우리는 최고의 기술 서비스와 존 랄프 귀중한 조언, 토론 및 포플러 나무 샘플에 대해 위스콘신 대학의 매튜 로버트 웨더에게 감사하고 있습니다. 이 작품은 화학 과학, Geosciences 및 Biosciences 부문, 기초 에너지 과학, 과학의 사무실 미국 에너지학과 (수상 안돼. DE - FG02 - 91ER20021)과 에너지의 미 교육부 (DOE)에서 오대호의 사무실에 의해 투자되었다 Bioenergy 연구 센터 (과학 DOE BER 사무소 DE - FC02 - 07ER64494).

1. 세포 벽 절연 <ol><li> 갈기 대략 60 - 70mg의 공기 또는 retschmill (1 분, 25 Hz에서)를 사용하여 2ml sarstedt 스크류 캡 튜브에 5.5 mm 스테인레스 스틸 공 건조 식물 자료를 동결. 대안은 높은 처리량 연삭 및 로봇 칭했다 iWall을 분배의 사용은 부 3에 설명되어 있습니다. </li><li> 세포 벽 절연 절차를 계속하기 전에 강철 공을 제거 세포 벽 재료의 준비의 상세한 프로토콜은 부 3 표시됩니다. 여기에 완성도 프로토콜의 서면 단계를하십시오. </li><li> 1.5 70% 수성 에탄올의 ML, 그리고 철저하게 소용돌이를 추가 </li><li> 펠렛 10 분 알코올 불용성 잔류물을 위해 10,000 RPM에서 원심 분리기 </li><li> 뜨는을 대기음 또는 가만히 따르다 </li><li> 잔류물에 클로로포름 / 메탄올 (1:1 V / V) 솔루션의 1.5 ML를 추가하고 펠렛을 resuspend하기 위해 철저하게 튜브를 흔들 </li><li> 10 분 10,000 rpm으로 원심 분리기 및 뜨는을 대기음 또는 가만히 따르다 </li><li> 아세톤 500 UL에 resuspend 펠릿 </li><li> 35 공기의 흐름과 용매를 증발 ° C를 건조까지 필요한 건조 표본은 추가 처리까지 방 온도에서 저장될 수있다면. </li><li> 예제 0.1 M sodiumacetate 버퍼 산도 5.0 1.5 ML에 다시 중지 펠렛에서 전분의 제거를 시작합니다. </li><li> 20 분 대한 sarstedt 튜브와 열을 모자. 80 ° C 가열 블록에. </li><li> 얼음 정지 냉각 </li><li> 펠렛 다음 에이전트를 추가합니다 : 35 0.01 % Sodiumazide의 μl (난 3), 35 μl 아밀라아제 (50 μg/1mL H 2 O, 바실러스 종, 시그마), 17 μl Pullulanase (바실러스 acidopullulyticus에서 18.7 단위, 시그마) . 튜브와 철저하게 소용돌이를 캡. </li><li> 정지 37 박 이상 incubated입니다 ° 통에 C. 튜브를 Orienting 수평 보좌관은 혼합 향상. </li><li> 100 열 정지 ° C 소화를 종료하기 위해 가열 블록에서 10 분. </li><li> 원심 분리기 (10,000 RPM, 10 분) 및 폐기 뜨는 포함 solubilized 전분 </li><li> , 1.5 ML 물을 추가 vortexing, centriguation 및 세척 물을 decanting하여 나머지 펠렛을 세 번 씻으십시오. </li><li> 아세톤 500 UL에 resuspend 펠릿 </li><li> 건조까지 35 공기의 흐름 ° C로 용매를 증발. 그것은 더 건조 주걱으로 튜브에 재료를 헤어지게하는 것도 필요할 수 있습니다. 마른 재료는 절연 세포 벽 (lignocellulosics)를 제공합니다. 필요한 건조 표본은 추가 처리까지 방 온도에서 저장될 수있다면. </li></ol> 2. 매트릭스 다당류 성분 이 방법은 기본적으로 Albersheim 1 발행 방식의 변경이다. <ol><li> 벽 소재의 monosaccharide 구성을 확인하려면 직접 또는 iWall, 로봇 분쇄 및 무게 로봇을 사용하여 highthroughput 방식 중 2ml starstedt 튜브에 세포 벽 재료 2 MG 나가는거야. </li><li> 내부 표준으로 이노시톨 솔루션 (5mg/ml) 20 UL을 추가합니다. 2 MG 세포 벽 샘플을 위해 100 UG를 추가하는 것이 좋습니다. </li><li> 튜브의 바닥에있는 세포 벽 자료를 수집하는 아세톤 250 UL과 튜브 벽을 씻어하고, 공기에서 아세톤은 매우 부드러운 증발. </li><li> 약한 산성 가수 분해에 대한 각각의 샘플에 2M trifluoroacetic 산성 (TFA) 250 UL를 추가합니다. 어떤 물질이 튜브 벽에까지 치켜하지 않도록 신중하게 TFA를 추가합니다. </li><li> 단단히 뚜껑 121 90 분 품어 ° 가열 블록의 C. </li><li> 얼음 가열 블록 및 샘플을 냉각. </li><li> 10 분 10,000 RPM에서 튜브를 원심 분리기. </li><li> 펠렛 자료를 방해하지 않도록하는 유리 스크류 캡 튜브에 monosaccharide를 파생 매트릭스 다당류를 포함하는 산성 뜨는 100 UL을 전송. 펠렛은 (3을 참조하십시오.) 아래의 결정성 셀룰로오스 분석에 사용할 수 </li><li> 증발 장치의 공기의 부드러운 흐름에 따라 유리관에 TFA를 증발. </li><li> 300 μl 2 - 프로파놀, 소용돌이를 추가하고 25 증발 ° C (세 번 총 반복) </li><li> alditol 아세테이트 derivati​​zation 절차의 첫 번째 단계는 해당 alditols 수있는 단당류의 감소를 수행하는 것입니다. 이러한 목적으로 각 건조 시료에 나트륨 borohydride 솔루션 200 μl를 추가합니다. 신선한 해결책에게 1M 질산 수산화의 1ml 당 나트륨 borohydride의 10mg을 사용하여 각 시간을 준비합니다. </li><li> 1.5 시간 동안 실온에서 유리관를 떠나 </li><li> 빙초산 150 UL 추가하여 솔루션을 중화 </li><li> 25 와동과 증발 ° C. </li><li> 250 μl 초산 / 메탄올 (1시 9분, V / V), 소용돌이를 추가하고 25 증발 ˚ C </li><li> (세 번 총 반복) 250 μl 메탄올을 추가하고, 공기의 흐름에 따라 증발 </li><li> alditols의 아세틸화 들면, 아세트산 무수물 50 μl와 Pyrid 50 μl를 추가121 20 분 이네, 소용돌이 그리고 품어 ° 가열 블록의 C. </li><li> 얼음 블록 시원하고 샘플 다운은 약 상온으로 온도 감소를 기다리는 동안. </li><li> 상온에서 공기의 부드러운 흐름에 따라 시약을 증발. 주의 : alditol acetates는 매우 휘발성이 있습니다. </li><li> 공기 아래에 200 μl 톨루엔을 추가하고 증발 (X3) </li><li> 마지막 단계에서는 alditol acetates가 추출됩니다. 첫째, 에틸 아세테이트 및 가볍게 소용돌이 500 UL를 추가합니다. </li><li> 이 물을 ML, 캡 튜브와 와동를 추가합니다. </li><li> 맑은 별도의 레이어 (상단에 에틸 아세테이트, 바닥에 물)을 구하는 5 분 2,000 RPM에서 튜브를 원심 분리기 </li><li> 삽입과 GC / MS 유리병에 에틸 아세테이트 층의 피펫 50 UL. </li><li> GC - 유리병과 뚜껑에 아세톤 100 UL을 추가하여 희석. 