이 방법은 동일한 현미경을 사용하여 초해상도 이미지를 취하는 방법과 같은 광학 현미경 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 3개의 서로 다른 이미징 모듈을 하나의 현미경으로 결합하여 전체 비용을 크게 절감할 수 있다는 것입니다. 이 방법의 시각적 데모는 여기 경로의 어셈블리를 배우기 어렵기 때문에 중요합니다.
적절한 부품 선택과 민감한 광학 정렬이 필요합니다. 시작하려면 PCI 인터페이스를 통해 데이터 수집 카드를 설치하고 레이저를 컴퓨터에 연결하는 데 사용합니다. 트랜지스터 트랜지스터 로직 출력및 이 카드의 아날로그 출력에 의한 전력 조정에 의해 레이저의 온 및 오프 동작을 제어합니다.
다음으로, 여기에 표시된 대로 거울과 빔 스플리터가 있는 진동 격리 광학 테이블을 준비하고 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명합니다. 레이저 빔을 단일 모드 광섬유에 결합하여 먼저 z축 변환 마운트에 섬유 어댑터 플레이트를 장착합니다. 다음으로, 케이지 플레이트에 achromatic 더블 렌즈를 장착합니다.
확장 막대를 사용하여 어댑터와 렌즈를 연결하여 케이지를 형성합니다. 그런 다음 1인치 두께의 광학 포스트를 사용하여 광학 테이블에 케이지를 장착합니다. 부품을 조정하여 647나노미터 레이저를 정렬하여 섬유를 통해 최대 레이저 출력을 얻습니다.
첫 번째 레이저의 정렬이 완료되면 일시적으로 한 쌍의 붓꽃을 설치하고 나머지 레이저를 하나씩 정렬합니다. 파워 미터를 통해 각 레이저의 정렬 효율을 확인합니다. 레이저의 반사를 줄이기 위해 어댑터 플레이트 앞에 하나의 홍채를 두십시오.
다음으로, 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 배율 렌즈를 설계하고 설치합니다. 모든 단일 분자의 z 좌표를 추출하는 데 필요한 난시 효과를 만들기 위해 카세트에 10미터 초점 길이의 3D 렌즈를 배치하고 배출 빔 경로에 삽입합니다. 순차적인 다색 에피플루오네이션 이미징 동안 진동을 최소화하려면 현미경 옆에 연결된 배리어 필터 휠에 배치된 방출 필터를 사용합니다.
단일 분자 FRET 실험 중에 동시에 다색 검출을 위해 배출 스플리터에 다른 필터 세트를 배치합니다. 에피-흥분을 사용하여 회절 제한 이미징을 설정하려면 먼저 발루암의 에피 모드로 여기 레이저의 부수적 각도를 조정합니다. 다음으로 3D 렌즈를 분리하고 바이패스 큐브를 배출 스플리터에 삽입합니다.
그런 다음 확대 된 조명을 위해 매그 렌즈를 삽입합니다. 설정되면 원하는 결과를 기반으로 샘플의 멀티 채널, z 스택 및/또는 시간이 경과된 이미지를 가져 가십시오. 표면 고정 분자의 다색 단일 분자 검출을 설정하려면 먼저 필터 휠을 빈 위치로 이동합니다.
이것은 레이저가 통과 할 수 있습니다. 그런 다음, 잔디 각도에 흥분 레이저의 부수적 인 각도를 조정하고, 매그와 3D 렌즈를 모두 분리. 다음으로 바이패스 큐브를 모든 라이트가 모든 채널을 통과할 수 있는 교정 큐브로 대체하여 배출 스플리터에서 3채널 모드를 참여시다.
그런 다음 DIC 에서 카메라를 켜고 완전히 분리된 채널이 화면에 나타날 때까지 배출 스플리터의 조리개를 조정합니다. 배출 스플리터에서 수직 수평 조정 제어 노브를 켜고 세 개의 채널을 대략 정렬합니다. 다음으로 카메라를 끄고 교정 큐브를 트리플 큐브로 바꿉니다.
100나노미터 멀티 채널 구슬 샘플을 배치합니다. 488 나노미터의 원내수를 통해 100나노미터 멀티 채널 구슬은 서로 다른 파장을 방출하여 3채널 정렬을 가능하게 합니다. 그런 다음 카메라와 488 나노미터 레이저를 켜고 밝은 구슬 중 하나를 확대한 다음 조정 제어 노브를 다시 돌려 세 개의 채널을 정렬합니다.
샘플이 현재 제자리에 있는 경우 약한 레이저를 사용하여 합리적인 스팟 밀도가 있는 영역으로 이동하여 레이저 전력 및 노출 시간을 조정하여 허용되는 신호 대 노이즈 및 광표백 수준을 달성합니다. 그런 다음 이미징 소프트웨어를 사용하여 시간 경과 이미지를 촬영합니다. 초해상도 이미징의 경우 3D 렌즈를 삽입하고 매그 렌즈를 제거합니다.
그런 다음 최적의 흥분 레이저의 부수적 각도를 결정하여 잔디 각도가 됩니다. SR 이미징에 대한 적절한 객관적인 높이를 찾으려면 DIC 이미징을 사용하여 세포의 중간 평면을 찾습니다. 셀이 투명해지는 높이로 평면을 식별합니다.
원하는 초점 평면이 결정되면 초해상도 이미징을 시작합니다. 이미징 하는 동안, 405 나노 미터 레이저의 힘을 변경 하려면 깜박임-에 반점의 합리적인 밀도 유지. 보라색 레이저 힘없이 이미징을 시작합니다.
특정 기간에 깜박이는 반점 수를 계산하고 깜박이는 점반의 수가 시야에서 사용자 정의 계산 임계값 이상으로 유지되도록 보라색 레이저 전력을 증가시다. 이미징 프레임의 각 스팟의 중심을 감지하여 데이터를 분석하고 X 및 Y 너비에서 각 스팟에 대한 z 값을 추출합니다. 재구성된 이미지를 빌드하고 개체를 3D로 시각화합니다.
이 현미경 설정은 기존의 과광 화상 진찰, 단하나 분자 검출 기지를 둔 초해상도 화상 진찰 및 다중 색 단하나 분자 검출을 포함하여 다른 화상 진찰 방법 사이 유연하고 재현가능한 전환을 허용합니다. 분자 어셈블리에서 더 미세한 세부 사항을 밝히기 위해 초해상도 현미경 검사는 이 것과 같은 수천 개의 이미지를 결합합니다. 그런 다음 이러한 이미지를 재구성하여 최종 초해상도 이미지를 생성합니다.
초해상도 기술을 사용하면 높은 공간 해상도를 허용하여 다른 기술로는 볼 수 없는 세부 정보를 제공합니다. 여기에 표시된 두 이미지에서 강조 표시됩니다. 초분해성 이미지는 상피 형광 이미지와 동일한 세균 조절 RNase를 보여주지만 단일 분자 검출을 허용합니다.
SmFRET는 나노미터 해상도에 대한 협심을 발휘할 수 있는 또 다른 방법입니다. 여기서, 접힌 RNA 분자는 녹색 기증자 염료및 빨간 수용자 염료로 표지되었다. 형광 강도 궤적을 개별 단일 분자에서 추출하여 시간의 함수로서 FRET 효율을 생성할 수 있습니다.
레이저로 작업하는 것은 위험할 수 있으며, 눈 보호 를 착용하거나 레이저 능력을 낮추는 것과 같은 예방 조치는 항상이 절차를 수행하는 곳에서 취해야합니다.
