우리는 교수 유디트 아미티지 (옥스포드 대학, 영국)와 교수 콘라드 뮬리노 (런던 퀸 메리 대학, 영국)의 그룹에서 세균성 긴장의 종류의 기부금을 인정합니다. IMD는 공동 생화학 뎁트 오브 (옥스포드 대학)과 OCISB에 의해 후원되며 AR는 공학 및 물리 과학 연구위원회 (EPSRC) DTC의 학생이기 의해 후원되며 ND는 생물 공학 및 생물 과학 연구 협의회 (BBSRC)에서 재정 지원되며 MCL입니다 로열 사회 대학의 연구 활동에 의해 자금.

<ol><li> 이 절차를 시작하려면, 대장균에게 박테리아 세포를 표현 형광 단백질의 냉동 주식의 50 μl가 처음 사인을 알아낼 수 없을 아침에 C. 37도에서 하룻밤 다섯 ML의 LB 성장 매체 잡고 aerobically 재배,이 포화 문화의 50 μl가 추출됩니다 , 4 일에서 6 시간 동안 30도 각도의 C에서 최소 잠복기 M63 포도당 문화 미디어로 하위 교양. 여기서 우리는 전자 - 수송을 표현 한 중 서로 다른 두 가지 세포 변종을 사용하여 보여주 GFP, GFP에 융합 박테리아 flagellar 모터에 관련된 단백질을 표현하는 다른 융합 시토크롬. </li><li> 세포 고정화 샘플로를 보는 경우도 증가하고 하위 문화에서 직접 수확하거나 그들이 &quot;곁에&quot;조건 하에서 볼 경우 박테리아 flagella을 잘라야 빠졌어 수 있습니다. </li><li> 전단은 멸균 배관으로 가입이 무균 주사기로 구성된 장치로 하위 문화의 일반적으로 1 - 5ml 배치 포함됩니다. 전단은 좁은 튜브를 통해 문화를 밀어 각 주사기 펌프에서 추진하고 교류에 의해 이루어집니다. 이것은 필요한 전단의 범위에 따라 50 ~ 100 배 한 것입니다. 문화 다음 flagella 조각을 제거하는 최소한의 미디어 resuspended입니다 펠릿 세포에 centrifuged 있습니다. </li><li> 우리는 그때 그때 드 이온화 물과 에탄올에 철저 rinsing하고 최소한 1 H. 위해 공중에 건조하기 위해 떠나는 20 분 에탄올에 코의 포화 용액에 immersing로 BK7 유리 coverslips 청소 준비 </li><li> 우리는 현미경으로 세포를 집에 간단한 흐름 셀을 구축. 이것은 BK7 유리 현미경 슬라이드에 파라핀 그리스의 라인을 그리기 다음 터널 - 샌드위치를​​ 만들어 상단에있는 청소 coverlips 중 하나를 배치하고, 포셉 한 쌍의로 부드럽게 아래로 눌러, 5-10 μl의 흐름 세포 볼륨을주는 관련 . </li><li> 고정화 세포를 관찰하는 우리는 폴리 - L - 라이신의 0.1 % W / V 솔루션으로 주입하여 흐름 세포를 기입하고, 그것이 최소한 1 분 상온에서 품어 수 있습니다. 우리는 다음의 흐름 세포의 한쪽 끝을에서 미디어를 주입하고 다른 조직에서 종이로 위킹 100 μl 최소한의 미디어를 사용하여 밖으로 몰아내. </li><li> 우리는 다음 coverslip 표면을 표시하는 최소한의 미디어에 200 nm의 직경 라텍스 microspheres (Polysciences)의 1:500 희석 20 μl를 통해 심지. 흐름 세포는 coverslip은 간단한 습도 챔버의 표면의 맑은 플랫폼에 배치 아래쪽에 직면해있다 이러한 거꾸로, 5 분 실온에서 incubated입니다. 언바운드 비즈 그런 다음 100 μl 최소한의 매체를 통해서도 위킹 씻겨 있습니다. </li><li> 우리가 곁에 세포를 관찰하고자하는 경우에는 우리는 폴리 - L - 라이신 단계를 생략하고 대신 5 MG / ML 방지 flagellin 항체와 흐름 - 세포를 작성하십시오. 흐름 세포는 10 분 습도 챔버에서 개최하고 다음 위킹로를 통해 플러시됩니다. </li><li> 세포 배양의 20 μl가 고정화 세포를 보는에 닿는 세포 또는 unsheared 샘플을 관찰하는 경우도 가지각색 샘플을 사용하여 흐름 세포를 통해 다음 사악한입니다. </li><li> 흐름 셀은 뒤집혀 20 분 습도 챔버에 배치됩니다. 언바운드 세포 그런 다음 100 μl 최소 매체를 통해서도 위킹에 의해 씻겨 있습니다. </li><li> 침지 기름 방울이 coverslip의 상단 표면의 중앙에 위치하며 흐름 세포 그 다음 높은 숫자 조리개 목적 렌즈와 광학 접촉을 만드는 사용자 정의 지어진 형광 현미경의 샘플 홀더에 가볍게 배치됩니다. </li><li> 현미경 전자 - 곱한 카메라가 켜져 있고 카메라가 -70도 C로 냉각되도록 설정이며, 소프트웨어는 처음에 게인 컨트롤을 disenabling, 프레임 전송 모드에서 25 Hz의 전형적인 프레임 속도로 이미지를 얻기위한 설정 카메라. </li><li> 브라이트 조명이 켜져 있으며, 이미지가 자신이 coverslip 표면 자신의 긴 축 병렬로 붙어되는 바탕으로 몇 군데로 세포의 적절한 셀 또는 그룹을 선택 초점으로 가지고있다. 