 12)에서 레트로 바이러스 insertional 돌연변이 유발의 엄청난 성공에 예시 된 바와 같이 작은 효과적인 목표의 크기가 매우 높은 벡터 통합 가격으로 극복 할 수 있습니다. 대조적으로, 인트론은 척추 동물의 게놈의 약 20 ~ 30 %를 포함한다. 효과적으로 인트론에 널 (null) 또는 통합시 심각한 hypomorphic 돌연변이를 소개 제브라 피쉬, 트랜스포존 기반 insertional 돌연변이 유발 벡터에서 &quot;유전자 파괴 transposo라는 이름의 한NS &quot;(GBTs) 8-10. 효율적인 유전자 트랩 통합을 위해, 그들은 최소한의 Tol2의 트랜스포존 13, 14을 사용합니다. GBTs의 변이원성 물고기 파생 결합 수용체와 전사 종료 / 폴리아 데 닐화 서열에 의존한다. GBT의 돌연변이에 대한 책임 요소가 측면에 있습니다 Cre 호텔 재조합 효소에 의해 절단에 대한 직접적인에 loxP 사이트에서. 따라서, 크레의 mRNA의 주입은 어떤 트랜스포존 시퀀스가 통합 궤적 9,10 유지에도 불구하고, GBT 유발 돌연변이의 효율적 복귀로 연결됩니다. 최근에 출판 된 GBT 벡터는 두 가지 잠재적 인 단점으로 이어지는, 유전자 트랩 기자 9,10로 MRFP를 사용합니다. 첫째, 그것은 직접 형광 기자 융합 단백질에 의해 감지 될 수있을만큼 충분히 높은 수준에서 표현됩니다 제브라 피쉬 유전자의 어떤 부분 알려져 있지 않다. 둘째, 유전자 중 일부분은 필수적인 기능을 가질 것으로 기대된다. 그것은 제브라 피쉬 developme에 필요한 만 1,400-2,400 유전자가있는 것으로 추정되고있다NT (15, 16). 대부분의 유전자 트랩 돌연변이는 명백한 표현형을 표시하고, 따라서 제한된 유틸리티를해야합니다 예상되지 않습니다. 이 두 가지 한계를 극복하기 위해, 우리는 기본 유전자 트랩 기자로 인 Gal4-VP16에 사용할 GBT-R15 9,10을 수정 한 (Balciuniene 등. 준비). GBT-R15의 AUG-이하 MRFP와 같이, 번역 개시 사이트 인 Gal4-VP16에서 제거되었습니다. 유전자 트랩 이벤트의 직접 탐지를 위해, 우리의 벡터는 14 배 인 Gal4 UAS (17, 18)의 제어하에 EGFP 기자가 포함되어 있습니다. 몇 가지 추가 기능은 우리의 양자 유전자 트랩 벡터로 설계된다. UAS는 : EGFP 카세트 직접 FRT 사이트 (그림 1의 회색 갈매기) 어귀이다. EGFP 형광에 의해 취소됨 유전자 트랩 돌연변이를 떠나, EGFP 카세트 : FLP 재조합 효소의 mRNA의 주입은 UAS의 절단에 이르게한다. 그러므로 GFP 형광에 의한 특정 조직이나 발생 이벤트를 표시 유전자 변형 라인에서 사용될 수있다. 기타로GBTs는 전체 유전자 트랩 카세트 직접에 loxP 사이트 (그림 1의 개방 각형)에 의해 측면에 있습니다. 이것은 쉽게 특정 유전자 트랩 통합 사이의 인과 관계의 증거를 설정하고 (그림 2) 표현형을 관찰, Cre 호텔 재조합 효소의 발현에 의한 유전자 트랩 이벤트를 뒤집을 수 있습니다. 마지막으로, 유전자 트랩 카세트 반전 I-SceI 제한 효소 meganuclease 사이트 (그림 1의 검은 색 삼각형)에 의해 측면에 있습니다. 초파리에서 트랜스포존 통합은 종종 P 요소의 부정확 절단에 의해 삭제 (결함)로 변환됩니다. Tol2의 트랜스포존 (또는 미 (美), 피기 백 (PiggyBac) 또는 AC / DS 자 등의 척추 동물에 적극적으로 다른 트랜스포존)의 절단은 삭제로 이어질 수 있다는 증거는 없습니다. 따라서 우리는 I-SceI 제한은 제브라 피쉬의 삭제를 유도 할 수있는 아무런 증거가 없음에도 불구하고, 삭제의 유도에 대한 잠재적 인 대리 방법으로 I-SceI 제한 효소 사이트를 포함. 그것은 주목해야한다 동안 I-SceI 제한 메가클레아는 제브라 피쉬의 형질 전환을 용이하게 할 수 있습니다, I-SceI 제한 효소 meganuclease에 의한 DNA 절단은 DNA 수리 효모에서 오류가 발생하기 쉬운 비 동종 최종 합류 포함 메커니즘 및 포유 동물 세포 19-22을 연구하는 데 사용됩니다. 우리의 유전자 트랩 벡터의 통합은 두 개의 서로 다른 메커니즘에 의해 EGFP 발현으로 이어질 수 있습니다. 첫 번째는 진정한 유전자 트랩 이벤트 (그림 1C)입니다 : 벡터는 유전자 (Insertionally 변이 유전자에 대한 IMG), 내생 IMG 성적 증명서 및 인 Gal4-VP16의 5 &#39;사이의 융합 성적 증명서에 통합은으로 만든 및 번역 IMG 및 인 Gal4-VP16에 의해 코드되는 단백질의 N-말단을 포함하는 융합 단백질. 이 융합 단백질은 14 배 UAS에 바인딩하고 EGFP의 전사를 활성화합니다. 두 번째, 덜 바람직 이벤트는 증강 트랩 (그림 1D)입니다 EGFP의 앞에 최소한의 발기인은 AB에서 EGFP의 생산에 이르는 통합 사이트 근처 증강의 제어에 해당인 Gal4-VP16 생산의가 나타나지 않는. 우리의 추정에서 EGFP 발현 사건의 30 % ~ 50 %가 증강 트랩에 기인하고 50~70%는 유전자 트랩 (23)에 기인 (Balciuniene 등. 준비). MRFP 유전자 변형 라인 (그림 1B), 렌즈 별 γCry에 의해 표시의 편의를 위해 : (. Balciuniene 등 준비) GFP 이벤트의 두 클래스를 구분하기 위해, 우리는 14xUAS을 만들었습니다. 유전자 트랩 이벤트는 GFP의 공동 발현 및 RFP (그림 2의 C와 D를 비교)에 의해 확인된다. 우리의 파일럿 화면에서, 우리는 트랜스포존 DNA와 트랜스 포사 mRNA의 혼합물을 주사 270 F0 물고기를 심사 한 후 40 유전자 트랩 이벤트를 회복했다. NSF와 FLR : 우리의 유전자 트랩 통합의 두 이전에 발행 된 화학적으로 유발 된 돌연변이와 유전자에 발생했습니다. 