Ana Jeemin Choi는 파스퇴르 파리 대학교(PPU) 국제 박사 프로그램의 급여를 지원받았습니다.

Multiome 10X 유전체학 분석을 위한 고품질 시료 전처리

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고품질 세포 또는 핵 현탁액의 준비는 단일 세포 또는 단일 핵 RNA-Seq 및 단일 세포 다중 오믹 분석의 성공에 매우 중요합니다 29,30,31. 여기에서는 뇌와 골수라는 두 가지 유형의 조직에서 다중종 분석을 위한 샘플 준비 및 핵 분리를 위한 프로토콜을 설명했습니다.
이 논문에 기술된 뇌 프로토콜은 갓 얼어붙은 뇌 조직에서 고품질 핵을 회수할 수 있게 해줍니다. 여기에는 동결 조직 파괴, 핵 분리, 핵 정제 및 준비된 물질의 품질 관리 단계가 포함됩니다. 뇌 조직은 다양한 세포 유형으로 구성되어 있으며, 조직 해리 및 핵 분리 절차는 초기 조직에 존재하는 세포 집단의 비율을 보존해야 합니다. 여기서, 용해 완충액 조성 및 배양 시간은 조직을 구성하는 모든 세포 집단의 완전하고 부드러운 용해가 가능하도록 최적화되었습니다.
골수 HSPC 프로토콜은 이질적인 세포 현탁액에서 관심 세포 집단을 분리하기 위해 실험 시작 시 한 가지 추가 단계가 필요하기 때문에 다소 다릅니다. 신선한 조직을 채취한 후 적혈구를 용해하고 관심 세포 하위 집합에 대해 샘플을 농축합니다. 표적 세포를 용해하고, 핵을 분리하고, 준비된 물질의 품질을 제어합니다.
10X Genomics는 다양한 조직에서 핵 분리를 위해 검증된 여러 프로토콜을 제공합니다32,33. 이 회사는 또한 검증된 조직으로부터 핵을 분리하기 위한 간단한 파이프라인을 갖춘 핵 분리 키트를 상용화한다34. 그러나 이러한 프로토콜은 특정 샘플의 특성을 조정하기 위해 추가 최적화가 필요합니다. 예를 들어 낮은 셀 입력으로 작업해야 하는 샘플이 있습니다. 이러한 샘플의 경우 가장 어려운 단계는 샘플을 세척할 수 있을 만큼 엄격하고 세포/핵 손실을 방지할 수 있을 만큼 부드러워야 하는 원심분리입니다. 여기에 설명된 프로토콜을 통해 당사는 이 두 가지 요구 사항 간의 미세한 균형을 찾기 위해 단일 세포 멀티옴 ATAC + GEX 염기서열분석(CG000365 - Rev C)27을 위한 10X Genomics Proven Protocol - Nuclei Isolation을 채택했습니다. 분류된 HSPC에서 핵을 준비하는 예에서 입증된 바와 같이, 당사는 샘플의 품질에 영향을 미치지 않으면서 핵 회수율을 개선했습니다.
또 다른 과제는 핵 분리를 위해 정제된 세포를 용해하는 단계입니다. 더 가혹한 용해 조건과 더 긴 배양 시간은 핵을 손상시켜 염기서열분석 데이터의 품질에 영향을 미칠 수 있습니다. 그림 5 는 용해 완충액을 사용한 다양한 배양 시간에 골수 샘플의 대표적인 핵 이미징을 보여주며 세포 용해에 따라 핵의 상태가 얼마나 다를 수 있는지 보여줍니다. HSPC의 예에서, 우리는 3분 용해가 건강해 보이는 온전한 핵의 비율이 가장 높고 손상된 핵의 비율이 가장 낮은 조건으로 식별되었습니다. 용해 배양 시간은 각각의 새로운 유형의 시료에 맞게 최적화되어야 합니다.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig05.jpg"> 그림 5: 현미경에 의한 핵 품질 관리. (A)는 온전하고 (B)는 손상된 핵이 있는 쥐 골수에서 분리된 핵의 대표적인 명시야 이미지입니다. 눈금 막대 5 μm. 이미지는 40x ELWD NA 0.60 대물렌즈와 1.5x 디지털 줌을 사용하여 도립 현미경으로 촬영했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
이 연구에서 자세히 설명된 두 프로토콜 모두 고처리량 FACS 기기로 표적 세포 또는 핵을 정제하는 데 의존합니다. 이 단계는 세포의 희귀 하위 집합이 이종 현탁액에서 분리되어야 하는 단일 세포/핵 준비 프로토콜에 매우 중요합니다. HSPC 분류를 위해 여기에 표시된 예에서와 같이 이러한 경우, 관심 세포 집단에서 "게이팅"을 활성화하기 위해 고차원 유세포 분석 패널이 필요할 수 있습니다. 분류는 매우 빠르고 정확하여 분류된 세포 subset의 순도가 95% 이상입니다. 이 접근법은 세포 현탁액을 최대 70psi의 압력에 노출시키며, 따라서 세포막의 파열을 유발할 수 있기 때문에 깨지기 쉬운 세포(예: 수지상 세포, 호중구)의 분류에 제한될 수 있습니다. 이러한 경우 자기 분류, 차세대 기기(예: CellenOne, Cellenion; MACSQuant Tyto, Miltenyi)35,36 또는 액적 기반 시스템(예: ODIN, Sensific)37. 그럼에도 불구하고, 몇 분이 아닌 몇 시간 동안 지속되는 세포 분류와 함께 이러한 기술의 느린 분류 속도는 Multiome 및 큰 세포 수 분석을 기반으로 하는 기타 단일 세포 응용 분야를 위한 생존 가능한 세포 준비에 이러한 접근 방식을 적용하는 데 있어 강력한 제한 요소입니다.
조직에서 분리된 핵의 정제를 위해 FACS는 처리량과 분리된 물질의 순도로 인해 선택되는 방법입니다. 핵은 압력에 민감하지 않으며, 여과된 조직 분리물은 세포 분류기를 통해 쉽게 정제할 수 있습니다. 실험실에 FACS 기기가 장착되어 있지 않은 경우 효율성은 다소 떨어지지만 충분히 좋은 다른 대안이 있습니다. 예를 들어 초원심분리 또는 음파를 사용하여 크기 차이에 따라 입자를 분리하는 MARS(Applied Cell)와 같은 소형 장비의 사용이 있습니다. 세포/핵 현탁액의 소수성 특성을 사용하는 CURIOX 층류 와셔; 또는 세포의 물리적 특성(공중 부양)에 의존하여 파편에서 세포를 분리하는 LEVITAS bio.
여기에서는 다운스트림 Multiome 프로토콜에 대해 많은 수의 핵과 최상의 순도를 얻기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. FACS 분류 및 반복적인 원심분리 단계는 초기 물질의 상당한 손실을 초래합니다. 이러한 이유로, 우리가 여기에 기술하는 뇌로부터의 핵 준비를 위한 프로토콜에서, FACS 분류 후 적어도 500,000개의 핵의 수집을 초래하기 위해 충분히 풍부한 출발 물질이 필요하다. 이 기준이 일치하지 않는 경우 대체 프로토콜을 적용해야 합니다. 희귀 세포 집단 또는 작은 조직 절편으로 작업할 때 사용 가능한 초기 물질의 양이 제한 요인이 될 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 (a) 용해량을 줄이고, (b) 세척량을 줄이고, (c) 원심분리 시간이 연장된 단일 세척을 사용하여 낮은 세포 입력 핵 분리를 위한 10X Genomics 프로토콜에 표시된 대로 회수율을 개선함으로써 핵 회수를 개선할 수 있습니다. 저함량 물질의 멀티오믹 분석의 경우, 훨씬 적은 수의 입력 샘플이 필요한 scNMT, SNARE-seq 및 Paired-seq38 과 같은 플레이트 기반 애플리케이션을 고려하는 것이 좋습니다.
요약하면, 다운스트림 멀티옴 분석을 위해 뇌와 골수 HSPC에서 핵을 준비하기 위한 두 가지 강력한 프로토콜에 대해 설명했습니다. 이러한 프로토콜은 제기된 과학적 질문에 관계없이 이 두 가지 유형의 조직에서 고품질 단일 핵 현탁액을 필요로 하는 모든 과학 프로젝트에 적용할 수 있습니다. 우리 그룹은 다양한 표적 유전자의 비활성화에 따른 뇌 발달 연구와 신경 질환의 맥락에서 면역 반응 연구에 뇌핵 분리 프로토콜을 적용해 왔습니다. 우리는 면역 체계 구축에 다양한 조혈 하위 집단의 참여를 해독하기 위해 골수 핵 분리 프로토콜을 사용하고 있습니다.