초점은 잘게 coverslip 표면에 붙어있는 200 나노미터 라텍스 비즈 그냥 초점되는 것을 보장하기 위해 조정됩니다. </li><li> 이미지 시퀀스는 셀 본문의 개요를 기록 브라이트 인수입니다. 브라이트 조명이 꺼져되고 카메라 게인을 최대로 사용할 수 있습니다. </li><li> 총 내부 반사 형광 (또는 TIRF) 적절한 파장을 통해 레이저 광선을 (여기서, 녹색 형광 단백질 여기에 대해, 우리는 473 nm의 레이저를 사용)를 사용하여 표준 취득의 뒤쪽 초점 평면에 집중되는만큼 사전 설정 목적 렌즈지만 세포 샘플에 형광 여기에 대한 지극히 미미한 필드를 생성하는 광학 축에서 옆으로 있질. </li><li> 카메라 인수는 시작 레이저 셔터가 세균 내에 형광 단백질들을 흥분시키기 위해 열립니다. 인수의 레이저 강도와 속도에 대한 매개 변수는 다른 값으로 실험에 의해 조사를 받고 특정 생물 학적 시스템을 최적화할 필요가 있지만, 일반적인 범위 R세포막의 모바일 단백질 단지를 공부하는 elevant는 50-40 MS의 프레임 당 노출 시간, 직경 ~ 30 μm의의 원형 여기 영역 1-10 MW 레이저 파워입니다. 샘플은 photobleached, 일반적으로에 대한 ~ 10 S.까지 조명 아르 </li><li> 이 프로토콜은 두 세포의 시체가 coverslip과 flagellar 스텁 사이의 첨부 파일의 지점에 대한 회전되는 닿는 세포, 그리고 rigidly coverslip 표면에 고정되어 있습니다 고정화 세포를 사용할 수 있습니다. </li><li> 단지 높은 사본 번호가 일부 세포 변종 이전 TIRF 영상에 셀 중 하나를 장대에 초기 회절 - 제한된 초점을 맞춘 레이저 표백제의 혜택을 누릴 수 있습니다. 이 표백제 (또는 FRAP) photobleaching 후 형광 복구에 사용하는 것과 동일합니다. 우리의 사용자 정의 현미경 사용 여기 레이저 광 중 일부는 FRAP 타입 표백에 사용되는 두 번째 독립적인 경로로 내려 먹이 수 있습니다. 일반적으로 1 - 10mW 레이저 전원 범위 10-300 MS의 전형적인 표백 시간과 함께 사용됩니다. 이후보다 쉽게​​ 시각으로 그 지역에 확산 개별 단지를 허용 세포의 표백 영역에서보다 높은 영상 반면이 발생합니다. </li><li> &quot;slimfield&quot;라는 다른 조명 모드를 고용하는 세포막에서보다 훨씬 빠른 확산 세포 세포질에서 단지를 시각화하십시오. 여기 초점 레이저가 옆으로 단지 하나의 세포를 포괄하기 위해 확장됩니다. 이것은 일반적으로 밀리초의 속도가 훨씬 빠르고 노출을 취할 수있게 아주 강렬한 필드를 생성합니다. </li><li> 데이터 수집 후, 이미지가 사용자 정의 작성된 소프트웨어 (LabVIEW 8.5에서 코드)로 공급하고 있습니다. 이것은 자동으로 일반적으로 몇 나노미터의 정밀도로 세포에 형광 명소의 위치를​​ 감지하고 그들의 크기와 밝기를 추출합니다. 추적 분자 복잡한 시간과 관련하여 photobleaching 추적은 다음 stoichiometry을 추정하는 데 사용되는 brightnessof은 단일 분자 복잡한을 만들어 많은 개인 형광 단백질 즉. </li></ol> 대표 결과 : 프로토콜이 완료되면 브라이트에서 볼 세포의 정확하게 이미지는 흰색 / 회색 세포 기관 (그림 1A)에 대한 어두운 세포 기관의 경계와 함께 매우 독특한 것입니다. 형광 사용하여 고정화 세포에서, 우리는 폭 일반적으로 250-300 nm의 (그림 1B)의 독특한 명소 강도를 볼 수 있습니다. 건강 닿는 곳에 전지 브라이트 이미지의 테더 부착 지점 주위에 회전 볼 수 있습니다. 형광 여기에서 우리 사건의 일부 분자 단지도 flagellar 모터와 태그 단백질의 지방화를 나타내는, 첨부 파일의 시점에서 볼 수 있습니다. 이 반점은 개별 분자 단지이며, 본 그들의 숫자는 조명 사용 모드와 방법에 단지 많은 실제로 한 번에 세포에 존재에 따라 달라집니다. 반점의 이동성 연구에서 특정 생물 학적 시스템에 따라 다릅니다. 관광 명​​소의 밀도가 처음 매우 높다면, 그 다음 초기 FRAP의 표백제가 이미징 명암을 향상시킬 수 수행, 여기를 사용한 표시된 cytochromes 경우가 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1508/1508Figure1tmb.jpg" border="0" alt="그림 1" /> 그림 1. (A) 브라이트와 고정화 대장균 세포에 대한 (B) TIRF 이미지 (거짓 색상)은 박테리아의 flagellar 모터에 관련된 것으로 알려진 녹색 형광 단백질 (GFP)을 융합 단백질을 표현. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1508/1508Figure1.jpg">여기를 클릭</a> 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

