이 프로토콜은 고체 핵 자기 공명, 또는 NMR, 및 동적 핵 편광, 또는 DNP, 복잡한 생물 시스템 특성화를 위한 실험을 위한 곰팡이 및 식물 물질을 준비하는 데 사용될 수 있습니다. 이 기술은 우리가 그들의 네이티브 환경에서 원자 해상도 수준에 생물 물질을 조사 할 수 있습니다, 예를 들어, 전체 세포에서. 곰팡이 재료에 대한 고해상도 구조 정보의 수집은 항진균 제 개발에 도움이 될 것입니다.
이 방법은 곰팡이 세포벽에서 복잡한 탄수화물의 구성 및 구조에 대한 통찰력을 제공하며 식물, 곰팡이, 조류 및 박테리아를 포함한 많은 탄수화물이 풍부한 유기체에 적용 될 수 있습니다. 몇몇 조사자는 그들의 세포 문화에 있는 곰팡이 오염으로 투쟁할 수 있습니다. 내 조언은이 오염을 방지하기 위해 사용하기 전에 매체와 장비를 철저히 살균하는 것입니다.
이 데모는 NMR 또는 세포 배양에 경험이 거의 없는 조사관이 곰팡이 및 식물 시스템에서 이러한 기술을 구현하는 방법을 배우는 데 도움이 될 것입니다. 라벨이 없는 액체 성장 매체를 준비하려면 6.5그램의 효모 추출물 펩톤 덱스트로스 또는 YPD 분말을 증류수 100밀리리터에 녹인 다음 134°C에서 25분 동안 생성된 용액을 오토클레이브하십시오. 라벨이 부착되지 않은 고체 성장 매체를 준비하려면 6.5그램의 YPD 한천 분말을 증류수 100밀리리터에 넣고 중간을 섭씨 121도에서 25분 동안 오토클레이브한 후 중간을 섭씨 약 50도까지 냉각시킵니다.
그런 다음, 녹은 고체 성장 매체의 13~15밀리리터를 개별 멸균 플라스틱 페트리 접시에 옮기고, 즉시 뚜껑을 접시에 놓습니다. 탄소-13, 질소-15 라벨 액체 성장 매체를 준비하기 위해, 필요에 따라 산 또는 염기로 6.6의 pH에 최소 배지를 함유하는 동위원소의 100밀리리터 부피를 조정한다. 다음으로, 테이블에 나열된 소금을 증류수 100밀리리터에 녹이고, 탄소-13, 질소-15 라벨액체 성장 매체에 추가하고, 121°C에서 25분 동안 생성된 용액을 오토클레이브한다.
용액이 실온으로 냉각되면 100 마이크로리터의 미량 원소 용액을 탄소-13, 질소-15 라벨최소 배지의 전체 부피에 추가합니다. 곰팡이 재료를 성장시키기 위해, YPD 접시에 저장에서 곰팡이의 소량을 전송하는 접종 루프를 사용하고, 30섭씨 인큐베이터에서 이틀 동안 곰팡이를 배양. 인큐베이션의 끝에서, 탄소-13, 질소-15 라벨 액체 성장 매체에 활성 성장 곰팡이 가장자리를 전송하고, 흔들리는 인큐베이터에서 3 ~ 5 일 동안 분당 30도 및 220 회전에 문화를 배치하는 새로운 접종 루프를 사용합니다.
다량의 곰팡이가 플라스크 바닥을 덮고 액체에 떠있는 경우 원심 분리로 곰팡이를 수집하고 상퍼를 폐기하십시오. 적절한 용액으로 펠릿을 수화하고, 포셉을 사용하여 NMR 및 DNP 분석을 위해 잘 수화된 펠릿의 약 0.5 그램을 수집합니다. 그런 다음, 나머지 물질을 원물 튜브에 20% 글리세롤 용액과 혼합하고 곰팡이 샘플을 영하 80도의 영하로 배치하여 장기 보관을 합니다.
고체 NMR 분석을 위해 A.fumigatus를 준비하기 위해 먼저 3.5킬로달톤의 분자량 차단이 있는 투석 백을 사용하여 0.5그램 탄소-13, 질소-15 라벨이 부착된 곰팡이 샘플을 3일 동안 섭씨 4도에서 10밀리머 포산염 버퍼1리터에 투석합니다. 투석이 끝나면 원심분리를 위해 15밀리리터 튜브로 샘플을 옮기고, 균일하게 탄소-13 라벨이 부착되고 수분이 잘 수화된 샘플 페이스트를 70~80밀리그램으로 4mm 지르코늄 이산화저로 포장합니다. 금속 막대를 사용하여 샘플을 부드럽고 반복적으로 짜서 종이를 사용하여 여분의 물을 흡수합니다.
