This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research (NSERC)-USRA grant to S.J., and by an NSERC-Discovery Grant to I.M. We thank Richard Bourgault, Meghan Rains, and Amanda Fluke for technical assistance. Seeds of att1-1 and att1-2 mutants were kindly provided by Dr. Jian-Min Zhou, Institute of Genetics and Developmental Biology, Beijing, China.

참고 :이 프로토콜은 보나 벤처 호텔 등의 알에서 적응했다. (2004), 몰리나 등. (2006), 리튬 등. (2013) 7,10,11. 1-5 단계는 그림 1에 요약되어있다. 1. 조직 탈지 참고 : 항상, 클로로포름 모든 유리와 모자를 씻어 사용하기 전에, 흄 후드에서 건조시키는. 주의 : 조직 균질화 및 흄 후드 아래에있는 모든 용매 전송 단계를 수행; 항상 화학 물질과 직접 접촉을 방지하고 오염으로부터 샘플을 보호하기 위해 실험실 코트, 장갑, 스플래시 안전 고글을 착용하십시오. <ol><li> 예열 물 목욕 및 85 ° C의 열 블록. </li><li> 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 캡 나사 벌였습니다 미리 칭량 20mm X 125mm 유리 시험관에 각 리프 시료 약 0.5 g을 단다. 샘플 당 네 개의 복제를 포함합니다. </li><li> 삼각 플라스크 (약 125 ml의 2- 프로판올을 배치; SAMP의 g 당 25 ㎖를르). 0.01 %의 최종 농도 (또는 부틸 히드 록시 톨루엔, BHT로 알려진) 2,6- 디 -tert- 부틸 -4- 메틸 페놀을 추가 (W / V). 주 : 메탄올 모액 (/ V W) 5 % 내지 BHT 추가 (BHT는 불포화 지방산의 산화를 최소화). </li><li> 물을 욕조에 85 ° C로 예열 2- 프로판올 솔루션입니다. </li><li> 열 블록에 85 ° C에서 15 분 동안 각각의 샘플 튜브 가열로 12 ml의 뜨거운 -2- 프로판올 용매를 추가한다. 이 단계는 파괴 세포에서 방출 될 수 리파제를 비활성화합니다. </li><li> 튜브를 실온으로 냉각하고 균질 한 현탁액을 수득 할 때까지 균질 조직을 완전히 분쇄하자. </li><li> 궤도 통에 샘플을 넣고 100 rpm으로 상온에서 1~2 시간 동안 흔들어. </li><li> 800 XG에서 10 분 동안 원심 분리기 및 상층 액을 버린다. </li><li> 2- 프로판올의 동량을 첨가하고, 실온에서 12 시간 동안 흔들어. </li><li> 800 XG에서 10 분 동안 원심 분리기 및 상층 액을 버린다. </li><li> 12 ㎖의 CH 추가CL 3 : CH 3 OH (2 : 1, V / V) (샘플의 g 당 25 ㎖)에 잔류 물 100 rpm으로 실온에서 밤새 흔들. </li><li> 800 XG에서 10 분 동안 원심 분리기 및 상층 액을 버린다. </li><li> 12 ml의 클로로포름 추가 : CH 3 OH를 (1 : 2, v / v)의 잔류 물 100 rpm으로 실온에서 하룻밤 흔들. </li><li> 800 XG에 10 분 동안 원심 분리기 및 용매 제거합니다. </li><li> 샘플을 실온에서 밤새 흄 후드에서 건조 시키십시오. </li><li> 잔류 물을 공기 - 건조 후, 무수 CaCl2를 또는 일정한 중량 (3~5일)에 도달 할 때까지 4 CASO 위에 진공 데시 케이 터 내에서 배치했다. </li></ol> 2. 해중합 : 나트륨 메톡와 메탄올 (그림 2) 주의 : - 2.4, 2.7-2.8, 2.10 - 단계 2.3 수행 2.15과 2.17 - - 2.11, 2.13 흄 후드에서 2.18; 항상 실험실 코트, 장갑, 스플래시 안전 고글을 착용하십시오. <ol><li> 60 ℃로 예열 열 블록. </li><li> (추가 계산을 위해 중요) 건조 잔류 물을 포함하는 테스트 튜브의 무게. </li><li> 각각의 튜브 내부 기준을 추가 : 25 ωL 메틸 heptadecanoate (1 ㎎ / ㎖ 주) 25 μL의 ω-pentadecalactone (1 ㎎ / ㎖ 주식을). </li><li> 각 튜브에 0.9 ml의 메틸 아세테이트, 1.5 ml의 나트륨 메톡 시드, 및 3.6 mL의 메탄올을 첨가하고 그들을 모자. 다르게는, 이러한 세 가지 시약과의 반응 혼합물을 준비하고, 각 샘플을 6 mL의 분취 량을 추가한다. </li><li> 2 ℃에서 60 시간 동안 주기적으로 15 분 간격으로 선회 용 열 샘플. </li><li> 샘플을 실온까지 냉각 보자. </li><li> 지방산 메틸 에스테르를 추출 메틸렌 클로라이드 (CH 2 CL (2)) 및 빙초산 150 mL를 10 ㎖를 추가한다. </li><li> 각각의 튜브와 캡을 채우기 위해 생리 식염수 (0.5 M의 NaCl)를 추가합니다. </li><li> 800 X g에서 10 분 동안 1 분 원심 분리기에 대한 소용돌이 샘플. </li><li> 폴리 중형 크기의 튜브를 청소 (저급) 유기상을 트랜스퍼 (16 × 125mm의 유리 시험관테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE)를 벌였습니다 스크류 캡). </li><li> 각각의 튜브와 캡을 채우기 위해 생리 식염수 (0.5 M의 NaCl)를 추가합니다. </li><li> 800 X g에서 10 분 동안 1 분 원심 분리기에 대한 소용돌이 샘플. </li><li> 수성 (위) 단계를 제거하고를 반복 2.11-2.12 단계를 반복합니다. </li><li> 모든 수성 (위) 단계를 제거합니다. </li><li> 1 분 동안 튜브, 소용돌이 캡 용매에 무수 황산나트륨 (NA 2 SO 4)을 추가; 샘플은 현재 다음 날 때까지 남아있을 수 있습니다.