수년 동안 단일 세포 기술은 생물학적 과정 분석의 황금 표준이었습니다. 처음에는 현미경, 유세포 분석 및 유사한 분석을 통한 단일 세포 표현형으로 제한되었습니다. 단일 세포 분석의 돌파구는 단일 세포 분자 프로파일링, 특히 개별 세포의 전체 전사체를 특성화할 수 있는 단일 세포 RNA 염기서열 분석(scRNA-Seq)을 위한 접근 방식의 개발과 함께 이루어졌습니다. 매우 강력한 scRNA-Seq는 특정 조건 및 시점에서 세포의 전사 상태에 대한 정보를 생성합니다. 그러나 전사를 유도하는 유전자 조절이나 시간이 지남에 따라 발생하는 분자 변형에 대한 가시성은 제공하지 않습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 동일한 세포 1,2,3,4에서 여러 요인과 과정을 분석할 수 있는 단일 세포 다중 오믹스 분석법 개발에 많은 노력을 기울였습니다. 단일 세포 내에서 두 가지 양식에 대한 최초의 성공적인 측정은 CITE-Seq 접근법5에서 다중 표면 단백질 발현 패턴을 개별 세포의 전체 전사체와 연결하는 것을 통해 이루어졌습니다. 보다 최근의 진화는 유전자 발현과 염색질 접근성(염기서열분석을 사용한 Transposase-Accessible Chromatin 분석, ATAC-Seq)을 결합하여 동일한 세포(예: sci-CAR)에서 전사체 및 후성유전체 양식을 동시에 포착합니다6. 전사체학을 세포 표현형 또는 동일한 세포의 후성유전학적 변화와 연관시킬 수 있는 최초의 상용 솔루션은 10X Genomics에서 나왔습니다.
단세포 분자 프로파일링을 위한 실험은 다음 단계를 포함한다: (1) 단세포 현탁액의 조직 해리 또는 준비; (2) 세포 정제 및/또는 핵 분리; (3) 분할 및 바코드; (4) 도서관 건설 및 품질 관리; (5) 차세대 염기서열분석; (6) 데이터 분석. 단계 (3)-(6)은 사용된 기술에 따라 크게 다를 수 있지만 초기 단계는 일반적으로 모든 기술에 공통적입니다. 준비된 세포/핵 현탁액의 품질은 실험의 전반적인 결과를 결정합니다. 조직의 유형에 따라 고품질 단세포/핵 현탁액을 얻는 것이 어려울 수 있습니다. 심장, 근육, 뇌, 폐, 장 등과 같은 일부 조직의 특이성으로 인해 분자 분석을 위한 고품질 핵 생성을 보장하기 위해 각 유형의 시료에 적합한 조직 파괴 및 핵 분리 방법이 필요합니다 7,8,9,10 . 조직 파괴 방법 및 해리 프로토콜은 기계적, 효소적(예: 콜라겐 분해 효소와 DNase의 혼합) 또는 이 둘의 조합일 수 있으며 수동으로 또는 기기(예: Qiagen DSC-400, gentleMACS)로 수행할 수 있습니다.
단세포 기술은 생물의학 연구를 위한 선택 도구가 되었습니다. 신경생물학에서 뇌의 세포 다양성과 기능의 복잡성은 희귀 세포 집단의 시각화와 이질성을 평가하기 위해 고해상도 및 고처리량 분석을 필요로 합니다 11,12,13,14. 개별 세포의 세포 정체성과 유전자 조절 메커니즘을 연결하면 뇌 발달 및 생리학에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 또 다른 예는 단일 세포 분석에 크게 의존하는 감염성, 자가면역 또는 암 질환의 맥락에서 면역 반응에 대한 연구입니다. 면역 세포 subset의 이질성과 그 활성의 복잡성 및 다른 세포 유형과의 상호 작용으로 인해 면역 반응의 기전을 해독하기 위해서는 단일 세포 분해능이 필요합니다. 면역 세포는 골수에서 유래하며, 조혈 전구 세포는 골수를 벗어나 말초의 집으로 이동하기 전에 단계적 과정을 통해 세포 표면 마커를 획득하고 잃는 점진적인 분화 세포로 구성됩니다. 단일 세포 분석을 통해 세포 발달 단계의 미세한 특성 분석이 가능합니다. 이는 단일 세포 표현형을 통해 달성할 수 있으며, 일반적으로 다중 파라미터 유세포 분석으로 수행됩니다. 그러나, 단일세포 전사체 서명은 전구세포 아형의 보다 정확한 식별을 나타내는 것으로 나타났는데, 이는 이들 세포가 서로 떨어지는 클러스터로 분포되어 있기 때문에 거친 세포 표면 마커 접근법15을 사용할 때 오식별될 수 있기 때문입니다. 점점 더 많은 연구에서 조혈모세포와 전구세포(HSPC)가 다양한 약제에 노출되어 면역체계의 장기적 반응성에 상당한 영향을 미칠 수 있는 후성유전학적 변형이 밝혀지고 있습니다 16,17,18,19. 새로운 다중 오믹스 기술을 통해 단일 세포 분해능으로 이러한 프로세스를 연구할 수 있습니다.
세포 및 핵 분리를 위한 많은 프로토콜이 뇌(11,20,21,22) 및 골수 샘플(23,24)에 대해 기술되어 있다. 실험적 변동성으로 인한 편향을 최소화하려면 공동 단세포 전사체 및 후성유전체 염기서열분석을 위해 최적화된 단핵항체 전처리 프로토콜을 검증하여 단세포 다중생물 분석의 재현성을 보장해야 합니다.
여기에서는 다운스트림 단일 세포 멀티옴 분석을 위한 (1) 신선 냉동 뇌 조직 및 (2) 신선 골수 HSPC에서 핵 준비를 위한 두 가지 강력한 프로토콜이 설명되어 있습니다(그림 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig01.jpg"> 그림 1: 신선 냉동 뇌 및 골수 조직에서 핵 분리를 위한 프로토콜의 개략도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 G x 1 &#189; (1.2 mm x 38 mm) Agani needles</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>AN*1838S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round bottom FACS tube with cell strainer cap 35 &#181;m</td>
			<td>falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD</td>
			<td>BD pharmagen</td>
			<td>559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD117 (c-Kit)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105812</td>
			<td>Clone: 2B8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine 7 anti-mouse CD16/32 (Fc&#947;R)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101328</td>
			<td>Clone: 93</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>non-applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Software v8.0.1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>non-applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin&#160; stock solution 10%</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell staining buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Suprplan Fluor ELWD 40XC ON 0.6</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>non-applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS camera Prime 95B 25 mm</td>
			<td>Photometrix</td>
			<td>non-applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counting chamber slide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 24 mm x 24 mm 0.13-0.17 mm</td>
			<td>Brand</td>
			<td>BR470819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonine 5%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>BN2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels&#160;</td>
			<td>Swann-Morton&#160;</td>
			<td>0508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x) + GlutaMAX-I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200-067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence inverted microscope Nikon Ti2 -E</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>non-applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30123603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83801.290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD34</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11-0341-85</td>
			<td>Clone: RAM34</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps for dissection</td>
			<td>FST</td>
			<td>11152-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11533387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Homogeniser 2 mL</td>
			<td>Bellco glass</td>
			<td>1984-10002</td>
			<td>Pestle &#8220;A&#8221; Large Clearance: .0030-.0050&#8243; and Pestle &#8220;B&#8221; Small Clearance: .0005-.0025&#8243;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD fixable aqua dead cell stain kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution 1 M</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium Fluoromount-G&#160;</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40 substitute</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei buffer 20x&#160;</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>2000153/2000207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei isolation kit EZ prep</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>NUC-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneComp eBeads compensation beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>01-1111-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse lineage cocktail 
			(including anti-mouse CD3, Ly-6G/Ly-6C, CD11b, CD45R/B220, TER-119)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>133310</td>
			<td>Clones (in the same order as the antibodies listed): 17A2, RB6-8C5, M1/70, RA3-6B2, Ter-119</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Tube Strips 0.2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>122507</td>
			<td>Clone: E13-161.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm x 20 mm OPTILUX</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ply-L-lysine 0.01% sterile-filtered suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Printed microscope slides 8 well 6 mm numbered</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>ER-301B-CE24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rnase inhibitor 5000 U</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors for dissection</td>
			<td>FST</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride solution 5 M</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>59222C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters, PES, 0.2 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15206869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent nail polish&#160;</td>
			<td>any</td>
			<td>non-applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Hydrochloride solution pH 7.4</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>T2194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4%</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Biorad&#160;</td>
			<td>1662404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilated Water Dnase/Rnase Free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-quality brain and bone marrow nuclei preparation for single nuclei multiome assays

