먼저 0.01%디지토닌이 함유된 얼음처럼 차가운 핵 용해 완충액 2밀리리터를 유리 Dounce에 채우고 절개된 쥐 뇌 조직 조각을 추가합니다. 유리 Dounce 조직 균질화기를 사용하여 유봉 A와 B로 조직을 각각 25회 균질화하고 생성된 균질화를 15밀리리터 튜브로 옮깁니다. 0.01%디지토닌을 함유한 얼음처럼 차가운 핵 용해 완충액 2mL를 균질액에 넣고 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다.
그런 다음 섭씨 4도에서 5분 동안 500G의 핵을 원심분리합니다. 마이크로피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 0.01%디지토닌을 함유한 얼음처럼 차가운 핵 용해 완충액 4밀리리터를 추가합니다. 40마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 핵 현탁액을 여과합니다.
핵을 다시 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 4밀리리터의 염색 완충액을 첨가하여 핵을 세척합니다. 40마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 현탁액을 여과한 후, 원심분리를 통해 핵을 펠트하고 0.04% BSA 및 RNase 억제제를 함유한 PBS 1밀리리터에 핵을 재현탁시킵니다. 세포를 계산하려면 0.5밀리리터 튜브에 10마이크로리터의 0.4%트리판 블루와 10마이크로리터의 핵을 혼합합니다.
자동 세포 계수기를 사용하여 핵을 계수합니다. 염색되지 않은 대조군을 위해 100 마이크로리터의 핵을 FACS 튜브로 옮깁니다. 남은 핵에 7-AAD 10마이크로리터를 넣고 섭씨 4도에서 5분간 배양한 후 FACS를 이용한 핵 분류를 진행한다.
그런 다음 분류된 핵 10마이크로리터를 2% 열 비활성화 FBS가 있는 90마이크로리터의 DPBS가 포함된 새 FACS 튜브로 옮깁니다. 분류된 핵을 원심분리한 후 마이크로피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 100마이크로리터의 희석된 핵 완충액에 핵을 재현탁시킵니다. 분류하기 전에 샘플에는 핵 염색에 양성 반응이 99% 이상인 상당한 파편이 포함되어 있어 효과적인 세포 용해를 나타냅니다.
분류 후 뇌핵은 순도가 초기 36%에서 거의 100%로 증가한 것으로 나타났습니다.