이 점 샘플 흄 후드에서 밤새 남아있을 수 있습니다에서. </li><li> 하단에있는 나 2 SO 4 소금을 압축하는 800 XG에서 2 분 동안 원심 분리기. </li><li> 작은 유리 일회용 튜브 (폴리 테트라 플루오로 에틸렌 13 X 100mm 유리 테스트 튜브 (PTFE)를 벌였습니다 스크류 캡)에 유기 상을 전송합니다. </li><li> 질소 하에서 건조에 용매를 증발 및 유도체 화 단계로 진행합니다. 즉시 처리되지 않는 경우, 저장소는 -20 ° C에서 샘플을 증발시켰다 (샘플 일 수있다LSO) 증착 단계 이전에 저장된다. </li></ol> 가스 크로마토 그래피 파생 상품 3. 준비 주의 : 단계 3.1.2과 3.1.5 수행 - 흄 후드에서 3.1.8을; 항상 실험실 코트, 장갑, 스플래시 안전 고글을 착용하십시오. <ol><li> 트리메틸 실릴 유도체 <ol><li> 100 ℃로 예열 열 블록. </li><li> 각각의 튜브에 피리딘 100 ㎕와 BSTFA (N, O 비스 - 트리메틸 실릴 - 트리 플루오)의 100 μl를 추가하고 캡. </li><li> 10 분 동안 100 ℃에서 가열 된 샘플. </li><li> 샘플을 실온까지 냉각 보자. </li><li> 실온에서 질소하에 샘플을 증발시켰다. 시료에 열을 가하지 마십시오, 단량체는이 단계에서 매우 휘발성이다. </li><li> 1 (v / v)의 헵탄 : 톨루엔 1의 500 μl를 추가합니다. </li><li> 800 X g에서 2 분 1 분 원심 분리기에 대한 소용돌이 샘플. </li><li> GC 바이알에 샘플을 추가하고 GC / MS 분석을 진행합니다. </li></ol></li><li> 아세틸파생 상품 주 : 아세틸 들어, 단계 수정 3.1.1-3.1.3 상기 (비디오에 도시되지 않음) 다음; 3.1.4-3.1.8이 동일한 단계 : <ol><li> 60 ℃로 예열 열 블록. </li><li> 피리딘 100 ㎕와 튜브에 아세트산 무수물 100 ㎕ (O 행 2)를 추가합니다. </li><li> 열 샘플 60 ° C에서 1 시간. </li></ol></li></ol> 4. GC / MS 분석 <ol><li> HP-5 캐 필러 리 컬럼 (30 MX 0.25 mm X 0.25 μm의 필름 두께) 또는 이와 동등한 (예., 5 % 페닐, 95 % 디메틸 폴리실록산)를 사용합니다. 프로그램 3 ℃ / 분으로 300 ℃까지 150에서 프로그래밍 헬륨 캐리어 가스 1.5 ml / 분으로 설정 유량 및 오븐 온도 GC. </li><li> 40-600 AMU (전자 충격 이온화)를 통해 모드를 스캔 분할 주입 (분할 비율 1시 10분) 및 설정 질량 분석기를 사용합니다. </li><li> 용매 (빈), (WT) 및 돌연변이 복제, 각 사용하여 표시 각질 분석 방법을 포함한 일련의 테이블을 만듭니다. </li><li> 로드 용매그리고 회전 목마 샘플 유리 병은, 필요한 경우 자동 시료 주입기에 주사기 세척 유리 병에 헥산을 추가하고 순서를 시작합니다. 시퀀스가 완료된 후, 총 이온 크로마토 그램 트레이스 모든 샘플 가능하다. </li></ol> 5. 데이터 분석 <ol><li> 게시 된 질량 스펙트럼에 대한 각 피크의 질량 스펙트럼을 비교하거나 가능한 경우 상용 라이브러리를 검색하여 지질 폴리 에스테르 단량체를 확인합니다. </li><li> 총 이온 전류 크로마토 그램의 각각의 피크에 대해 식별, GC / MS 소프트웨어 (기업도 1)에서 적분 결과 테이블 영역을 찾기 위해 각각의 체류 시간을 사용한다. </li><li> 각 단량체 (컬럼 AB)를 들면, 모노머의 엑셀 테이블 (보조 파일 2 열 CF)에서 샘플을 복제마다의 해당 칼럼에 통합 테이블 (기업도 1, 열 D)에 위치한 영역 값을 추가 스프레드 시트는 애기 장대를 정량화하기각질 TMSI 유도체. 아세틸 유도체 대신 준비하는 경우 보충 파일 3을 사용합니다. </li><li> IS 열 (홍콩)에 내부 표준 (IS)의 영역을 추가합니다. 단량체 테이블의 정량 (보라색 음영 셀에 대한있는 그대로 공 명성 (IS1); 보충을 : 그, 즉 지방산 메틸 에스테르를 유도하지 않는 단량체 (FAMES), 및 디카 르 복실 산 디메틸 에스테르 (DCA DMEs)의 경우, 17을 사용 파일 2/3). 차 알코올, 페룰 산 및 ω-하이드 록시 산을 포함하는 수산화 단량체, 15 사용 : 화합물 정량에 대한 선택의있는 그대로 0 ~ 15 하이드 록시 명성 (IS2) (단량체 테이블에 녹색 shadded 세포, 2/3 보충 파일) . </li><li> 각각의 건조 잎 무게 추가 열을 복제 AX-BA (보충 파일 2) 또는 AQ-AT (보조 파일 3); 대안 적으로, 단량체 단위 당 부하를 표현하는 표면 영역을 계산하고, 단량체 테이블 영역 값을 추가하기 위해 잎을 스캔표면적. </li></ol>