단일 세포 분석은 단일 세포 분해능으로 치료 또는 감염에 대한 개별 세포 반응의 가변성을 평가해야 하는 생물학적 과정의 복잡성을 밝히기 위해 선택되는 접근 방식이 되었습니다. 
지난 10년 동안 단세포 분자 프로파일링을 위한 많은 기술이 개발되었으며 여러 전용 기술이 상용화되었습니다. 10X Genomics 액적 기반 단일 세포 프로파일링은 전사체 및 다중 오믹 단일 세포 프로파일링에 즉시 사용할 수 있는 시약을 제공하는 광범위한 기술입니다. 이 기술에는 단일 세포 및 단일 핵 RNA 염기서열 분석(각각 scRNA-Seq 및 snRNA-Seq), scATAC-Seq, 단일 세포 면역 프로파일링(BCR/TCR 염기서열 분석) 및 멀티옴을 위한 워크플로우가 포함됩니다. 후자는 동일한 세포에서 나오는 전사 정보(scRNA-Seq)와 후성유전학적 정보(scATAC-Seq)를 결합합니다. 
조직에서 분리되고 이러한 접근 방식으로 분석되는 단일 세포 또는 단일 핵 현탁액의 품질(생존력, 무결성, 순도)은 고품질 데이터를 생성하는 데 매우 중요합니다. 따라서 시료 전처리 프로토콜은 각 생물학적 조직의 특성에 맞게 조정되어야 하며 고품질 세포 및 핵 현탁액의 생성을 보장해야 합니다.
이 기사에서는 다운스트림 멀티오메 10X 유전체학 파이프라인을 위한 뇌 및 골수 샘플을 준비하기 위한 두 가지 프로토콜에 대해 설명합니다. 프로토콜은 단계적으로 수행되며 조직 해리, 세포 분류, 핵 분리 및 세포 분할 및 바코드, 라이브러리 준비 및 염기서열분석을 위한 출발 물질로 사용되는 준비된 핵 현탁액의 품질 관리를 다룹니다. 이러한 표준화된 프로토콜은 고품질 핵 라이브러리와 강력하고 신뢰할 수 있는 데이터를 생성합니다.