샘플 농도가 너무 높은 경우 샘플 볼륨 및 희석 볼륨은 GC / MS를 과부하 방지하기 조정할 수 있습니다. GC - 유리병 4 ° C가, GC / MS 분석을 즉시 진행되지 않는 경우에 저장할 수 있습니다 </li><li> 샘플은 quadrupole MS를 갖춘 GC에 주입하지만, 불꽃 이온화 검출기도 적합합니다. Supelco SP - 2380 (30mm X 0.25mm X 0.25 μm의 필름 두께) 컬럼 4min 용매 지연과 1.5ml/min의 유량과 함께 사용됩니다. 주입 샘플은 다음과 온도 프로그램에 들어서는 아르 : 160에서 초기 개최 ° 2 분 C, 20 ° 200 C / 분 램프 ° C 5 분 개최, 20 ° 245 C / 분 램프 ° C 유지 12 분, 270 스파이크 ° C와 160 ° C 2.26의 초기 온도까지 냉각하기 전에 5 분 기다) 봉우리가 표준 대량 프로필 및 / 또는 유지 시간에 의해 식별됩니다.. 단당류는 표준 곡선에 따라 계량입니다. </li></ol> 3. 결정 셀룰로오스 내용 이 방법은 기본적으로 Updegraf 8 시까지 설명되어 있습니다. 절연 세포 벽 재료 (1 참조) 또는 이미 2M TFA (2.8 참조) 중 남아있는 펠렛 즉시 산성 치료 후 (2.8 참조) 또는 TFA로 처리되어 벽의 재질 :이 절차를위한 시작 물질의 여러 가지가 있습니다 2 - 프로파놀, 말린과 함께 세탁되었습니다 펠릿. <ol><li> Updegraff 시약의 나사 덮인 유리관 1 ML (질산 : 물, 8시 1분 2초 V / V 초산)에서 TFA 펠렛에 추가합니다. </li><li> 100 가열 블록에 밀접하게 캡 튜브, 소용돌이, 그리고 열 ° C 30 분. 이 치료의 결과로만 결정 셀룰로오스는 펠렛의 불용성 남아 있습니다. </li><li> 객실 온도 또​​는 냉각기에 얼음 블록 시원하고 샘플 </li><li> 원심 분리기 샘플 15 분 10,000 rpm으로 </li><li> 펠렛이 없어야하고 제거 펠렛부터 물질이 아니라고 보장 뜨는 폐기하십시오. 이런 목적을 위해 약 두십시오. 튜브의 표면에 뜨는 150 UL. </li><li> , 원심 분리기를 흔들, 물 1.5 ML를 추가하여 위의 완료로 뜨는 취소 </li><li> 아세톤 1.5 ML을 사용하여 프로 시저 추가 3 번 반복 세척 </li><li> 공기 건조 펠렛은 매우 부드럽게 공기 같이, 또는 야간 벤치에서 건조시킬 </li><li> 펠렛 (결정 셀룰로오스)는 Saeman 가수 분해라는 무엇에 의해 지금은 포도당으로 완전히 분해됩니다. 이러한 목적은 sarstedt 튜브에 175 μl 72%의 황산을 추가를위한 </li><li> 또 다른 15 분 30 분, 소용돌이 및 부화에 대한 실온에서 알을 품다 </li><li> 825 μl 물 소용돌이를 추가 </li><li> 5 분 10,000 RPM에서 샘플을 원심 분리기. 튜브에 남아 약간 갈색 불용성 물질, 리그닌이있을 수 있습니다. </li><li> 뜨는의 포도당 내용은 colorimetric anthrone 분석을 사용하여 assayed입니다. 이 분석은 96 잘 폴리스티렌 microtiter 플레이트에서 수행됩니다. </li><li> 표준 곡선은 1mg/ml 포도당 주식 (0 ° C에서 저장)을 사용하여 0, 2, 4, 6, 8, 10 UL을 pipetting하여 0, 2, 4, 6, 8, 10 UG 표준을 중복 작성을위한 별도의 적합한 우물에. 물을 각각 잘 최대 100 UL을 입력합니다. </li><li> 별도의 셀에하지만 표준으로 동일한 microtiter 접시에 각 시료 표면에 뜨는 10 μl와 물 90 ML를 추가합니다. </li><li> 신선한 Anthrone 시약 (Anthrone이 집중 황산, 2 MG anthrone / ML 황산에 용해) 200 μl를 추가 </li><li> 80 30 분 열 플레이트 오븐에 ° C (알루미늄 히트 스프 레더). 포도당이 포함된 샘플은 푸른 녹색으로 노란색에서 설정합니다. </li><li> 룸 온도에 접시가 식지 철저하게 발라줍니다. </li><li> microtiter 접시 리더를 사용하여 625mm에서 접시의 흡수를 참조하십시오. </li><li> 포도당 (그리고 따라서 결정 셀룰로오스 함량)가 같은 접시에 설립 표준 곡선과 비교하여 흡광도를 기반으로 계산됩니다. </li></ol> 4. 대표 결과 벽 분석의 예제는 그림 2에 표시됩니다. 이 경우에는 포플러 줄기 (나무)은 프로토콜 섹션에서 설명한 여러 가지 절차에 의해 분석되었다. 매트릭스 POlysaccharide 구성이 식물 세포 벽에있는 전형적인 설탕 선물을 식별하는 예제 크로마토 그램으로 강조 표시됩니다, fucose, rhamnose, 자일로 오스, arabinose, 갈락토 오스, mannose와 포도당 (및 내부 표준 이노시톨). 높은 자일로 오스 함량에 의해 증명으로 포플러의 주요 hemicellulosic 구성 요소 크실란입니다. 그러나 이러한 당분의 풍부한는 공급 원료의 used4에 따라 달라집니다. 이 분석에서 포도당은 hemicellulose의 xyloglucan 및 비정질 셀룰로스에서 파생됩니다. 분석에 의한 데이터는 몰의 % 또는 UG / MG 벽 재​​료 (또는 건조 중량)로 제시하실 수 있습니다. 결정 셀룰로오스의 내용은 자체 설명이고, 하나는 벽 건조 무게의 20-50% 사이의 가치를 기대할 수 있습니다. 여기 부품 I3에 표시된 결과를 바탕으로 포플러 나무의 리그노셀룰로오스성 구성은 21 % 리그닌, 30 % hemicelluloses 및 41% 결정 셀룰로오스이다. 나머지 화산재 것입니다. <img src="/files/ftp_upload/1837/1837fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1 :. 리그노셀룰로오스성 분석의 개요 세포 벽 (lignocellulosics)는 원유 건조 식물으로부터 격리됩니다. 벽 재료는 다음 aliquots에 가중치 및 다양한 assays에 대한 세분화됩니다. 매트릭스 다당류 성분은 약한 산성 (2M TFA)와 벽에 자료를 치료 자신의 alditol acetates하는 결과 solubilized 단당류를 derivati​​zing하고, GC - MS에 의해 분석 후에 설정됩니다. 약한 산성 치료의 잔여물은 소위 Updegraff 시약은 뒤에서만 불용성 crystlline의 셀룰로오스를 떠나지로 세탁합니다. 셀룰로오스는 황산에 의해 solubilized 및 포도당 내용을 결정하는 colorimetric 분석하여 계량입니다. 부 3에서 설명한대로 병렬로, 리그닌의 내용과 구성이 결정하실 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1837/1837fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2 :. 포플러 (포풀러스 tremoloides)에서 포플러 나무 종합 리그노셀룰로오스성 분석 우드 칩은 설명 프로토콜에 받게되었습니다. 왼쪽 상단 : 매트릭스 다당류 성분, Fuc fucose, rhamnose Rha, 아라 arabinose, Xyl 자일로 오스, 남자 mannose, 걸 갈락토 오스, Glc 포도당, 이노시톨 내부 기준.