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이러한 DNA와 단백질 등의 생체 고분자와는 달리, 식물 지질 폴리 에스테르 템플릿에서 만든되지 않습니다. 대신, 자신의 조성물은 이러한 세포 외 중합체를 만드는 조직에 존재하는 효소의 특이성에 따라 달라집니다. 같은 화학 성분 분석으로 구성 요소는 지질 폴리 에스테르 성분을 이해하는 것이 중요하다. 에스테르 결합을 절단하는 화학적 방법은 비누화, 수소화 분해, 산 촉매 transmethylation,베이스 - 촉매 transmethylation (2)를 포함한다. 그들 각각의 장점과 단점이 있습니다. 비누화 보조 반응을받을 수있는 자유 지방산 하이드 록시 산을 생산하고 있습니다. 리튬 알루미늄 하이드 라이드와 수소화 (LiAlH 4)도 16은도 7의 cutin 분석에 사용되었다. 수소화는 알코올에 탄소수 작용을 감소시키고 구조가 원래의 알루미늄 리튬 중수소 (LiAlD 4)와 deuteriolysis 유추되어야한다. 그만큼이 방법의 단점은, 그 구조의 할당을 획득하기 위해 지방산 폴리올 deuteriation의 정도를 비교하는 사진 GC / MS의 요구 사항이다. 메탄올 불화 붕소 (BF 3)와 에스테르 교환 반응 산 촉매는 자주 각질 및 suberin depolymerizations 8,17,18에서 사용되었지만, 시약은 제한된 수명을 가지며, 반응 15 측면에 의한 인공물을 초래할 수있다. 메탄올 성 황산을 10도 다른 방법에 비하여, 단량체하지만 아마도 진정한 지질 폴리 에스테르 성분없는 2- 히드 록시 지방산의 더 큰 비율과 메틸 에스테르를 산출한다. 이 프로토콜에 설명에 NaOMe - 촉매 에스테르 교환법이 식별 특성 질량 스펙트럼을 제공 수산기의 실릴 화에 의해 유도되는 지방산 메틸 에스테르를 생성하거나 아세틸 fo를 수산기보다 안정한 유도체를 제공 할R 정량. 이 기술의 한 가지 단점은 물이 반응에 존재하는 경우, 가수 분해가 에스테르 교환 반응과 경쟁한다는 것이다. 물에 NaOMe (촉매)과 반응하여 차례로 유리 산 (도 2d)을 수득 지방산 메틸 에스테르를 가수 분해에 NaOH를 생성한다. 따라서 분석을 복잡 메틸 에스터 및 TMSI 에스테르 유도체 : 두 개의 피크는 각각 지방산 대 존재할 수 있기 때문에 바람직하지 않은 부반응이다. 무수 시약을 사용하여 비누화와 경쟁 보조 용매로서 메틸 아세테이트를 첨가 가수 분해 (도 2D)를 방지하는 것이 중요한 단계이다. 각질과 suberin 1 26 % 글리세롤 (4) 사이에 포함되어 있습니다. 그러나,이 단량체는이 프로토콜에서 설명한 실험 조건에 의해 검출되지 않을 것이다. 글리세롤은 지방산 메틸 에스테르 계 단량체와 달리, 수성 용매 세척 단계에서 제거 될 것이고, 고 친수성이고. 이러한 제한도다른 각질 해중합 방법하지만 글리세롤 pplies는 효소 방법을 사용하여 에스테르 교환 반응 후의 수층으로 결정될 수있다. 대안 적으로,이 온화한 조건을 이용하여 정량화 할 수있다 (예., 0.05 M에 NaOMe) 상기 물 추출없이 모든 단량체를 검출하는, 글리세롤 정량 목적 .Although 유용한 글리세롤 (19, 20)를 포함하여, 온화한 조건은 일반적으로 각질의 불완전한 탈 중합을주고 suberin. 불꽃 이온화 검출기 (FID)에 결합 GC 사용할 경우 대표적인 샘플의 피크는 GC / MS에 의해 식별 된 후, 모든 복제는 정량 목적이 기기에서 분석 될 수있다. 보존 지수가 공지되어있는 경우 또는, GC / FID 트레이스에 단량체가 식별 될 수있다. 불꽃 이온화 검출기가 크고 작은 샘플 성분의 정량 중요 특히 높은 감도와 비례의 넓은 범위를 갖는다단일 실행에. 또한, 강력하고 유지하며 15을 조작하기 쉽다. 설명 된 프로토콜은 하나 이상의 지질 에스테르 단량체 조성물 상이 돌연변이 화학적 특성을 허용 식물 지질 에스테르 단량체의 신뢰성 및 재현성 분리, 식별 및 정량화를 허용한다. 절차가 쉽게 뿌리, 종자, 잎, 줄기, 꽃 등 다양한 식물 재료의 작은 벌크 수량 모두를 처리하도록 구성 될 수있다, 확장 가능하다. 많은 종에서 지질 에스테르 단량체의 질량 스펙트럼 데이터는, 21-26. 예를 게시하고 다른 조직 및 / 또는 종이 프로토콜을 채택 할 때 알려지지 단량체를 식별하는 데 가치있는 자원을 구성하고있다. 이 방법은 고등 식물 지질의 생합성 에스테르, 규제, 및 분포 연구에 적용 할 수있다.