For many years, single-cell techniques have been the gold standard for the analysis of biological processes. They were initially restricted to single-cell phenotyping through microscopy, flow cytometry, and similar assays. A breakthrough in single-cell analysis came with the development of approaches for single-cell molecular profiling, in particular single-cell RNA sequencing (scRNA-Seq) that enabled characterizing the entire transcriptome of individual cells. Highly powerful, scRNA-Seq generates information about the transcriptional status of a cell in a specific condition and time point. However, it does not provide visibility on the gene regulation that drives transcription, or on the molecular modifications that occur over time. To overcome this limitation, many efforts have been invested in the development of single-cell multi-omics assays that enable the analysis of multiple factors and processes from the same cell1,2,3,4. The first successful measurement of two modalities within single cells came through linking multiplex surface protein expression patterns with the full transcriptome of individual cells in the CITE-Seq approach5. More recent evolutions combine gene expression with chromatin accessibility (Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing, ATAC-Seq), thereby simultaneously capturing transcriptomic and epigenomic modalities in the same cells (e.g., sci-CAR)6. The first commercial solutions that allowed associating transcriptomics with cell phenotype or with epigenetic changes of the same cell came from 10X Genomics.
Experiments for single-cell molecular profiling contain the following steps: (1) tissue dissociation or preparation of single-cell suspensions; (2) cell purification and/or nuclei isolation; (3) partitioning and barcoding; (4) library construction and quality control; (5) next-generation sequencing; (6) data analysis. While steps (3)-(6) may significantly vary depending on the technology employed, the initial steps are generally common to all of them. The quality of the prepared cell/nuclei suspension will determine the overall outcome of the experiment. Depending on the type of tissue, obtaining high-quality single-cell/nuclei suspensions may be challenging. The particularities of some tissues, such as the heart, the muscle, the brain, the lung, the intestine, and others, require methods for tissue disruption and nuclei isolation adapted to each type of sample in order to guarantee the production of high-quality nuclei for molecular analysis7,8,9,10. The tissue disruption methods and dissociation protocols can be mechanical, enzymatic (e.g., a mix of collagenases and DNase), or a combination of the two, and can be performed manually or by instruments (e.g., Qiagen DSC-400, gentleMACS).
Single-cell techniques have become a tool of choice for biomedical research. In neurobiology, the cell diversity in the brain and the complexity of their functions require high-resolution and high-throughput analysis for visualization of rare cell populations and for assessing their heterogeneity11,12,13,14. Linking cellular identity and gene regulatory mechanisms of individual cells provides insights into brain development and physiology. Another example is studies of immune response in the context of infectious, autoimmune, or cancer diseases, which strongly rely on single-cell analyses. The heterogeneity of immune cell subsets and the complexity of their activity and interactions with other cell types require single-cell resolution in deciphering the mechanisms underlying immune response. The immune cells originate from the bone marrow, where hematopoietic progenitors are composed of gradually differentiating cells that acquire and lose cell surface markers throughout a stepwise process prior to exiting the bone marrow to home in the periphery. Single-cell analysis allows for minute characterization of cellular developmental stages. It can be achieved through single-cell phenotyping, conventionally performed by multi-parameter flow cytometry. However, single-cell transcriptomic signatures have been shown to reveal a more precise identification of progenitor cell subtypes since these cells are distributed in clusters that fall into one another and can therefore be misidentified when using a coarse cell surface marker approach15. An increasing number of studies uncover the epigenetic modifications that hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) can acquire from exposure to various agents, leading to a significant impact on the long-term responsiveness of the immune system16,17,18,19. The novel multi-omics technologies enable studying these processes with single-cell resolution.
Many protocols for cell and nuclei isolation have been described for brain11,20,21,22 and bone marrow samples23,24. To minimize bias due to experimental variability, it is necessary to validate optimized single-nuclei preparation protocols for joint single-cell transcriptomic and epigenomic sequencing, thereby ensuring the reproducibility of single-cell multiomic assays.
Here, two robust protocols for nuclei preparation from (1) fresh-frozen brain tissue and (2) fresh bone marrow HSPCs for downstream single-cell Multiome analysis are described (Figure 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig01.jpg" /> 
Figure 1: Schematic representation of protocols for nuclei isolation from fresh-frozen brain and bone marrow tissues. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