<ol>
	<li>Albersheim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+analysis+of+sugars+in+plant+cell+wall+polysaccharides+by+gas-liquid+chromatography.">A method for the analysis of sugars in plant cell wall polysaccharides by gas-liquid chromatography.</a> Carbohydr. Res. 5, 340-340 (1967).</li><li>Carroll, A., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulosic+Biofuels.">Cellulosic Biofuels.</a> Annu Rev Plant Biol. 60, 165-165 (2009).</li><li>Foster, C. E., Martin, T., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+compositional+analysis+of+Plant+Cell+Walls+(Lignocellulosic+biomass),+Part+I:+Lignin.">Comprehensive compositional analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass), Part I: Lignin.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li><li>Pauly, M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-wall+carbohydrates+and+their+modification+as+a+resource+for+biofuels.">Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels.</a> Plant J. 54 (4), 559-559 (2008).</li><li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+systems+approach+to+understanding+plant-cell+walls.">Toward a systems approach to understanding plant-cell walls.</a> Science. 306 (5705), 2206-2206 (2004).</li><li>Teeri, T. T., Brumer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+characterisation+and+applications+of+enzymes+from+the+wood-forming+tissues+of+poplar:+Glycosyl+transferases+and+xyloglucan+endotransglycosylases.">Discovery, characterisation and applications of enzymes from the wood-forming tissues of poplar: Glycosyl transferases and xyloglucan endotransglycosylases.</a> Biocatalysis and Biotransformation. 21, 173-173 (2003).</li><li>UPDEGRAF, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEMIMICRO+DETERMINATION+OF+CELLULOSE+IN+BIOLOGICAL+MATERIALS.">SEMIMICRO DETERMINATION OF CELLULOSE IN BIOLOGICAL MATERIALS.</a> Anal. Biochem. 32 (3), 420-420 (1969).</li></ol>