우리의 insertional 돌연변이 NSF tpl6 및 FLR의 tpl24의 표현형 표현형에서 표면적으로 구별해당 화학적으로 유발 된 돌연변이들. 우리는 또한 유전자 트랩 이벤트가 이렇게 널 (null) 대립의 가능성을 증가, 유전자의 5 &#39;말단 근처 인트론 치우쳐 나타나는 지적했다. 우리는 우리의 유전자 트랩 라인 모두 UAS의 침묵 (점박이)의 어느 정도를 관찰 할, 어떤 궤적은 분명히 다른 사람보다 잡에 더 취약합니다. 우리는 우리가 쉽게 혼자 GFP의 발현을 선택하여 적어도 다섯 세대에 걸쳐 우리의 유전자 트랩 라인의 모든 내용을 전파 할 수있게되었습니다로 UAS의 침묵은, 유전자 트랩 라인의 전파를위한 중요한 문제라고 생각하지 않습니다.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog #</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Miniprep Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>27104</td>
 <td>Optional PB wash step is a must</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>XbaI restriction enzyme</td>
 <td>ThermoFisher</td>
 <td>ER0681</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>mMessage Machine T3</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM1348</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RiboLock RNase Inhibitor</td>
 <td>ThermoFisher</td>
 <td>EO0381</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNeasy MinElute</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>74204</td>
 <td>Can be replaced by phenol extraction 			and precipitation. Do not use LiCl!</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclease-free water</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM9937</td>
 <td>Has to be non-DEPC treated</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosilicate glass capiliaries for 			microinjection needles</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>1B100F-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcapiliaries for calibration</td>
 <td>Drummond Scientific </td>
 <td>1-000-0010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microloader tips</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5242 956.003</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needle puller *</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>P-87</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope 			for microinjection * </td>
 <td>Nikon </td>
 <td>SMZ1500</td>
 <td>We also use Wild 5M and Olympus SZ61 			with transmitted light stand</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Picoinjector *</td>
 <td>Harvard Instruments</td>
 <td>Pli-90</td>
 <td>We also use Pli-100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Screening microscope with GFP/RFP 			fluorescence *</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>Zeiss AxioImager</td>
 <td>5X Fluar objective has sufficient 			working distance</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Screening microscope with GFP/RFP 			fluorescence *</td>
 <td>Nikon </td>
 <td>SMZ1500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>* We suggest this equipment only because we successfully use it in our laboratory. In each category, several comparable options from multiple manufacturers are available.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