저자 스포트라이트: 단일 세포 분석을 통한 생물의학 연구의 발전 

단일 핵 멀티옴 분석을 위한 고품질 뇌 및 골수 핵 준비

The Cytometry and Biomarkers Technology Unit supports biomedical projects through state-of-the-art technologies and pipelines for cell phenotyping and molecular profiling with single-cell resolution. In this context, we use different tools for single-cell multiomic analysis to obtain insights into gene expression and gene regulation in health and disease. Flow cytometry identify and source individual cells based on unique characteristic.Recent advance include high-throughput, image-based spectral sorters, and those technology offer flexibility in panel design, enable simultaneous use of similar dyes, and the managing of autofluorescence. A major experimental challenge when using cutting-edge, single-cell technologies is working with particularly fragile or rare cell populations. Each tissue or cell type needs to undergo fine-tuned protocol optimization to obtain enough highly viable cells that translate into high-quality sequencing data.Our modified single nuclei preparation protocol improves nuclei recovery and minimizes stress on the nuclei. It is specifically optimized for brain and bone marrow tissues and covers all the steps from sample dissociation to nuclei purification.

위에서 설명한 두 가지 프로토콜은 두 가지 다른 유형의 조직에서 시작하는 핵의 분리를 자세히 설명합니다. 두 프로토콜 간의 차이점과 유사점은 그림 1에 개략적으로 나와 있습니다.
쥐 뇌의 핵 정제 여기에 설명된 프로토콜에서는 뇌 샘플에서 핵을 준비하는 부드러운 방법을 제안합니다. 용해 완충액에서 뇌 조직을 기계적으로 해리하는 것으로 시작하여 현탁액에서 나머지 조직을 제거하는 세척 및 여과 단계가 이어집니다. 파편, 비용해 세포 및 작은 입자의 후속 제거는 FACS에 의해 달성되어 다운스트림 Multiome 프로토콜을 위해 정제된 핵만 로드되도록 보장합니다. 그림 2 는 분류 전과 후의 핵 프로파일을 보여줍니다. 여과 후 핵 분류 전에 샘플에는 많은 양의 파편이 포함되어 있으며, 핵 염색(7-AAD)에 대해 99% 이상의 "단일항"이 양성으로 나타나 최적의 세포 용해를 나타냅니다(그림 2A). 핵은 7-AAD 양성 게이트를 기준으로 분류됩니다. 준비된 핵의 순도를 확인하기 위해 분류된 물질의 일부를 획득합니다. 그림 2B 는 분류 후 뇌핵의 프로파일을 보여줍니다. 핵 분류를 통해 핵 순도가 초기 36%(그림 2A)에서 거의 100%(그림 2B)로 증가할 수 있었습니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig02.jpg"> 그림 2: 핵 분류 및 분류 후 순도 테스트를 위한 게이팅 전략. 핵을 7-AAD로 염색하고 세포 분류기에 의해 획득하였다. (A) 핵은 먼저 크기와 입도(각각 FSC-A 및 SSC-A)에 따라 게이트됩니다. 그런 다음 FSC-A/FSC-H 특성 및 7-AAD 염색을 기반으로 단일 입자를 선택합니다. (B) 세포 분류 후, 수집 튜브에서 나온 핵의 일부를 A에서와 동일한 게이팅 전략을 사용하여 순도를 테스트합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
마우스 골수 조혈모세포 전구세포(HSPC) 정제 골수에서 분리할 때 그림 3A에 표시된 게이팅 전략에 따라 최대 2 x 105 HSPC가 FACS에 의해 분류됩니다. 분류 효율과 시료 순도를 평가합니다(그림 3B).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig03v2.jpg"> 그림 3: 골수 HSPC의 분류를 위한 게이팅 전략. (A) 핵 분리를 위해 생존 가능한 LKS+ 조혈모세포와 CD34+ 골수성 전구세포를 분류하기 위한 대표적인 FACS 게이팅 전략. (B) 분류된 세포 집단 순도 검증에 사용되는 대표 FACS 플롯. 표시된 것은 부모 모집단에 대한 다른 세포 하위 집합의 비율입니다. *두 개의 정렬된 모집단. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig03largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
"Low Cell Input Nuclei Isolation" 프로토콜은 최대 105 개의 세포가 있는 샘플에서 핵 분리를 허용합니다. 여기에는 원심분리 단계 수가 적어 세포/핵 손실을 최소화합니다. 세포 입력에 비례하여 용해 및 세척 완충액의 부피를 조정하고 최대 핵 회수를 위해 원심분리 시간을 늘렸습니다. 우리는 계수를 통해 회수된 핵의 양과 유세포 분석 및 현미경 이미징을 통해 핵의 품질을 평가하기 위한 파일럿 실험을 수행했습니다. 그림 4 는 세포 용해 후의 HSPC 샘플을 보여줍니다. 이 프로토콜은 그림 5A에서 관찰된 바와 같이 다운스트림 멀티오메 프로토콜에 영향을 줄 수 있는 파편 없이 고품질 핵을 생성했습니다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig04.jpg"> 그림 4: 분리된 골수 HSPC 핵의 순도 테스트 분류. 핵을 7-AAD로 염색하고 세포 분류기에 의해 획득하였다. 시료의 순도를 평가하기 위해 먼저 핵의 크기와 입도(각각 FSC-A 및 SSC-A)를 기준으로 핵을 게이트했습니다. 핵의 비율은 부모 개체군에 대해 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>튜브 번호</td>
