저자는 탁월한 진행 축산 서비스를 제공하는 Deakin 대학 Zebrafish 시설의 직원을 감사드립니다. YG는 알프레드 Deakin 박사 과정 이수 연구 활동과 Deakin 대학에서 중앙 연구 기금에 의해 지원됩니다. SLM은 NHMRC 경력 개발 친목에 의해 지원됩니다. ACW는 NHMRC 사용 권한 부여에 의해 지원됩니다. 모든 저자는 Deakin 대학에서 분자 및 의학 연구 전략 연구 센터에 의해 지원됩니다.

제 1 부 : Zebrafish 태아의 화학 처리 <ol><li> 기름지게 후 zebrafish 배아를 수집합니다. 28.5에서 길러 ° 100 E3 미디어에서 C × 15mm 배양 접시 참고 :.을위한 현장 하이브리드 또는 오일 - 레드-O 염색의는, 0.2 mm의 최종 농도 1 - 페닐-2-티오 우레아 (PTU)가 추가됩니다 안료 형성, 1 만 해마 분석을위한 필요가 없습니다를 억제. </li><li> . 약리 연구를 들어, 해당 차량 전용 제어 참고로 26 시간 게시물 수정을 (hpf)에서 zebrafish 배아를 개발하는 데 적절한 최종 농도에 필요한 화학 물질을 추가 빛에 민감한 약리 억제제를 들어, 배아는 발전 할 수 할 수 있습니다 분석에 어두운 사전. </li></ol> 2 부 : 해마 XF 24 분석기를 사용하여 라이브 신진 대사 프로필 <ol><li> 각 실행하기 전에 그 해마 XF 24 분석기 카트리지 O 2, H을 보유하고 그 <s까지&gt; + fluorophores은 분석기가 수행하는 자동화 된 프로세스를 통해 교정된다. </li><li> 24 잘 XF 24 작은 섬 판의 작성. 다음 실험 순서는 사용된다 : <ol><li> 산소 소비가 온도 변화에 민감하므로, 네 우물은 판에서 가능한 온도 변동에 대한 제어하는​​ 데 사용됩니다. 이 우물은 배아를 포함하지 않지만, E3 매체 700 μl (그림 2A)로 가득합니다. </li><li> 나머지 20 우물은 (일부 2.2 참조) E3 중간 한 배아 각 (그림 2B) 700 μl로 가득합니다. </li><li> 각 실험, 10 배아는 차량 전용 (제어), 10 화학 억제제 (치료)로 치료로 치료하고 있습니다. 제어 및 처리 배아는 (:; 처리 배아 : 잘 A4 : 제어 배아, 잘 A5 대우 배아 등을 잘 A3 제어 배아 잘 A2를 등)을 가끔합니다. </li><li> 작은 섬 캡처 화면의 상단에 추가됩니다. 표본이 분석에 걸쳐 측정 챔버 (그림 2B)에 남아 있도록 할 각 우물 참고 : 화학적으로 처리 된 배아는 전에 해마 분석기를 실행하는 화학 물질을 씻어 필요로, 전체 과정에 걸쳐 원래 화학 솔루션으로 유지 프로그램. </li><li> 끝나면 접시는 해마 분석기에로드되고 분석이 시작됩니다. </li></ol></li><li> 샘플 분석. 두 개의 서로 다른 assays는 정기적으로 수행됩니다. <ol><li> 기초 호흡 / 최대 호흡 프로그램 (기간 약. 90 분). 최대 호흡은 병리학 및 생리학 모두 국가의 수와 연관이 매개 변수의 총 에너지 생산 용량 및 변경을 측정하는 동안 기저 호흡의 변경은 신진 대사 장애를 버팀목을 대다. 예비 호흡기 용량, 또는 더 ATP 생산을 높일 수있는 시스템의 용량은 또한 계산됩니다최대 호흡에서 기초의 뺄셈으로이 시험에서. 세 각 조합의 반복 (2 분) / 대기 (1 분) / 측정 (2 분)주기는 먼저 기저 호흡을 수립 수행됩니다. 세 번째주기의 끝에서 FCCP 2.5 μM (mitochondrial protonophore / uncoupler)의 최종 농도는 잘 최대 호흡의 측정을 허용 각에 추가됩니다. 측정주기는 다음 5-8 회 (그림 3)을 반복하고 있습니다. </li><li> ATP 회전율 / 나와라 누출 프로그램 (기간 약. 60 분). 양성자 누출, 또는 uncoupled 호흡으로 인해 호흡가 inextricably 기초 호흡과 반응성 산소 종 형성 등의 mitochondrial 기능의 다른 매개 변수와 연결되어있는 동안 ATP 회전율로 인해 호흡은 ATP 생산의 형태로 미토콘드리아의 주요 기능을 나타냅니다. 때문에 ATP의 매출을 호흡은 25 μM의 oligomycin의 추가 (A의 억제에 따라 호흡의 차이로 표현됩니다TP synthase)는 기저 호흡에 비해. Uncoupled 호흡, 또는 양자 누출로 인해 호흡은 25 μM의 rotenone (복잡한 I 억제제)의 추가에 따라 oligomycin로 인한 호흡과 호흡 사이의 차이를 계산하여 결정됩니다. 측정주기는 각 mitochondrial 억제제 추가 한 후에 8 번 반복합니다. </li></ol></li></ol> 실행의 끝에서 10 컨트롤 10 화학적으로 처리 배아의 값을 의미 계산됩니다. 파트 3 : 오일 - 레드-O 염색법 <ol><li> 50 hpf의 태아는 4 ° C.에서 하루 아침에 4퍼센트 PFA에서 고급 집게를 사용하여 dechorionated 및 고정 </li><li> 이전에 (그림 4 참조) 2에 설명 된대로 오일 - 레드-O 염색이 수행됩니다. </li></ol>