혈관 식물은 식물 조직과 외부 환경 사이의 방수 장벽으로서 기능 외 층에 의존한다. 이러한 친 유성 세포벽 - 관련 구조는 병원성 감염을 제한 및 식물 조직에서 1 가스, 물 및 용해 된 물질의 수동적 운송을 조절한다. 이러한 장벽은 표피 식물, 식물 (2) 및 다른 suberin 함유 확산 장벽 synapomorphic 독특한 구조이다. 표피는 세포벽 3-5의 외 측면에 pectinaceous 층을 통해 표피 세포에 의해 합성되고 바인드 친 유성 층이다. 이것은 식물 조직과 환경 사이의 인터페이스로서 기능하는 필수적인, 고등 식물의 주요 공중 장기를 둘러싼 다. 각질, 표피의 구조 매트릭스 및 suberin은 용매 추출 왁스 2,4과 관련이 불용성 glycerolipid 폴리 에스테르이다. 이러한 고분자 Lipids 포화 및 불포화 지방산 유도체로 이루어지는 두 구조적 및 기능적으로 유사하다된다. 그러나, 그들은 화학 조성 및 증착 사이트의 특성의 차이에 의해 구별된다. Suberin는 보조 벽을 형성하는 소정의 외부 및 내부 조직의 셀 벽 내부에있는 지방족 폴리 에스테르이다. Suberized 조직은 뿌리의 periderms, 덩이 줄기와 나무 껍질, 뿌리 endodermis, 씨앗 ​​코트 층, 치유 상처 (2)를 포함한다. 각질 달리 suberin 폴리 에스테르는 전형적으로 알콜, 포화 모노 - 불포화 된 디카 르 복실 산, 매우 장쇄 단량체의 큰 비율 (C≥20)을 포함한다. 각질 혈관 식물 6에서 가장 풍부한 지질 폴리 에스테르, 글리세린과 하이드 록시 및 하이드 록시 - 치환 된 에폭시 지방산 AS 4 C16-C18 interesterified 지방산 유도체, 구성된다. 각질 중합체 조성물 동안0, 18- 히드 록시 -9,10- 에폭시 18 : 0, 18 9,10,18 트리 히드 록시 : 0 지방산 tracheophyte 종에 걸쳐 변화가 가장 우세한 단량체는 주 16 16 히드 록시, (10)이다. 2 디카 르 복실 산 7,8 : 흥미롭게도, 애기 잎과 각질 줄기는 주로 (18)로 구성되어있다. 식물 표피는 수 마이크로 미터 (9)에 수 나노 미터에 이르기까지, 두께에 상당한 변화를 제시한다. 표피 분리는 특히 애기 장대 (8)의 것과 매우 얇은 잎 큐티클위한 수고와 시간이 많이 걸리는 공정이기 때문에, 표피 분리를 우회 방법 개발 7,8 검증되었다. 여기서, 우리는 나트륨 메톡 시드 (에 NaOMe) 해중합 촉매 반응 이후 가스 크로마토 그래피 / 질량 분석 (GC / MS)에 의해 분석 된 애기 장대 잎의 각질의 단량체 조성물을 연구하기 위해 상세한 프로토콜을 설명한다. 이 프로토콜은 공동을 분석을위한 강력한 방법을 제공한다전체 delipidated 조직에서 식물 지질 폴리 에스테르의 mposition, 그리고 이전에보고 된 프로토콜 7,10,11에서 적응하고있다. 전체 조직 샘플은 균질화 제 철저 cuticular 및 epicuticular 왁스, 멤브레인 지질 및 트리 아실 글리세롤을 포함한 용매 추출 성 지질을 제거 delipidated. 세포벽 강화 잔기는 나트륨 메톡 시드 메탄올 촉매 작용에 의해 그 구성 메틸 에스테르 단량체로 해중합된다. 지방산 메틸 에스테르 산성화에 추출하고, 해당 트리메틸 실릴 또는 아세틸 유도체를 얻기 위해 유도된다. 유도체 화 잔기는 높은 휘발성이며, GC / MS 분석에서 구조적 형태를 변경하지 않고 적절한 온도에서 기체 크로마토 그래피 칼럼으로부터 용출 될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1105">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Chemicals</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">2-propanol</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">BPA451-4</td>
			<td style="width:301px;">Solvent for delipidation</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Anhydrous sodium sulfate</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">S421500</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Acetic anhydride</td>
			<td style="width:228px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">320102</td>
			<td style="width:301px;">Derivatization agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide)</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">15222</td>
			<td style="width:301px;">Derivatization agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Butylated hydroxytoluene (BHT)</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">101162</td>
			<td style="width:301px;">Antioxidant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Calcium chloride, anhydrous</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C614-3</td>
			<td style="width:301px;">Desiccation agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Calcium suflate, anhydrous (DRIERITE- 8 MESH with indicator)</td>
			<td style="width:228px;">Acros Organics</td>
			<td>219090020</td>
			<td style="width:301px;">Desiccation agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Chloroform (Trichloromethane)</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C6074</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">BP2401212</td>
			<td style="width:301px;">Acidification agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Helium carrier gas, compressed</td>
			<td style="width:228px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:153px;">ALPHAGAZ1-UN1046</td>
			<td style="width:301px;">Carrier gas, GC/MS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Heptane</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">H3501</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Hexanes</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">H3024</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Methanol</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">A4124</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent, transmethylation reactive</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Methyl acetate</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">296996</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Methyl heptadecanoate</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H4515</td>
			<td style="width:301px;">Internal standard (1mg/mL stock)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Methylene dichloride (Dichloromethane)</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">D374</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Nitrogen, compressed</td>
			<td style="width:228px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:153px;">ALPHAGAZ1-UN1044</td>
			<td style="width:301px;">Carrier gas, GC-FID</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Pentadecanolactone</td>
			<td style="width:228px;">Fluka</td>
			<td style="width:153px;">76530</td>
