Fluorescent Bacterial Uptake Assay를 사용한 신생아 골수 유래 대식세포의 식세포 기능 평가

시작하려면 마우스 신생아 골수 유래 대식세포를 페놀 레드 또는 항생제 없이 완전한 DMEM으로 재현탁시킵니다. 씨 세포 현탁액의 500 microliters 200의 조밀도에, 35 밀리미터 쿼드 접시에 있는 사분면 당 000. 미리 계산된 대장균 재고를 섭씨 영하 80도에서 제거합니다.

원하는 양의 세포 현탁액을 1.7밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 분취하여 25의 감염 다중성에서 세균 접종물을 준비한 다음 총 1밀리리터의 부피에 PBS를 추가합니다. 박테리아 현탁액을 2000G에서 5분 동안 원심분리하고 펠릿을 50마이크로리터의 PBS에 재현탁시킵니다. 녹색 형광 pH에 민감한 염료를 최종 농도인 500 마이크로 어금니에 첨가하고 염료 접합을 위해 어두운 곳에서 20분 동안 배양합니다.

1000G에서 5분 동안 원심분리하여 PBS 1밀리리터로 박테리아를 4번 세척합니다. 펠릿을 페놀 레드가 없는 완전한 DMEM 500마이크로리터에 재현탁시키고 골수 유래 대식세포 배양액을 첨가합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 4시간 동안 배양액을 배양합니다.

세포 투과성 적색 형광 염료 200 나노그램을 첨가하여 리소좀을 염색하고, 세균 감염 시 골수 유래 대식세포 내부에 풍부한 녹색 형광 세균 식균이 검출되었습니다. 녹색 형광은 산성화된 리소좀을 나타내는 적색 형광으로 더욱 국소화됩니다. 녹색 pH 민감성 이양성 신생아 골수 유래 대식세포의 식세포작용 및 출현도 4시간 감염 기간 동안 관찰되었습니다.