설명 방법 리그노셀룰로오스성 식물 바이오 매스의 구성의 급속한 양적 평가를 가능하게합니다. 방법은 즉 매트릭스 다당류 hemicelluloses의 설탕 구성, 결정 셀룰로오스 내용을 포함하여 같은 물질의 조성의 결정 수 있습니다. 인당 다양한 분석 방법의 처리량이 다릅니다. 여기에서 설명한 프로토콜을 사용하여, 20 샘플이 결정 셀룰로오스 내용에 대한 매트릭스 다당류의 성분과 30 처리할 수 있습니다. 데이터 최적의 공급 원료 작물의 양적 특성으로 인해, 다양한이나 genotypes는 생물 연료 생산을위한 그들의 적합성의 관점에서 평가하실 수 있습니다.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Trifluoroacetic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T6508</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>myo-Inositol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>I5125</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Borohydride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>213462</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pyridine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>J.T. Baker</td>
<td>3348-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acetic Anhydride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>320102</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spectromax Plus 384</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Plus384</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GC-MS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>7890A GC/5975C MSD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5.5mm Stainless Steel Balls</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Salem Ball Company</td>
<td>(N/A)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>96 well plate heat spreader</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biocision</td>
<td>Coolsink 96F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Retsch Mill</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>TissueLyser II</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heating block</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Techne</td>
<td>Dri-block DB-3D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sample concentrator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Techne</td>
<td>FSC400D</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part ii: carbohydrates