			<td style="width:301px;">Internal standard (1 mg/mL stock)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Pyridine</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">270970</td>
			<td style="width:301px;">Co-solvent for derivatization</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">BP358212</td>
			<td style="width:301px;">Saline solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Sodium methoxide (25wt.%)</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">156256</td>
			<td style="width:301px;">Nucleophile</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Toluene</td>
			<td style="width:228px;">FIsher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">T2904</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Plant Growth Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:423px;">Pro-Mix PGX</td>
			<td>Premier Tech Horticulture Ltd</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;">Pro-Mix PGX is recommended to grow Arabidopsis plants (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2) 
			Purdue Methods for Arabidopsis Growth.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">PermaNest Humidity Dome&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Grower&#39;s Solution, LLC, Cookeville, TN&#160;</td>
			<td style="width:153px;">GD2211-24</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">Perma-Nest Plant Trays (22x11in)</td>
			<td style="width:228px;">Grower&#39;s Solution, LLC, Cookeville, TN&#160;</td>
			<td style="width:153px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">Square greenhouse pots, 3.5 inch&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Grower&#39;s Solution, LLC, Cookeville, TN&#160;</td>
			<td style="width:153px;">P86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">General Purpose Plant Fertilizer, Plant-Prod 20-20-20</td>
			<td style="width:228px;">Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glassware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">13 x 100 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap</td>
			<td style="width:228px;">Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td>
			<td style="width:153px;">45066A-13100</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">16 x 125 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap</td>
			<td style="width:228px;">Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td>
			<td style="width:153px;">45066A-16125</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">20 x 125 mm glass test tubes with Teflon-faced screw cap</td>
			<td style="width:228px;">Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td>
			<td style="width:153px;">45066A-20125</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">GC vial caps</td>
			<td style="width:228px;">National Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C400051A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">GC vial microinserts</td>
			<td style="width:228px;">National Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C4011631</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">GC vials</td>
			<td style="width:228px;">National Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C40001</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Disposable pasteur pipets</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">1367820B</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Flasks</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Allegra X15R centrifuge</td>
			<td style="width:228px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Analytic balance</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">Belly dancer</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;">A shaker can be used for this purpose if Belly Dancer not available</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">DB-5 Capillary GC column</td>
			<td style="width:228px;">J&#38;W Scientific, CA, USA;&#160;</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;">30 m x 0.25 mm x 0.25 &#956;m film thickness</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Desiccator</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Isotemp 202 water bath</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">ISQ LT single quadupole mass spectrometer</td>
			<td style="width:228px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Heat block</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Nitrogen evaporator</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Polytron homogenizer</td>
			<td style="width:228px;">Birkmann</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Trace 1300 gas chromatograph</td>
			<td style="width:228px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Two-stage regulator</td>
			<td style="width:228px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:153px;">Q1-318B-580</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Vacuum desiccator</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and compositional analysis of plant cuticle lipid polyester monomers