			<td>튜브 이름</td>
			<td>염색된 엔티티</td>
			<td>염색된 개체의 양</td>
			<td>항체/염료 (μL)</td>
			<td>수집 완충액(μL)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>얼룩지지 않음</td>
			<td>셀</td>
			<td>5,00,000</td>
			<td>해당 없음</td>
			<td rowspan="7">200</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>LIVE/DEAD 고칠 수 있는 아쿠아 데드 셀 얼룩</td>
			<td>셀</td>
			<td>5,00,000</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>APC/시아닌 7 항마우스 CD16/32(FcγR)</td>
			<td>OneComp eBead (원컴프 eBead)</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>퍼시픽 블루 안티 마우스 리니지 칵테일</td>
			<td>OneComp eBead (원컴프 eBead)</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>PE 안티 마우스 Ly-6A/E(Sca-1)</td>
			<td>OneComp eBead (원컴프 eBead)</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>APC 안티 마우스 CD117 (c-Kit)</td>
			<td>OneComp eBead (원컴프 eBead)</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>7</td>
			<td>FITC 안티 마우스 CD34</td>
			<td>OneComp eBead (원컴프 eBead)</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>1</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 유세포 분석기의 보정 설정을 위한 단일 염색 제어. 필요한 단일 염색 대조군, 염색할 세포 또는 비드의 수, 항체 양이 표시됩니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>마스터 믹스</td>
			<td>시약</td>
			<td>최종 희석</td>
			<td>항체/염료 (μL)</td>
			<td>버퍼 유형</td>
			<td>완충액(μL)</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">믹스 1</td>
			<td>APC/시아닌 7 항마우스 CD16/32(FcγR)</td>
			<td>1/500</td>
			<td>1.2</td>
			<td rowspan="2">(주)디피에스</td>
			<td rowspan="2">300</td>
		</tr><tr><td>LIVE/DEAD 고칠 수 있는 아쿠아 데드 셀 얼룩</td>
			<td>1/250</td>
			<td>2.4</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">믹스 2</td>
			<td>퍼시픽 블루 안티 마우스 리니지 칵테일</td>
			<td>1/20</td>
			<td>30</td>
			<td rowspan="4">FACS 버퍼</td>
			<td rowspan="4">300</td>
		</tr><tr><td>PE 안티 마우스 Ly-6A/E(Sca-1)</td>
			<td>1/200</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>APC 안티 마우스 CD117 (c-Kit)</td>
			<td>1/200</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>FITC 안티 마우스 CD34</td>
			<td>1/50</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>총 염색량</td>
			<td>600</td>
		</tr></tbody></table>표 2: 골수 HSPC에 대한 염색 혼합물의 조성. 표시된 것은 4천만 개의 세포가 들어 있는 하나의 샘플을 염색하는 데 필요한 시약의 양입니다. 더 많은 수의 시료를 염색하려면 표시된 부피에 필요한 시료 수를 곱하고 추가 시료 부피의 절반을 추가하여 마스터 혼합물의 충분한 부피를 확보합니다.
보충 그림 1: 골수 세포 분리 프로토콜. (A) 복막을 엽니다. 흰색 점선은 잘라낼 선을 나타냅니다. (B) 뒷다리의 피부를 벗겨낸 후 척추를 따라 고관절을 따라 가위를 늘어서 대퇴골을 자르지 않고 다리를 잘라냅니다. (C) 근육을 제거하기 전에 다리가 몸에서 분리된 모습. (D) 근육 제거 후 다리의 모습. (E) 무릎 관절에서 대퇴골을 분리한 다음 고관절에서 대퇴골을 절단하지 않도록 주의하는 절차. 흰색 곡선 화살표는 필요한 모션을 나타냅니다. 흰색 점선 화살표는 가위를 사용하여 조심스럽게 분리할 영역을 나타냅니다. (F) 대퇴골의 원위부(무릎 관절의 경골에 부착된 부분)를 가위로 단단히 잡고 뒤로 젖혀 골수를 노출시켜 개복하는 절차. (G) 검은색 화살표로 표시된 4개의 돌출부가 노출된 물리 끝에서 보여야 합니다. (H) 150μL의 FACS 완충액을 포함하는 1.5mL 튜브 내부에 배치된 준비된 0.5mL 튜브에 개방된 끝이 아래쪽을 향하는 대퇴골의 모양. (I) 펠릿화된 골수 세포와 12,000 x g에서 빠른 원심분리 후 현재 하얀 대퇴골의 모습. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/Moraes-Cabe%20et%20al_Supplementary%20Figure1.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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single-cell/single-nuclei transcriptomics 및 multi-omics의 성공은 세포/핵의 품질에 크게 좌우됩니다. 따라서 조직에서 세포/핵을 분리하고 정제하는 것은 고도로 표준화되어야 합니다. 이 프로토콜은 다운스트림 단일 핵 다중체 분석을 위해 뇌와 골수에서 핵을 준비하는 방법을 설명합니다.