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	<li>N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish. , (2002).</li><li>Schlombs, K., Wagner, T., Scheel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-1+protease+is+required+for+cartilage+development+in+zebrafish.">Site-1 protease is required for cartilage development in zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 14024-14029 (2003).</li><li>Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+of+the+zebrafish+for+disease+analysis.">The power of the zebrafish for disease analysis.</a> Hum. Mol. Genet. 18, R107-R112 (2009).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Stackley, K. D., Beeson, C. C., Rahn, J. J., Chan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profiling+of+zebrafish+embryonic+development.">Bioenergetic profiling of zebrafish embryonic development.</a> Plos One. 6, e25652 (2011).</li><li>McGee, S. L., Sadli, N., Morrison, S., Swinton, C., Suphioglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DHA+protects+against+zinc+mediated+alterations+in+neuronal+cellular+bioenergetics.">DHA protects against zinc mediated alterations in neuronal cellular bioenergetics.</a> Cell Physiol. Biochem. 28, 157-162 (2011).</li><li>Sivitz, W. I., Yorek, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+diabetes:+from+molecular+mechanisms+to+functional+significance+and+therapeutic+opportunities.">Mitochondrial dysfunction in diabetes: from molecular mechanisms to functional significance and therapeutic opportunities.</a> Antioxid. Redox Signal. 12, 537-577 (2010).</li><li>Bournat, J. C., Brown, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+obesity.">Mitochondrial dysfunction in obesity.</a> Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17, 446-452 (2010).</li><li>Ghafourifar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+multiple+sclerosis.">Mitochondria in multiple sclerosis.</a> Front Biosci. 13, 3116-3126 (2008).</li><li>Winklhofer, K. F., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease.">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).</li><li>Maruszak, A., Zekanowski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+Alzheimer's+disease.">Mitochondrial dysfunction and Alzheimer's disease.</a> Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 320-330 (2011).</li><li>de Moura, M. B., dos Santos, L. S., S, L., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+neurodegenerative+diseases+and+cancer.">Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and cancer.</a> Environ. Mol. Mutagen. 51, 391-405 (2010).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