<ol>
	<li>Leake, M. C., Chandler, J. H., Wadhams, G. H., Bai, F., Berry, R. M., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+and+turnover+in+single,+functioning+membrane+protein+complexes.">Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes.</a> Nature. 443, 355-358 (2006).</li><li>Leake, M. C., Greene, N. P., Godun, R. M., Granjon, T., Buchanan, G., Chen, S., Berry, R. M., Palmer, T., Berks, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+stoichiometry+of+the+TatA+component+of+the+twin-arginine+protein+transport+system+observed+by+in+vivo+single-molecule+imaging.">Variable stoichiometry of the TatA component of the twin-arginine protein transport system observed by in vivo single-molecule imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15376-15381 (2008).</li><li>Leake, M. C., Wilson, D., Gautel, M., Simmons, R. M., M, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elasticity+of+single+titin+molecules+using+a+two-bead+optical+tweezers+assay.">The elasticity of single titin molecules using a two-bead optical tweezers assay.</a> Biophys. J. 87, 1112-1135 (2004).</li><li>Leake, M. C., Wilson, D., Bullard, B., Simmons, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elasticity+of+single+kettin+molecules+using+a+two-bead+laser-tweezers+assay.">The elasticity of single kettin molecules using a two-bead laser-tweezers assay.</a> FEBS Lett. , 535-555 (2003).</li><li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+clustering+and+dynamics+of+cytochrome+bd+complexes+in+the+Escherichia+coli+plasma+membrane.">In vivo clustering and dynamics of cytochrome bd complexes in the Escherichia coli plasma membrane.</a> Mol. Microbiol. 70, 1397-1407 (2008).</li><li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+Escherichia+coli+OXPHOS+complexes+concentrated+in+specialised+zones+within+the+plasma+membrane.">Are Escherichia coli OXPHOS complexes concentrated in specialised zones within the plasma membrane.</a> Biochem. Soc. Trans. 36, 1032-1036 (2008).</li><li>Lo, C. J., Leake, M. C., Pilizota, T., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+measurements+of+Membrane+Potential,+Sodium-Motive+Force+and+Flagellar+Motor+Speed+in+Escherichia+coli.">Single-cell measurements of Membrane Potential, Sodium-Motive Force and Flagellar Motor Speed in Escherichia coli.</a> Biophys. 93, 294-302 (2007).</li><li>Lo, C. J., Leake, M. C., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+measurement+of+intracellular+sodium+concentration+in+single+Escherichia+coli+cells.">Fluorescence measurement of intracellular sodium concentration in single Escherichia coli cells.</a> Biophys. J. 90, 357-3565 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