Single-cell analysis has become the approach of choice for unraveling the complexity of biological processes that require assessing the variability of ...

세포분석 및 바이오마커 기술 부서는 단일 세포 분해능을 갖춘 세포 표현형 분석 및 분자 프로파일링을 위한 최첨단 기술과 파이프라인을 통해 생물의학 프로젝트를 지원합니다. 이러한 맥락에서 우리는 건강과 질병의 유전자 발현 및 유전자 조절에 대한 통찰력을 얻기 위해 단일 세포 멀티오믹 분석을 위한 다양한 도구를 사용합니다. 유세포 분석은 고유한 특성을 기반으로 개별 세포를 식별하고 소싱합니다.최근에는 고처리량 이미지 기반 스펙트럼 분류기가 발전했으며, 이러한 기술은 패널 설계에 유연성을 제공하고 유사한 염료를 동시에 사용하며 자가형광을 관리할 수 있습니다. 최첨단 단일 세포 기술을 사용할 때 주요 실험 과제는 특히 취약하거나 희귀한 세포 집단을 다루는 것입니다. 각 조직 또는 세포 유형은 고품질 염기서열 분석 데이터로 변환되는 생존율이 높은 세포를 충분히 얻기 위해 미세 조정된 프로토콜 최적화를 거쳐야 합니다.당사의 수정된 단일 핵 준비 프로토콜은 핵 회수율을 개선하고 핵에 가해지는 스트레스를 최소화합니다. 특히 뇌 및 골수 조직에 최적화되어 있으며 시료 해리에서 핵 정제에 이르는 모든 단계를 다룹니다.

high-quality-brain-bone-marrow-nuclei-preparation-for-single-nuclei

Research

JoVE Journal

Biology

High-Quality Brain and Bone Marrow Nuclei Preparation for Single Nuclei Multiome Assays

1.5K 조회수.  Institut Pasteur, Université Paris Cité. 세포분석 및 바이오마커 기술 부서는 단일 세포 분해능을 갖춘 세포 표현형 분석 및 분자 프로파일링을 위한 최첨단 기술과 파이프라인을 통해 생물의학 프로젝트를 지원합니다. 이러한 맥락에서 우리는 건강과 질병의 유전자 발현 및 유전자 조절에 대한 통찰력을 얻기 위해 단일 세포 멀티오믹 분석을 위한 다양한 도구를 사용합니다. 유세포 분석은 고유한 특성을 기반으?...

비디오: 저자 스포트라이트: 단일 세포 분석을 통한 생물의학 연구의 발전 

Single-cell analysis has become the approach of choice for unraveling the complexity of biological processes that require assessing the variability of individual cellular responses to treatment or infection with single-cell resolution. 
Many techniques for single-cell molecular profiling have been developed over the past 10 years, and several dedicated technologies have been commercialized. The 10X Genomics droplet-based single-cell profiling is a widespread technology that offers ready-to-use reagents for transcriptomic and multi-omic single-cell profiling. The technology includes workflows for single-cell and single-nuclei RNA sequencing (scRNA-Seq and snRNA-Seq, respectively), scATAC-Seq, single-cell immune profiling (BCR/TCR sequencing), and multiome. The latter combines transcriptional (scRNA-Seq) and epigenetic information (scATAC-Seq) coming from the same cell. 
The quality (viability, integrity, purity) of single-cell or single-nuclei suspensions isolated from tissues and analyzed by any of these approaches is critical for generating high-quality data. Therefore, the sample preparation protocols should be adapted to the particularities of each biological tissue and ensure the generation of high-quality cell and nuclei suspensions.
This article describes two protocols for preparing brain and bone marrow samples for the downstream multiome 10X Genomics pipeline. The protocols are performed stepwise and cover tissue dissociation, cell sorting, nuclei isolation, and quality control of prepared nuclei suspension that is used as starting material for cell partitioning and barcoding, library preparation, and sequencing. These standardized protocols produce high-quality nuclei libraries and robust and reliable data.

