시작하려면 쥐의 골수 조혈 줄기 및 전구 세포가 들어 있는 바이알을 복용합니다. 마이크로피펫을 사용하여 펠릿을 1mL의 ACK 용해 완충액에 재현탁시키고 실온에서 1-2분 동안 배양합니다. 재현탁 혼합물을 사전 습윤된 70마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 50mL 튜브로 옮깁니다.
그런 다음 10ml의 FACS 버퍼를 추가하여 ACK 용해 버퍼를 희석합니다. 혼합물을 섭씨 4도에서 5분 동안 400G로 원심분리하고 먼저 1밀리리터의 완충액에 다시 현탁시킨 다음 9밀리리터의 완충액을 보충하여 펠릿을 10밀리리터의 FACS 완충액에 재현탁시킵니다. 이제 0.5 밀리리터 튜브에 10 마이크로 리터의 0.4 % 트리판 블루와 10 마이크로 리터의 세포를 혼합하고 자동 세포 카운터를 사용하여 세포를 계수합니다.
세포를 염색하려면 400G에서 섭씨 4도에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 펠릿을 FACS 완충액에 재현탁시켜 먼저 1밀리리터의 완충액에 펠릿을 재현탁시킨 다음 나머지 부피를 보충하여 밀리리터당 7개 셀에 10배의 최종 농도를 달성합니다. P1000 마이크로피펫을 사용하여 35마이크로미터 셀 스트레이너 캡을 통해 현탁액을 FACS 튜브로 옮깁니다.
다음으로, 여기에 표시된 대로 염색 혼합물을 준비합니다. 원심분리 후 세포 현탁액을 300 마이크로리터의 염색 혼합물에 다시 현탁시키고 샘플 튜브에 하나를 혼합하고 빛으로부터 보호된 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 300 마이크로리터의 혼합물 2를 샘플 튜브에 넣고 빛으로부터 보호된 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다.
3mL의 FACS 완충액을 단일 염색 및 혼합 염색 시료 튜브에 추가합니다. 이제 셀 현탁액을 원심분리합니다. 상층액을 버린 후 펠릿을 FACS 완충액 500마이크로리터에 재현탁시킵니다.
1.5마이크로리터의 수집 매체로 미리 채워진 500밀리리터 튜브를 준비합니다. FACS 기기가 보정되면 500마이크로리터의 FACS 버퍼를 셀 현탁액에 추가한 다음 1밀리리터의 샘플을 35마이크로미터 셀 스트레이너 캡을 통해 새 FACS 튜브로 옮깁니다. 세포 분류 후 분류된 세포 10마이크로리터를 90마이크로리터의 FACS 완충액이 들어 있는 새 FACS 튜브로 옮깁니다.
원심분리에 의해 세포 현탁액을 펠릿화하고 0.04%BSA를 가진 PBS의 50 마이크로리터에서 재현탁하십시오. 현탁액을 0.2밀리리터 튜브로 옮기고 BSA가 포함된 PBS 50마이크로리터를 원래 튜브에 추가하여 남은 세포를 수집합니다. 세포를 0.2밀리리터 튜브로 옮겨 총 부피 100마이크로리터에 도달합니다.
파일럿 실험을 실행하여 핵 분리를 위한 최적의 용해 시간을 식별합니다. 핵을 펠릿화한 후, 핵 펠릿을 12마이크로리터의 희석된 핵 완충액에 재현탁시킵니다. 0.4%trypan blue와 0.04%BSA가 함유된 PBS 8마이크로리터가 포함된 튜브에 2마이크로리터의 핵을 추가하고 자동 세포 계수기를 사용하여 핵을 계수합니다.
핵 분리를 완료한 후 6마이크로리터의 핵 재부유를 150마이크로리터의 FACS 완충액으로 미리 채워진 새 FACS 튜브로 옮깁니다. 7-AAD 3마이크로리터를 넣고 얼음 위에서 5분간 배양합니다.