재생, 탄소 중립, 그리고 산업과 사회에 대한 지속적인 원료의 필요성은 21 세기의 가장 눌러 문제 중 하나가되고있다. 이것은 교통 액체 연료의 생산을위한 산업 원료 등 공장 제품의 사용에 흥미를 rekindled있다<sup&gt; 2</sup이러한 biocomposite 자료 등&gt; 및 기타 제품<sup&gt; 6</sup&gt;. 식물 바이오 매스는 지구상에서 가장 큰 미개척 보유 중 하나 남아있다<sup&gt; 4</sup&gt;. 그것은 주로 에너지 셀룰로오스를 포함한 다양한 고분자 다양한 hemicelluloses 및 폴리페놀 리그닌 구성되어 있으며 세포 벽 구성됩니다<sup&gt; 5</sup&gt; 때문에 때로는 lignocellulosics를 칭했다. 그러나, 식물의 세포 벽을 벽에 강도와 전체 식물의 구조적 무결성에 광범위하게 기여로 저하에 완강히 저항하는 것으로 진화했습니다. 의 필요한 강성에도 불구하고, 세포 벽이 metabolically 활성 및 식물의 성장과 분화와 같은 다양한 세포 활동에 중요한 역할을 담당하고 매우 역동적인 실체이다<sup&gt; 5</sup&gt;. 벽의 다양한 기능으로 인해 엄청난 구조적 다양성은 단일 플랜트 내의 다른 식물 종의 및 세포 유형의 벽 안에있다<sup&gt; 4</sup&gt;. 따라서 농작물 종, 작물 다양성, 또는 식물의 조직이 biorefinery 사용되는 무엇에 따라, 화학 / 효소 프로세스와 액체 바이오 연료에 대한 다양한 설탕의 후속 발효에 의해 depolymerisation에 대한 처리 단계 조정하고 최적화해야합니다. 이 사실 뒷받침 식물 바이오 매스 feedstocks의 철저한 특성화를위한 필요합니다. 여기 lignocellulosics의 구성의 결정을 가능하게 높은 처리량 분석 매체 (그림 1) 의무가있는 포괄적인 분석 방법을 설명합니다. 방법은 destarched 세포 벽 재료 준비와 함께 시작합니다. 그 결과 lignocellulosics는 다음의 hemicelluloses의 monosaccharide 구성 및 기타 매트릭스 polysaccharides1하고, 결정 셀룰로오스의 내용을 확인하기 위해 갈라 아르<sup&gt; 7</sup&gt;. 리그노셀룰로오스성 바이오 매스의 리그닌 구성 요소를 분석하는 프로토콜은 부분을 설명합니다 I<sup&gt; 3</sup&gt;.