케어는이 이후 닿는 박테리아보고에 대해 &quot;이상의 전단&quot;세포가 flagellar 모터의 기능을 손상 수하지 않도록해야합니다. 그들은 산소가 고갈 될 수 있으므로 현미경 슬라이드에 한 시간보다 훨씬 오래 세포를 사용하는 것이 중요합니다. 상당한 최적화가 가장 현미경 이미징 조건 조사중인 특정 생물 학적 시스템에 음식을 제공 했었죠 찾을 수 필요할 수 있습니다. 그것은 특정 현미경 시스템...

visualizing single molecular complexes in vivo using advanced fluorescence microscopy

살아있는 세포의 메커니즘에 전체 통찰력은 세포 수준에서 사건을 이끌어하고 직접 핵심 프로세스를 조사하여 얻을 수 있습니다. 생물 학적 시스템의 전단 복잡 날짜하려면 대신 상대적으로 원유 대량 앙상블 평균 측정을 사용하여 단일 시스템 연구에 초점을 맞추고, 너무 요구하는 정확한 단일 분자 실험가 발생했습니다. 그러나 많은 중요한 과정은 단지 하나의 수준에서 살아있는 세포 또는 몇 분자에서 발생, 앙상블 측정은 일반적으로이 사건의 확률과 이기종 자연을 마스크. 여기, 고급 광학 현미경 및 분석 영상 분석 도구를 사용하여 우리는 하나의 살아있는 세균 단일 분자의 정밀도로 휴대 방법과 우리가 생물 학적 기계 작동에 분자 단지 내의 역학 관계를 볼 수 있습니다 내에서 단백질을 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 기술은 생리학 직접 관련이있다. 그들은 최소한 - 섭동의 공부에서 생물 학적 샘플을 비침습이며, 완전히 살아있는 재료에 수사 숙련 있으​​며, 생물 물리학의 다른 단일 분자 접근법에 즉시 사용할 수 없습니다 있습니다. 또한, 생물 학적 표본은 모든으로 자연스럽게 발생하는 것보다 훨씬 더 많은 단백질을 생성하기위한보다 일반적인지만 그다지 좋지 접근 방식에 반대하는 수정되지 않은 세포 변종 ( &quot;게놈 인코딩&quot;) 거의 동일 수준의 찬란 - 태그 단백질 생산을 공부 ( &#39;플라스미드 표현&#39;). 따라서, 조사하게 될 실제 생물 학적 샘플이 자연의 생물에 매우 가까이 있으며, 실제 생리 프로세스에 따라서 관측 관련성이.

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Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

여기 기능성 분자 단지가 추적 및 계량, 감지 있도록 박테리아 세포를 생활에 단일 분자 형광 현미경을 수행하는 프로토콜을 보여줍니다.