zebrafish 배아의 유전자 기능을 쉽게 차단하거나 활성화 할 수 있으며, Zebrafish는 앞으로 (ENU mutagenesis) 및 역방향 (Tilling, 아연 손가락 nuclease 대상 똑 아웃, morpholino의 최저) 유전자 접근 방법 3,4 모두에 잘 알려진 유전 모델입니다 인코딩 된 제품에 대한 특정 선택적 약리 물질을 사용합니다. 외부 개발 및 작은 크기로 인해, zebrafish의 배아는 신진 대사가 분석을 위해 특히 적합합니다. 그러나, 신진 대사 프로필과 zebrafish 배아의 생체 내 mitochondrial 기능의 강력한 측정 한 예비 설명과 함께, 달성 5보고되지 않았습니다. 해마 분석은 원래 셀 기반의 신진 대사 연구에 대한 설계 정확하고 신뢰할 수있는 결과에게 6주고 증명되었습니다. zebrafish 배아에 대한 새로운 방법론의 응용 프로그램은 중요한, 그리고 신진 대사 연구에 대해이 모델의 넓은 사용을 증가 할 가능성이 있습니다. 본 연구에서는, 우리는 기초 호흡, 최대 호흡, 예비 호흡기 용량, ATP의 매출과 양자 누설 등의 해마 분석기를 사용하여 zebrafish 배아에서 호흡 매개 변수의 범위의 측정을 보여줍니다. 우리는 또한 측정이 경우 지질 축적에,이 분석 시스템의 약리 억제제의 사용 등 생리적 매개 변수와 상관 할 수있는 방법의 예를 제공합니다. 유전자 - 변경된 배아의 사용과 함께,이 신진 대사에 영향을 미치는 요인을 이해하기위한 강력한 실험 플랫폼을 제공합니다. mitochondrial 장애 이러한 당뇨병 7, 비만 8, 다발성 경화증 9, 파킨슨 병 10, 알츠하이머 병 11, 암 (12)의 일부 유형으로 많은 인간의 질병에 연루되어있는이 새로운 방법론에 대한 다양한 응용 프로그램이 있습니다. 중요한 것은, O이를 통해 생체 호흡과 신진 대사 프로필의 생리 학적 관련성이 높은 전망을 제공하는 활성 - 이러한 크린 시토 킨, 개발 관련 성장 등과 같은 - UR 작업은 모든 환경 영향은 생체에 수행됩니다. 화학 화면도 정기적으로 야생 유형 및 영향 호흡, 미토콘드리아 기능이나 신진 대사가 쉽게 해마 분석기를 사용하여 식별 할 수있는 돌연변이 배경 zebrafish의 배아 (그림 1), 소설 의약품에서 수행됩니다로서. 해마 분석기를 사용하여 생성 결과는 추가 정보를 제공하기 위해 다른 assays와 함께 사용할 수 있습니다. 여기에는 이러한 cebpα, Pparα 같은 특정 지방 세포 마커에 대한 현장 하이브리드 화에서와 같이 오일 - 레드 얼룩과 같은 생리 분석, 또는 분자 분석, Pparγ, FAS 등을 포함 할 수 있습니다 이 방법에 대한 몇 가지 제한 사항이 남아 있습니다. 우리와 다른 meas에 oligomycin를 이용할 수 있지만젊은 배아 60 hpf oligomycin 치료보다 오래된 배아 5 (그림 3 참조)에 우레 ATP 생산과 프로톤 누수가 비효율적입니다. 우리는 이전 배아에 oligomycin가 쉽게 해석 할 결과를 불가능하게 만들었 젊은 배아에 비해 확산 할 수 있다고 생각합니다. oligomycin 결과가 ATP의 매출과 uncoupled 호흡으로 인해 호흡의 결정에 대한 필수이기 때문에, 우리는 현재 이전 배아의 oligomycin 높은 농도를 조사하고 있습니다. 그러나, antimycin 치료는 기저 호흡, 최대 호흡 및 예비 호흡기 용량, 이전 zebrafish의 배아에서 수행 할 수 있습니다, 최대 68 hpf (미도시)과 같은 다른 측정과 함께 더 효과적 남아 있습니다. 현재 해마 분석기 설정을 사용하는 또 다른 제한들은 zebrafish 배아과 젊은 애벌레 만 적합되도록 잘 각각의 작은 섬 캡처 판에서 물리적 공간입니다. 따라서, metabol를 수행성인 생선의 다이어트 유발 비만에 IC 연구 예를 들어, 아직 기술적으로 적합하지 않을 수 있습니다. 그러나,이 연구는이를 가능한 분석의 범위를 확장, 특히 청소년 또는 성인 생선을 위해 설계 판의 개발을하라는 메시지를 표시 할 수 있습니다.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> XF 24 세포 플럭스 분석기 </td><td> Bioscience 해마 </td><td> 100737-101 </td><td> 24도 형식 </td></tr><tr><td> 작은 섬 캡처 microplate </td><td> Bioscience 해마 </td><td> 101122-100 </td><td> 24도 형식 </td></tr><tr><td> XF Calibrant 솔루션 </td><td> Bioscience 해마 </td><td> 100840-000 </td><td></td></tr><tr><td> XF 분석 매체 </td><td> Bioscience 해마 </td><td> 101022-100 </td><td></td></tr><tr><td> 오일 - 레드-O </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> O0625 </td><td></td></tr><tr><td> 1-페닐-2-티오 우레아 (PTU) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P7629 </td><td>/ zfbook/chapt10.html # wptohtml51 &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html # wptohtml51 </td></tr><tr><td> E3 (배아 매체) </td><td> 자체 제작 </td><td> - </td><td> <a href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16" target="_blank"># wptohtml16을 http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html</a> </td></tr><tr><td> 100X15 mm 배양 접시 </td><td> 매 </td><td> 35-1029 </td><td></td></tr><tr><td> FCCP </td><td> 시그마 </td><td> C2920 </td><td></td></tr><tr><td> Oligomycin </td><td> 시그마 </td><td> 75,351 </td><td></td></tr><tr><td> Antimycin </td><td> 시그마 </td><td> A8674 </td><td></td></tr></tbody></table>