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester of glycerol and modified fatty acids that constitutes the framework of the cuticle that covers aerial plant surfaces. Suberin is a related lipid polyester that is deposited on the cell walls of certain tissues, including the root endodermis and the periderm of tubers, tree bark and roots. These lipid polymers are highly variable in composition among plant species, and often differ among tissues within a single species. Here, we describe a detailed protocol to study the monomer composition of cutin in Arabidopsis thaliana leaves by sodium methoxide (NaOMe)-catalyzed depolymerisation, derivatization, and subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. This method can be used to investigate the monomers of insoluble polyesters isolated from whole delipidated plant tissues bearing either cutin or suberin. The method can by applied not only to characterize the composition of lipid polymers in species not previously analyzed, but also as an analytical tool in forward and reverse genetic approaches to assess candidate gene function.

.이 논문에서 설명하는 프로토콜은 그림 1 비 각질 지질 (10)의 기여를 최소화, (., 각질 또는 suberin 예) 지질 폴리 에스테르 단량체를 결정하기 위해 설정 모두 8 사이의 소요 분석의 개요를 제시한다 - 10 일 (GC 데이터를 획득 초기 조직 수확에서), 건조 허용되는 시간을 샘플에 따라. 선택된 염기 - 촉매 메탄올 (그림 2) 폴리 에스테르를 해중합하는 방법은 이전에 각질과 suberin 모두 포함 애기 씨에 대해 검증 하였다. 조직이 먼저 균질화하고 철저하게 용매 추출 지질을 제거하는 delipidated된다. 추출 후 잔류 물 수익률은 초기 신선한 무게의 비율로, A의 보통 6 %입니다 장대 골-0 잎. 세포벽 강화 잔기 진공 건조기에서 건조시킨 후, 그 구성에 의해 메틸 에스테르 단량체로 해중합 아르염기 - 촉매 transmethylation. 두 시간 인큐베이션 해중합 적절한 지질 및 폴리 에스테르 성분의 회복에 필요한 중요한 시간으로 선택되었다. 긴 배양 시간은 2- 히드 록시 산의 증가 하였다; 이러한 잠재적으로 막 스핑 고리 피드 (10)에서 파생. O -TMSi 에테르 유도체 (도 3A) 및 O의 아세틸 유도체 (도 3B)에 대한 야생형 애기 장대 잎의 cutin는도 3에 도시되어있는 경우의 전형적인 크로마토 그램. 각각의 피크는 문헌 7,8 및 12 당사 비디오 프로토콜 TMSI 유도체를 제조하는 방법을 보여준다 공용 데이터베이스로부터 질량 스펙트럼 비교에 의해 식별 되었으나, 샘플은 다르게는 수산기를 유도체 화하는 아세틸 화 될 수있다. 그들이 진단 질량 스펙트럼을 제공하기 때문에 실릴 유도체 식별을 위해 좋다. 그러나, 아세틸 유도체보다 안정적이고 좋은 대안이 실릴하기한 번 단량체 (10) 확인되었다. 단지 GC 불꽃 이온화 검출기 (FID)에 접속 한 실험실에서 이러한 프로토콜을 구현하기 위해, GC / FID는 WT 리프 각질 단량체 및 지방산 메틸 에스테르를 기준 동족체 계열에 아세틸 화 유도체에 대응하는도 나타낸다 트레이스 (기업도 4). 이 방법은 정성과 샘플 사이의 양적 차이, 돌연변이 분석에 따라서 그 값을 검색합니다. 개별 단량체의 양은 샘플 사이의 단량체 풍부 비교를 가능하게 정량의 내부 표준 방법을 사용하여 결정된다. 이 피크의 크기 (총 이온 카운트) 폴리 에스테르 단량체의 몰비를 반영하지 않을 수 있음이 명확해야한다. 우리는 지방산 메틸 에스테르 유도체 및 TMSI (보조 파일 1) 또는 ACE로 애기 장대 잎의 cutin 모노머 량을 계산하는 단량체의 편집되는 테이블을 포함<html> 알코올의 TYL 유도체 (보충 파일 2). 이 테이블은 샘플이 다른 기관 또는 식물 종에서 추출하는 경우 적용 할 필요가있다. 예를 들어, 우리가 분석 한 애기 장대 탈리아 NA 컬럼비아 (골-0) 야생형 잎과 CYP86A2 / ATT1 유전자, att1-1 (M-1)과 att1-2의 두 이전에 특성화 된 널 돌연변이 대립 유전자 (M-2 ) (13, 14). CYP86A 아과의 시토크롬 P450 모노 옥 시게나 제는 추정 ω-oxydases를 인코딩 및 suberin과 각질 단량체 생합성에 참여한다. 