gene trapping using gal4 in zebrafish

대형 클러치 크기와 광학적으로 투명한 배아의 외부 개발은 제브라 피쉬에게 변이 된 유전자의 발현에 태그를 형광 기자를 사용하여 생체 내 insertional 돌연변이 유발을위한 뛰어난 척추 동물 모델 시스템을 확인합니다. 여러 실험실 기자 1-7로 형광 단백질, 인 Gal4 및 LEXA 기반의 전사 활성제를 사용하여, 제브라 피쉬의 증강 및 유전자 트랩 벡터를 구성하고 테스트했습니다. 낮은 돌연변이 (거의 NULL 대립 유전자를 생성되지 유전자에 예를 들어, 통합) 차선의 엄격 성 (증강 및 유전자 트랩 이벤트를 구별 할 수있는 능력의 부족 등)이 벡터는 두 가지 잠재적 인 단점을 가지고 있었다. 유전자 속보 트랜스포존 (GBTs)는 이러한 단점 8-10을 해결하기 위해 개발되었다. 유전자 트랩 이벤트를 직접 검출을위한 보조 기자로 EGFP : 우리는 기본 유전자 트랩 기자와 추가 UAS로 ​​인 Gal4-VP16 사용하기 위해, 첫 번째 GBT 벡터 중 하나, GBT-R15를 수정했습니다.기본 유전자 트랩 기자로 인 Gal4-VP16의 pplication 두 가지 주요 장점을 제공한다. 첫째, 낮은 발현 수준에서 표현의 유전자에 대한 민감도를 증가시킨다. 둘째, 그것은 매우 구체적인 조직의 다른 형질 전환 유전자의 직접적인 표현에 인 Gal4 드라이버로 유전자 트랩 라인을 사용하는 연구자 수 있습니다. 이 유전자 트랩 통합 명백한 표현형 발생하지 않을 수 있습니다 비 본질적인 또는 중복 기능을 가진 유전자에 특히 관련입니다. 기본 유전자 트랩 기자로 인 Gal4-VP16을 사용하는 단점은 결과 인 Gal4-VP16 융합 단백질이 핵을 입력 할 수있을 가능성이과 활성화로 N-말단 신호 서열과 단백질을 코딩하는 유전자가, 트래핑에 순종하지 않는 것입니다 전사. 중요한 사실은, 인 Gal4-VP16의 사용은 핵 단백질에서 미리 선택되지 않는다 : 우리는 핵, 세포질 및 세포막에서 기능하는 단백질을 코딩하는 유전자에 유전자 돌연변이 트랩을 회수.