metabolic profile analysis of zebrafish embryos

신진 대사 분야의 성장 목표는 mitochondrial 기능의 다양한 측면에 대한 유전의 영향을 결정하는 것입니다. 이러한 관계를 이해하는 것은 이러한 당뇨병과 비만 등의 mitochondrial 장애와 연결되어 질병의 범위에 대한 기본 병인을 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 장비의 최근 발전은 셀 라인 또는 조직 explants에서 mitochondrial 기능의 고유 한 매개 변수의 모니터링을 사용하고 있습니다. 여기 우리는 해마 bioscience XF 24 세포 플럭스 분석기를 사용하여 zebrafish 배아 발달 동안 생체 내 mitochondrial 기능 매개 변수의 신속하고 민감한 분석 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 작은 섬 캡처가 단일 배아 각 잘에 배치하는 위치를 bioenergetics의 측정을 허용, microplates 등의 활용 : 기초 호흡을은 (i), ATP 회전율로 인해 (II) 기초 mitochondrial 호흡 (III) mitochondrial 호흡을, (IV) mitochondrial uncoupled 호흡 또는 PRoton 누출 그리고 (iv) 최대 호흡. 이 방법 배아 zebrafish의 호흡 매개 변수를 사용하는 야생 유형과 유전자 조작 배아 (돌연변이, 유전자 이상 표현이나 유전자 최저) 또는 pharmacologically 조작 약자 사이에 비교할 수 있습니다. 은이 프로토콜의 보급이 관련 척추 동물 모델의 생체 내 대사 장애의 유전 기초를 분석하는 새로운 도구와 연구자를 제공 할 것입니다 것으로 예상된다.