그런 다음 로터를 단단히 캡하고 샘플을 분광계에 삽입하여 솔리드 스테이트 NMR 특성화를 합니다. DNP 분석을 위한 A.fumigatus를 준비하려면 탄소-13당 1.5밀리리터 미세센심분리기 튜브에 100마이크로리터를 추가하고, 탄소-15라벨이 부착된 진균 샘플, 각 튜브에 0.7밀리그램의 편광제를 용해하여 10mm+라디칼 스톡 솔루션을 형성합니다. 라디칼이 용액에 완전히 용해되도록 2~3분 동안 소용돌이를 일으키고, 편광제 용액의 50마이크로리터에 투석된 탄소 13, 질소-15 라벨이 부착된 곰팡이 샘플을 담그고, 유봉과 박격포를 사용하여 다공성 세포 벽에 래디칼의 침투를 보장하기 위해 혼합물을 약간 연마합니다.
진균 샘플을 더 수화하고 펠릿을 3.2mm 사파이어 로터에 포장하기 위해 진층 펠릿에 급진적 인 용액30 마이크로 리터를 추가합니다. 시연된 대로 약간 짜서 과도한 DNP 용매를 제거하고 3.2mm 실리콘 플러그를 추가하여 수분 공급손실을 방지합니다. 그런 다음 일상적인 실험을 위해 NMR 분광계또는 전자레인지 조사 하에서 DNP 강화 스펙트럼을 측정하기 위한 DNP 분광계에 로터를 추가합니다.
DNP 연구를 위한 식물 재료를 준비하려면 면도날을 사용하여 균일하게 탄소 13라벨이 부착된 식물 재료를 1~2mm 조각으로 자른다. 박격포와 유봉을 사용하여 최종 분말이 균일한 모양이 될 때까지 조각을 작은 입자로 갈아냅니다. 10밀리머 라디칼 스톡 솔루션 40마이크로리터를 식물 소재에 추가하고, 5분 동안 샘플을 가볍게 갈아서 라디칼과 균일한 혼합을 보장합니다.
고지 샘플을 라디칼 스톡 솔루션의 20 마이크로리터로 수화하고, DNP 분석을 위해 3.2밀리미터 사파이어 로터에 평형 식물 샘플을 포장합니다. 그런 다음, 수분 공급의 손실을 방지하기 위해 실리콘 플러그를 삽입하고, DNP 분광계에 샘플을로드합니다. 동위원소 라벨링은 NMR 민감도를 실질적으로 향상시키고 세포벽 건축의 3차원 모델 의 생성을 위한 조성, 수분, 이동성 및 포장을 분석하기 위해 일련의 2차원 탄소-13-탄소-13 및 탄소-13-질소-15 상관 스펙트럼을 측정할 수 있게 한다.
2D 탄소-13-탄소-13 스펙트럼에서 오프 대각선 신호를 얻기 어려운 경우 통계 라벨링이 발생했을 수 있습니다. 2개의 탄소-13 봉우리96 및 백만당 92 부(parts)는 포도당의 대표적인 탄소-1 신호입니다. 따라서, 35초의 긴 재활용 지연으로 측정된 정량적 탄소-13 직접 편광 스펙트럼에서의 강한 강도는 전형적으로 불완전한 투석 또는 세척으로 인한 소분자의 지배력을 나타낸다.
잘 표지된 시료를 사용하면 생체 분자의 공간 근접성을 감지하고 그대로 세포벽의 구조 모델을 구성하기 위해 장거리 상관 관계를 더 측정할 수 있습니다. 이 기술은 많은 자연 발생 및 엔지니어링 재료의 구조 기능을 탐구할 수 있게 해주며, 탄수화물이 풍부한 생체 재료 및 기능성 폴리머에 대한 향후 연구를 용이하게 합니다. 일부 곰팡이는 인간에 있는 감염 또는 체계적인 질병을 일으키는 원인이 될 수 있기 때문에, 보호를 위해 라미나르 흐름 후드에 있는 곰팡이 물질을 취급하고 노출을 최소화하십시오.