단일 분자 단지를 떠올리 VIVO에서 고급 형광 현미경을 사용하여

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

visualizing-single-molecular-complexes-vivo-using-advanced

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

9.2K 조회수.  University of Oxford. 여기 기능성 분자 단지가 추적 및 계량, 감지 있도록 박테리아 세포를 생활에 단일 분자 형광 현미경을 수행하는 프로토콜을 보여줍니다.

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Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

형광 현미경과 함께 머릿속으로 단일 분자의 DNA 복제

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

연구

생물학

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

형광 현미경을 사용하여 Nematodes에 박테리아를 머릿속으로

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

고급 3D 형광 현미경을 사용하여 자식 작용의 정량 분석

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, repairing broken cell membrane before the cellular contents leak out. The giant unicellular organism Stentor coeruleus, in which cells can be more than one millimeter in size, have been a classical model organism for studying wound healing in single cells. Stentor cells can be cut in half without loss of viability, and can even be cut and grafted together. But this high tolerance to cutting raises the question of why the cytoplasm does not simply flow out from the size of the cut. Here we present a method for cutting Stentor cells while simultaneously imaging the movement of cytoplasm in the vicinity of the cut at high spatial and temporal resolution. The key to our method is to use a &#34;double decker&#34; microscope configuration in which the surgery is performed under a dissecting microscope focused on a chamber that is simultaneously viewed from below at high resolution using an inverted microscope with a high NA lens. This setup allows a high level of control over the surgical procedure while still permitting high resolution tracking of cytoplasm.

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

The giant ciliate Stentor coeruleus is a classical system for studying regeneration and wound healing in single cells.&#160;By imaging Stentor cells simultaneously at low and high magnification it is possible to measure cytoplasmic flows before, during, and after wounding.

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

신속한 분석 및 형광 현미경 이미지의 탐사

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

형광 현미경으로 Stromule 주파수를 시각화

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to understand where and when transcription is taking place within nuclear space and to visualize the relationship between episomes infected within the same cell's nucleus. Here, both immunofluorescence (IFA) and RNA-FISH have been combinedto identify actively transcribing Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) episomes. By staining KSHV latency-associated nuclear antigen (LANA), it is possible to locate where viral episomes exist within the nucleus. In addition, by designing RNA-FISH probes to target the intron region of a viral gene, which is expressed only during productive infection, nascent RNA transcripts can be located. Using this combination of molecular probes, it is possible to visualize the assembly of large viral transcription factories and analyze the spatial regulation of viral gene expression during KSHV reactivation. By including anti-RNA polymerase II antibody staining, one can also visualize the association between RNA polymerase II (RNAPII) aggregation and KSHV transcription during reactivation.

Viral transcriptional factories are discrete structures that are enriched with cellular RNA polymerase II to increase viral gene transcription during reactivation. Here, a method to locate sites of actively transcribing viral chromatin in 3D nuclear space by a combination of immunofluorescence staining and in situ RNA hybridization is described.

기능 이미징 3D 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 바이러스 성 녹음 방송 공장

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are strategically interposed in the path of the lymphatic vessels, allowing intimate contact of tissue antigens with all resident immune cells in the LN. Thus, understanding the cellular composition, distribution, location and interaction using ex vivo whole LN imaging will add to the knowledge on how the body coordinates local and systemic immune responses. This protocol shows an ex vivo imaging strategy following an in vivo administration of fluorescent-labeled antibodies that allows a very reproducible and easy-to-perform methodology by using conventional confocal microscopes and stock reagents. Through subcutaneous injection of antibodies, it is possible to label different cell populations in draining LNs without affecting tissue structures that can be potentially damaged by a conventional immunofluorescence microscopy technique.

This protocol describes a technique to image different cell populations in draining lymph nodes without alterations in the organ structure.

전 생체 내 공초점 현미경을 사용하여 림프절 구조 및 세포 국소화 시각화

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

형광 라이브 세포 현미경 검사법에 의한 미토틱 및 Meiotic 핵분열 효모 핵 역학의 검사

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...