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Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

식물 바이오 매스는 바이오 연료 생산에 사용될 수있는 주요 탄소 중립 되살릴 수있는 자원입니다. 식물 바이오 매스는 주로 세포 벽, lignocellulosics를 칭했다 구조적으로 복잡한 복합 재료로 구성되어 있습니다. 여기서 우리는 콘텐츠와 벽 파생 탄수화물의 구성의 포괄적인 분석을 위해 프로토콜을 설명합니다.

식물 세포 벽의 종합 작곡 분석 (리그노셀룰로오스성 바이오 매스) 2 부 : 탄수화물

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

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Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

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29.9K 조회수.  Michigan State University (MSU). 식물 바이오 매스는 바이오 연료 생산에 사용될 수있는 주요 탄소 중립 되살릴 수있는 자원입니다. 식물 바이오 매스는 주로 세포 벽, lignocellulosics를 칭했다 구조적으로 복잡한 복합 재료로 구성되어 있습니다. 여기서 우리는 콘텐츠와 벽 파생 탄수화물의 구성의 포괄적인 분석을 위해 프로토콜을 설명합니다.

비디오: Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells. Members of the orthopox genus include variola, the causative agent of human small pox, monkeypox, and vaccinia (VAC), the prototypic member of the virus family. Within the relatively large (~ 200 kb) vaccinia genome, three classes of genes are encoded: early, intermediate, and late. While all three classes are transcribed by virally-encoded RNA polymerases, each class serves a different function in the life cycle of the virus. Poxviruses utilize multiple strategies for modulation of the host cellular environment during infection. In order to understand regulation of both host and virus gene expression, we have utilized genome-wide approaches to analyze transcript abundance from both virus and host cells. Here, we demonstrate time course infections of HeLa cells with Vaccinia virus and sampling RNA at several time points post-infection. Both host and viral total RNA is isolated and amplified for hybridization to microarrays for analysis of gene expression.

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 1 of 3.

우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 1 부

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

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생물학

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells. Members of the orthopox genus include variola, the causative agent of human small pox, monkeypox, and vaccinia (VAC), the prototypic member of the virus family. Within the relatively large (~ 200 kb) vaccinia genome, three classes of genes are encoded: early, intermediate, and late. While all three classes are transcribed by virally-encoded RNA polymerases, each class serves a different function in the life cycle of the virus. Poxviruses utilize multiple strategies for modulation of the host cellular environment during infection. In order to understand regulation of both host and virus gene expression, we have utilized genome-wide approaches to analyze transcript abundance from both virus and host cells. Here, we demonstrate time course infections of HeLa cells with Vaccinia virus and sampling RNA at several time points post-infection. Both host and viral total RNA is isolated and amplified for hybridization to microarrays for analysis of gene expression.

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 2 of 3.

우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 2 부

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 3 describes the process of fluorescently labeling the amplified RNA from both host and viral samples by amino allyl coupling of dyes. Part 3 of 3.

우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 제 3

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristics, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004 and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. As described in Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue, human pancreas was trimmed, cannulated, perfused, and digested. After collection and at least 30 minutes of incubation in UW solution, the tissue was loaded in the cell separator (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) for purification 3. Following purification, islet yield (expressed as islet equivalents, IEQ), tissue volume, and purity was determined according to standard methods 9. Isolated islets were cultured in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), supplemented with 1.5% human albumin, 0.1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 1 ml of Ciprofloxacin, 5 ml o f 1M HEPES, and 14.5 ml of 7.5% Sodium Bicarbonate in T175 flasks at 37&deg;C overnight culture before islets were transplanted or used for research.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part II: purification and culture of human islets) using a modified automated method.