우리의 결과 (그림 4) (WT) 잎에 비해 돌연변이 잎에 세 가지 주요 지질 단량체의 부하에 상당한 감소를 보여줍니다. 0, 18 : 2, 18 : 효소의 예측 기능, 16 일치 1 디카 르 복실은 특히 att1 돌연변이에 영향을 받았다. &quot;SRC =&quot;/ 파일 / ftp_upload / 53386 / 53386fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 지질 폴리 에스테르 분석 1. 개요. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig2.jpg" /> 도에 NaOMe - 촉매 transmethylation 반응 2. 메커니즘. 핵성 메톡 음이온 용이 지방산 메틸 에스테르 및 알콕시 드 음이온 (B)로 해리 불안정한 사면체 중간체 (A)를 형성하는 지질 폴리 에스테르 cabonyl 탄소를 공격한다. 이 알콕사이드는 공액 염기이며, 이에 추가 해중합 반응 (C)를 ​​유지하는, 촉매 활성 메톡 음이온 재생 메탄올로 반응한다. 물이 존재하면시스템은, 그것은 수산화 나트륨, 비가 역적으로 바람직하지 않은 유리 지방산을 생성하는 에스테르를 가수 분해 강염기를 형성하기 위해 나트륨 메톡 시드와 반응한다. 메틸 아세테이트. 시스템 (D) 내에서 수산화 나트륨의 적은 양을 제거하기 위해 공동 용매 (15)으로 추가됩니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig3.jpg" /> 그림 3. 야생형 애기 장대의 잎 각질 모노머의 대표적인 총 이온 크로마토 그램. (A) O -trimethylsilyl (TMSI) 에테르와 (B) 아세테이트 하이드 록시 유도체 등을들 수있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> </&gt; <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig4.jpg" /> 도 애기 장대 WT 4. 각질 단량체 조성물과 CYP86A2 유전자의 두 널 돌연변이 대립 유전자. (돌연변이-1 = att1-1; 돌연변이 -2- = att1-2) 오차 막대는 (N = 4)의 평균의 표준 편차를 나타내는 . © 블랙웰 출판 (2007)의 허가, 13에서 적응. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig1.jpg" /> GC / MS 소프트웨어에서 보충 그림 1. 피크 통합 결과 테이블. 확인 단량체 및 내부 기준에 해당하는 봉우리는 retenti에 의해 식별된다<html> 시간 (열 C) 및 면적 값이 열에 표로에 디는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_1.tif" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig2.jpg" /> 애기 장대 각질 단량체 (하이드 록시 지방산 메틸 에스테르의 트리메틸 실릴 에테르 유도체)의 보충 파일 2. 표. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_File_2_Cutin_template_TMSi.xls" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig3.jpg" /> 애기 각질 단량체 (하이드 록시 지방산 메틸 에스테르의 O의 아세틸 유도체)의 기업 파일 3. 표.COM / 파일 / ftp_upload / 53386 / Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivati​​ves.xlsx &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig4.jpg" /> 기업도 4 GC / FID의 트레이스 (AB) 지방산 메틸 에스테르 (FAME) 보유 지수는 표준 (피크는 각각 포화 FAME 사슬 길이로 표지된다); 및 (C)는 (A)를 아세틸 장대 중량 잎 각질 단량체. 16 : 0 FAME (1), ferulate (2), 18 : 3 FAME (3), 18 : 1/18 : 2 FAMES (4), 18 (5), sinapate 0 FAME (6 피크 숫자에 해당합니다 ), 16 : 0 DCA (7), 16-OH 16 : 0 FAME (8), 18 : 2 DCA (9), 18 : 1 DCA (10) 18 : 0 DCA (11), 18-OH 18 : 2 명성 (12), 18-OH 18 : 1 FAME (13), 20 : 0 FAME (14), 10,16 - 디 하이드 록시 16 : 0 FAME (15), 24 : 0 FAME (16). DCA : 다이 카복실산 다이 메틸 에스터; FAME : 지방산 메틸 에스터; IS1 : 내부 표준 1, 17 : 0 명성; IS2 : 내부 세인트andard 2, 15-OH 15 : 0 FAME. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_4.tif" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.