성공적인 분사에서, 배아의 적어도 80 %는 GFP 형광의 일부도 (도 3)을 표시 유전자 트랩 DNA / Tol2의 트랜스 포사 mRNA의 혼합물로 주입했다. 밝은 GFP - 긍정적 인 배아 (그림 3C)가, F0 풀을 설정하는 선택하면 약 10 상영 F0 물고기의 유전자 트랩 자손을 얻을 것입니다. 유전자 트랩 이벤트가 회수되는 F0 물고기 가운데, 대부분은 몇 가지가 아닌 표현 트랜스포존의 통합뿐만 아니라 하나의 유전자 트랩 이벤트를 전송합니다. 그러나, 우리는 하나의 F0 개인에서 4 유전자 트랩 회선을 설치했다. 유전자 트랩 라인에서 GFP / RFP 발현 패턴은 (후각 전구의 예를 들어) 매우 조직의 특정 상당히 유비쿼터스 이르기까지 다양합니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1.jpg" /> 그림 1. 티그는 함유 GAL4 양자 유전자 트랩 벡터 GBT-B1 및 해당 응용 프로그램. A. 인 Gal4 함유 유전자 트랩 벡터의 구성 요소 : Tol2 5 &#39;와 Tol2 3&#39;는 최소한의 Tol2의 트랜스포존 (13)을 종료, CSA, 잉어 β-액틴 결합 수용체 8 ^ 인 Gal4-VP16, AUG-이하 인 Gal4-VP16, ZP ( GBT-R15 9, 10에서 A), 제브라 피쉬의 β-액틴 3 &#39;UTR 및 폴리 (A) 요소. EGFP 발현 카셋트 17,18 : 14XUAS, EGFP 및 SV40의 P (A)는 UAS의 성분이다. 화살표는 UAS의 활성화를 나타냅니다 유전자 트랩에 의해 생산 인 Gal4-VP16로 EGFP B. 14XUAS :. GFP 카세트 : 렌즈 별 γCry로 표시 MRFP 전이 유전자. 화살표는 UAS의 활성화를 나타냅니다 MRFP 인 Gal4-VP16로 트랜스 C. 유전자 트랩 이벤트에.. 블루 박스는 엑손 있습니다. 접합은 점선. D. 증강 트랩 이벤트로 표시됩니다. 증강 (갈색 상자) 부근의 벡터의 통합 갈색 화살표에게 (이 증강의 제어하에 최소한의 EGFP 프로모터를 배치 할 수 있습니다). 이것은 EGFP의 조직 - 특이 적 발현을 초래할 것이지만, 인 Gal4-VP16은 이루어지지 않기 때문에, MRFP 발현은 활성화되지 않는다. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2.jpg" /> 그림 2. Cre 호텔 재조합 효소를 사용하여 유전자 트랩 이벤트의 복귀. 유전자 트랩 돌연변이 (A)와 크레 - 복귀 유전자 트랩 대립 유전자 (B)의 A, B. 다이어그램. C, D. GFP (C)의 공동 발현과 NSF tpl6 유전자의 신경 시스템의 RFP (D) 트랩 라인. E, NSF tpl6 배아에 ​​크레 RNA의 F. 주입 GFP (E)의 손실 및 RFP (F) 표현으로 이어집니다. 예상대로 렌즈에서 GFP 발현의 어떠한 감소는 없다는 것을주의한다. 그림 3. GBT-B1 (pDB783) 유전자 트랩 주입 배아. . 배아의 임의의 그룹 (B) 및 양육 선택 하이 익스 프레 : A. 태아가 pGBT-B1 (pDB783) 신체 B 혼자 디스플레이 작은 GFP의 형광 주사, C. 배아 pGBT-B1과 Tol2 트랜스 포사 mRNA의 주입 (C). <img alt="그림 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4.jpg" /> 그림 4. 인 Gal4 유전자 트랩 라인 설립을위한 실험 개요. 혼자 녹색 유전자 트랩이나 증강 트랩 이벤트에 대한 모자이 시즘을 나타내는 반면 부분적으로 중복되는 그린 / 레드 구조, GFP 및 RFP의 공동 발현을 나타냅니다.

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Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

이 프로토콜은 제브라 피쉬의 차 기자로 기본 기자와 GFP / RFP로 인 Gal4-VP16을 사용하여 유전자 트랩 insertional 돌연변이 유발의 방법을 설명합니다. 약 한 고 표현 F0 물고기 수익률 유전자 트랩 자손을 GFP 및 RFP를 공동으로 표현하는 10 명 중. 심사 절차는 쉽게 insertional 돌연변이 화면을 수행하는 실험실의 크기에 적응하기 위해 확장 할 수 있습니다.

제브라 피쉬의 인 Gal4을 사용하여 유전자 트래핑

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Research

JoVE Journal

Biology

18.1K 조회수.  Temple University.  이 프로토콜은 제브라 피쉬의 차 기자로 기본 기자와 GFP / RFP로 인 Gal4-VP16을 사용하여 유전자 트랩 insertional 돌연변이 유발의 방법을 설명합니다. 약 한 고 표현 F0 물고기 수익률 유전자 트랩 자손을 GFP 및 RFP를 공동으로 표현하는 10 명 중. 심사 절차는 쉽게 insertional 돌연변이 화면을 수행하는 실험실의 크기에 적응하기 위해 확장 할 수 있습니다. 

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Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

유전자 기능을 분석 Zebrafish 배아들 중 Microinjection

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

연구

생물학

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Zebrafish Oligonucleotide Microarray의 플랫폼을 사용하여 글로벌 유전자 발현 분석

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

고효율 기본 셀을 Transfect하는 진 Pulser Electroporation MXcell의 시스템을 사용하여

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

유전자 발현 연구를 단순화하는 자동 셀 카운터를 사용하여 : Namalwa 셀에서 IL - 4 종속 유전자 발현의 siRNA의 최저

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

세포 배양의 유도와 Hypoxia의 시험

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

Morpholinos의 생체내의 Electroporation에서 성인 Zebrafish의 망막에

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Ribosome 바운드 초기 Polypeptides의 분리<em&gt; 체외에서</em&gt; mRNA 함께 Translational 일시 중지 사이트를 식별하려면

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Ribosome 바운드 Polypeptides을 파악하는 도구로 SecM 체포 시퀀스를 사용하여

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

성인 Zebrafish의를 Gavaging

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

고해상도 용융 분석과 PCR을 이용하여 신속하고 효율적인 Zebrafish의 유전자형

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...