인간 췌장 아일릿 절연 : 2 부 : 인간 아일 레츠의 정화와 문화

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

식물 Protoplasts의 형광 활성 세포 정렬

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation1 and other products such as biocomposite materials7. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses (matrix polysaccharides, and the polyphenol lignin6 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls provide tensile strength to cells and the entire plants, ward off pathogens, and allow water to be transported throughout the plant; in the case of trees up to more the 100 m above ground level. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerization by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis. In this first part we focus on the analysis of the polyphenol lignin (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its lignin content by acetylbromide solubilization3, and its lignin composition in terms of its syringyl, guaiacyl- and p-hydroxyphenyl units5. The protocol for analyzing the carbohydrates in lignocellulosic biomass including cellulose content and matrix polysaccharide composition is discussed in Part II2.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of the polyphenolic lignin.

식물 세포 벽의 종합 작곡 분석 (리그노셀룰로오스성 바이오 매스) 부 I : 리그닌

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find cost-effective and sustainable solutions has become a topical and critical task. Lignocellulosic biomass is poised to become the primary source of biomass for the conversion to liquid biofuels1-6. However, the recalcitrance of these plant cell wall materials to cost-effective and efficient degradation presents a major impediment for their use in the production of biofuels and chemicals4. In particular, lignin, a complex and irregular poly-phenylpropanoid heteropolymer, becomes problematic to the postharvest deconstruction of lignocellulosic biomass. For example in biomass conversion for biofuels, it inhibits saccharification in processes aimed at producing simple sugars for fermentation7. The effective use of plant biomass for industrial purposes is in fact largely dependent on the extent to which the plant cell wall is lignified. The removal of lignin is a costly and limiting factor8 and lignin has therefore become a key plant breeding and genetic engineering target in order to improve cell wall conversion.
Analytical tools that permit the accurate rapid characterization of lignification of plant cell walls become increasingly important for evaluating a large number of breeding populations. Extractive procedures for the isolation of native components such as lignin are inevitably destructive, bringing about significant chemical and structural modifications9-11. Analytical chemical in situ methods are thus invaluable tools for the compositional and structural characterization of lignocellulosic materials. Raman microscopy is a technique that relies on inelastic or Raman scattering of monochromatic light, like that from a laser, where the shift in energy of the laser photons is related to molecular vibrations and presents an intrinsic label-free molecular "fingerprint" of the sample. Raman microscopy can afford non-destructive and comparatively inexpensive measurements with minimal sample preparation, giving insights into chemical composition and molecular structure in a close to native state. Chemical imaging by confocal Raman microscopy has been previously used for the visualization of the spatial distribution of cellulose and lignin in wood cell walls12-14. Based on these earlier results, we have recently adopted this method to compare lignification in wild type and lignin-deficient transgenic Populus trichocarpa (black cottonwood) stem wood15. Analyzing the lignin Raman bands16,17 in the spectral region between 1,600 and 1,700 cm-1, lignin signal intensity and localization were mapped in situ. Our approach visualized differences in lignin content, localization, and chemical composition. Most recently, we demonstrated Raman imaging of cell wall polymers in Arabidopsis thaliana with lateral resolution that is sub-&mu;m18. Here, this method is presented affording visualization of lignin in plant cell walls and comparison of lignification in different tissues, samples or species without staining or labeling of the tissues.

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

A method based on confocal Raman microscopy is presented that affords label-free visualization of lignin in plant cell walls and comparison of lignification in different tissues, samples or species.

라벨 - 무료 현장에서</em식물 세포 벽 Lignification의> 이미징

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Microarrays를 사용하여 식물 세포의 벽 폴리머의 Glycan 프로파일

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

비교 단백체 분석을위한 신진 대사 라벨링 및 막 분별<em&gt; 애기 장대</em&gt; 서스펜션 세포 배양

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

전체 마운트 난자에있는 염색질 수정 및 핵 구조의 정량, 단일 세포 분석을위한 효율적인 방법<em&gt; 애기 장대</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...