<html> 우리는 특히 신진 대사, 호흡 속도와 지질 대사에 역할을 특정 유전자를 이해 관심이 있습니다. 따라서, 우리는 이러한 유전자 중 하나에 의해 인코딩 된 효소의 특정 약리 억제제와 26 hpf의부터 야생 형 zebrafish의 배아를 취급. 나머지 절반은 4%에서 수정하는 동안 50 hpf에서, 차량 및 억제제 - 처리 배아의 절반은, mitochondrial 기능에 대한 해마를 사용하여 분석 하였다 PFA 4에 밤새 ° C 및 이후 오일 - 레드-O와 지질 증착에 얼룩 져. 특정 효소 억제제로 치료 특히 telencephalon과 귀의 소포 (그림 4B, C) ​​아래의 지질 증착의 증가와 관련된되었다 기저 호흡에서 ~ 2 배 증가 (그림 4A)를 이끌었습니다. pload/4300/4300fig1highres.jpg &quot;/&gt; 1 그림. zebrafish 배아의 화학 치료의 개략도. Wildtype, 유전자 - 조작, 또는 pharmacologically 처리 zebrafish 배아 배경입니다. <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig2.jpg" alt="그림 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4300/4300fig2highres.jpg"/> 그림 2. XF24 작은 섬 판은 설정합니다. (A) 4 우물은 온도 제어로 배아 매체를 포함 (X로 표시)와 다른 사람들이 /들이 한 배아가 포함되어 있습니다. (B) 클로즈업 작은 섬 캡처 화면 (화살촉)이 적용 차량 (DMSO)로 치료 50 hpf 야생 유형의 배아를 보여주는 잘 하나 (C6)의. <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig3.jpg" alt="그림 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4300/4300fig3highres.jpg"/> 그림 3. Respirat야생 유형 50 hpf의 zebrafish의 배아의 이온 매개 변수. (A) 각 측정을 위해, 20 개인 배아의 평균이 제공됩니다. 기초 호흡 (평균 : 299.7, SD : 75.7, SEM : 16.9), 최대 호흡 (평균 : 387.4, SD : 93.3, SEM : 20.9), 예비 호흡기 용량 (평균 : 87.7, SD : 72.0, SEM : 16.1). (B) 각 측정을 위해, 20 개인 결과의 평균이 제공됩니다. 기초 mitochondrial 호흡, mitochondrial uncoupled 호흡과 비 mitochondrial 호흡, ATP 회전율로 인해 mitochondrial 호흡. 산 : mitochondrial, SRC : 예비 호흡기 용량, SD : 표준 편차, SEM : 평균의 표준 오류가 발생했습니다. 결과는 O 2 pmol에 표시됩니다 소비 / 분 / 배아. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4300/4300fig3large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig4.jpg" alt="그림 4" /> 4 그림. Repre기초 호흡과 지질 증착의 화학 노출 sentative 결과입니다. 측면보기에 오일 - 레드 O 물들 (A, B) 50 hpf의 배아. 선택적 억제제 (B)와 incubated 난자는 차량 처리 제어 배아에 비해 telencephalon (화살촉)와 귀의 소포 (화살표) 아래에 더 많은 오일 - 레드-O 염색을 표시합니다. (C) 자연적으로 흐르는 것과 호흡이 화학적으로 처리 배아 (그룹 당 n은 = 10 배아)의 ~ 2 배 증가를 보여줍니다. 결과는 O 2 / 분 / 배의 pmol에 표시됩니다.

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Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

신진 대사 연구 용 활용을 받아왔다 강력한 척추 모델을 대표 Zebrafish. 여기를 측정 할 수있는 빠른 방법을 설명<em&gt; 생체 내</em따라서이 유기체의 적용을 증가 유전자 또는 pharmacologically 조작 배아의 차이 mitochondrial 기능 매개 변수의 비교를 허용 개발 zebrafish의&gt; 대사 프로파일.

Zebrafish 태아의 대사 프로필 분석

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

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Research

JoVE Journal

Biology

19.8K 조회수.  School of Medicine, Deakin University. 신진 대사 연구 용 활용을 받아왔다 강력한 척추 모델을 대표 Zebrafish. 여기를 측정 할 수있는 빠른 방법을 설명 생체 내 대사 프로파일.

비디오: Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Zebrafish 태아의 mRNA와 Morpholino의 안티 센스 Oligonucleotides의 Microinjection.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

연구

생물학

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

유전자 기능을 분석 Zebrafish 배아들 중 Microinjection

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

이식에 의해 키메라 Zebrafish의 배아를 생성

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

라이브 Zebrafish 태아에서 두 광자 기반 Photoactivati​​on

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

진핵세포 Polyribosome 프로필 분석

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

신진 대사 라벨링 및 Bioorthogonal 클릭 화학에 의해 Zebrafish 태아의 영상 Glycans

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

제브라 피쉬 배아에서 산화 스트레스의 분석

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Zebrafish의 태아의 조직 특이 형광의 반 자동화 이미징

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

반수체 제브라 피쉬 배아의 생산에 의해<em&gt; 체외</em&gt; 시비

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...