The success of single-cell/single-nuclei transcriptomics and multi-omics largely depends on the quality of cells/nuclei. Therefore, isolating cells/nuclei from tissue and their purification must be highly standardized. This protocol describes the preparation of nuclei from the brain and bone marrow for downstream single-nuclei multiome assay.

연구

생물학

Purification of Nuclei from Mouse Brain for Single-Cell Multiome Analysis

To begin, fill a glass Dounce with two milliliters of ice-cold nuclei lysis buffer containing 0.01%digitonin, and add the dissected mouse brain tissue pieces into it. Using a glass Dounce tissue homogenizer, homogenize the tissue 25 times each with pestles A and B, and transfer the resulting homogenate into a 15-milliliter tube. Add two milliliters of ice-cold nuclei lysis buffer containing 0.01%digitonin to the homogenate and incubate on ice for five minutes.Then, centrifuge the nuclei at 500 G for five minutes at four degrees Celsius. Using a micropipette, remove the supernatant and add four milliliters of ice-cold nuclei lysis buffer containing 0.01%digitonin. Filter the nuclei suspension through a 40-micrometer cell strainer.Centrifuge the nuclei again, remove the supernatant and add four milliliters of staining buffer to wash the nuclei. After filtering the suspension through a 40-micrometer cell strainer, pellet the nuclei by centrifugation and resuspend the nuclei in one milliliter of PBS containing 0.04%BSA and RNase inhibitors. To count the cells, mix 10 microliters of 0.4%trypan blue with 10 microliters of the nuclei in a 0.5-milliliter tube.Count the nuclei using an automated cell counter. Transfer 100 microliters of the nuclei to a FACS tube for the unstained control. Add 10 microliters of 7-AAD to the remaining nuclei and incubate for five minutes at four degrees Celsius, and proceed with nuclei sorting using FACS.Then, transfer 10 microliters of the sorted nuclei into a new FACS tube containing 90 microliters of DPBS with 2%heat-inactivated FBS. After centrifuging the sorted nuclei, remove the supernatant using a micropipette and resuspend the nuclei in 100 microliters of diluted nuclei buffer. Before sorting, the sample contains substantial debris with over 99%of singlets positive for nuclear stain, indicating effective cell lysis.Brain nuclei after sorting demonstrated an increase in purity from the initial 36%to nearly 100%

단일 세포 멀티옴 분석을 위한 생쥐 뇌의 핵 정제

Purification of Nuclei from Mouse Bone Marrow Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs)

To begin, take a vial containing the mouse bone marrow hematopoietic stem and progenitor cells. Using a micropipette, resuspend the pellet in one milliliter of ACK lysing buffer and incubate for one to two minutes at room temperature. Transfer the resuspended mixture into a 50 milliliter tube through the pre-wetted 70 micrometer cell strainer.Then add 10 milliliters of FACS buffer to dilute the ACK lysing buffer. Centrifuge the mixture at 400 G for five minutes at four degrees Celsius and resuspend the pellet in 10 milliliters of FACS buffer by first resuspending it in one milliliter of buffer and then topping up with nine milliliters of buffer. Now, mix 10 microliters of 0.4%trypan blue with 10 microliters of the cells in a 0.5 milliliter tube, and count the cells using an automated cell counter.To stain the cells, centrifuge the cells at 400 G for five minutes at four degrees Celsius. Resuspend the pellet in FACS buffer to achieve a final concentration of one times 10 to the seven cells per milliliter by first resuspending the pellet in one milliliter of buffer and then topping up with the remaining volume. Using a P1000 micropipette, transfer the suspension into a FACS tube through a 35 micrometer cell strainer cap.Next, prepare staining mix as shown here. After centrifugation, resuspend the cell suspension in 300 microliters of staining mix one in a sample tube and incubate on ice for 15 minutes protected from light. Then add 300 microliters of mix two into the sample tube and incubate for 20 minutes on ice protected from light.Add three milliliters of the FACS buffer to the single stained and mixed stained sample tubes. Now centrifuge the cell suspension. After discarding the supernatant, resuspend the pellet in 500 microliters of the FACS buffer.Prepare a 1.5 milliliter tube prefilled with 500 microliters of collection medium. Once the FACS instrument has been calibrated, add 500 microliters of FACS buffer to the cell suspension and then transfer one milliliter of the sample through a 35 micrometer cell strainer cap into a new FACS tube. After cell sorting, transfer 10 microliters of the sorted cells into a new FACS tube containing 90 microliters of FACS buffer.Pellet the cell suspension by centrifugation and resuspend in 50 microliters of PBS with 0.04%BSA. Transfer the suspension to a 0.2 milliliter tube and add 50 microliters of PBS with BSA to the original tube to collect any leftover cells. Transfer the cells to the 0.2 milliliter tube to reach a total volume of 100 microliters.Run a pilot experiment to identify the best lysis time for nuclei isolation. After pelleting the nuclei, resuspend the nuclei pellet in 12 microliters of diluted nuclei buffer. Add two microliters of nuclei to a tube containing 0.4%trypan blue and eight microliters of PBS with 0.04%BSA and count the nuclei using an automated cell counter.After completing the nuclei isolation, transfer six microliters of nuclei resuspension into a new FACS tube pre-filled with 150 microliters of FACS buffer. Add three microliters of 7-AAD and incubate for five minutes on ice.