식물 표피 지질 폴리 에스테르 단량체의 분리 및 성분 분석

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.6K 조회수.  Algoma University. Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.

비디오: Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Use of Arabidopsis eceriferum Mutants to Explore Plant Cuticle Biosynthesis

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms.  The cuticle is made up of a tough crosslinked polymer called "cutin" and a protective wax layer that seals the plant surface.  The waxy layer of the cuticle is obvious on many plants, appearing as a shiny film on the ivy leaf or as a dusty outer covering on the surface of a grape or a cabbage leaf thanks to light scattering crystals present in the wax.  Because the cuticle is an essential adaptation of plants to a terrestrial environment, understanding the genes involved in plant cuticle formation has applications in both agriculture and forestry. Today, we'll show the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.


The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms. In this video, we demonstrate the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.

식물 표피의 생합성을 탐구 Arabidopsis eceriferum 돌연변이의 이용

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of ...

연구

생물학

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and genetics because of its simple life cycle, ease of growth and manipulation for genetic analysis, genomic resources, and transformability of the nucleus and both organelles. Mating strains is a common practice when genetic approaches are used in Chlamydomonass, to create vegetative diploids for analysis of dominance, or following tetrad dissection to ascertain nuclear vs. organellar inheritance, to test allelism, to analyze epistasy, or to generate populations for the purpose of map-based cloning. Additionally, genetic crosses are routinely used to combine organellar genotypes with particular nuclear genotypes. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad separation. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas. Key parameters and trouble spots are explained. Finally, resources for further information and alternative methods are provided.

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and tetrad separation are required for genetic analysis in Chlamydomonas reinhardtii. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad dissection. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas.

번식과 Tetrad 분리 Chlamydomonas reinhardtii 유전자 분석을위한

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation1 and other products such as biocomposite materials7. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses (matrix polysaccharides, and the polyphenol lignin6 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls provide tensile strength to cells and the entire plants, ward off pathogens, and allow water to be transported throughout the plant; in the case of trees up to more the 100 m above ground level. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerization by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis. In this first part we focus on the analysis of the polyphenol lignin (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its lignin content by acetylbromide solubilization3, and its lignin composition in terms of its syringyl, guaiacyl- and p-hydroxyphenyl units5. The protocol for analyzing the carbohydrates in lignocellulosic biomass including cellulose content and matrix polysaccharide composition is discussed in Part II2.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of the polyphenolic lignin.

식물 세포 벽의 종합 작곡 분석 (리그노셀룰로오스성 바이오 매스) 부 I : 리그닌

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation2 and other products such as biocomposite materials6. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses, and the polyphenol lignin5 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls contribute extensively to the strength and structural integrity of the entire plant. Despite its necessary rigidity, the cell wall is a highly dynamic entity that is metabolically active and plays crucial roles in numerous cell activities such as plant growth and differentiation5. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerisation by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its monosaccharide composition of the hemicelluloses and other matrix polysaccharides1, and its content of crystalline cellulose7. The protocol for analyzing the lignin components in lignocellulosic biomass is discussed in Part I3.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of wall derived carbohydrates.

식물 세포 벽의 종합 작곡 분석 (리그노셀룰로오스성 바이오 매스) 2 부 : 탄수화물

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

에서 초기 단계의 배아의 효율적이고 신속한 분리<em&gt; 애기 장대</em&gt; 씨앗

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

비교 단백체 분석을위한 신진 대사 라벨링 및 막 분별<em&gt; 애기 장대</em&gt; 서스펜션 세포 배양

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

multiprotein의 단지의 비교 분석을위한 새로운 접근 방식을 기반으로<sup&gt; 15</sup&gt; N 대사 라벨링 및 정량 질량 분석

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

마우스 심근의 분리 및 생리 학적 분석

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

Explanted 망막 조직 세포 외 유출 분석을 사용 하 여 신진 대사 에너지의 측정

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral lipids encased by a monolayer of phospholipids and proteins. Hepatic LD lipids, such as ceramides, and proteins are implicated in several diseases that cause hepatic steatosis. Although previous methods have been established for LD isolation, they require a time-consuming preparation of reagents and are not designed for the isolation of multiple subcellular compartments. We sought to establish a new protocol to enable the isolation of LDs, endoplasmic reticulum (ER), and lysosomes from a single mouse liver.
Further, all reagents used in the protocol presented here are commercially available and require minimal reagent preparation without sacrificing LD purity. Here we present data comparing this new protocol to a standard sucrose gradient protocol, demonstrating comparable purity, morphology, and yield. Additionally, we can isolate ER and lysosomes using the same sample, providing detailed insight into the formation and intracellular flux of lipids and their associated proteins.

This protocol establishes a novel method of lipid droplet isolation and purification from mouse livers, using a well-established endoplasmic reticulum isolation kit.

음 세포 기관이 격리 키트를 사용 하 여 급속 한 지질 작은 물방울 격리 프로토콜

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...