우리는 텍스트를 코멘트에 대한 Blelloch 실험실을 감사드립니다. 이 작품은에서 NIH (K08 NS48118 및 R01 NS057221), 재생 의학의 캘리포니아 공과 대학 (CIRM) (시드 부여 RS1 - 00161, 뉴 학부 수상 RN2 - 00906)와 퓨 자선 트러스트에서 RB하는 자금에 의해 및 FM을 지원했습니다 Wissenschaftlich Urologische Gesellschaft EV.

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	<li>Mitchell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection.">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10513-10518 (2008).</li><li>Tang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=220-plex+microRNA+expression+profile+of+a+single+cell.">220-plex microRNA expression profile of a single cell.</a> Nat Protoc. 1, 1154-1159 (2006).</li><li>Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. 3, 644-645 (2003).</li><li>Suh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+function+is+globally+suppressed+in+mouse+oocytes+and+early+embryos.">MicroRNA function is globally suppressed in mouse oocytes and early embryos.</a> Curr Biol. 20, 271-277 (2010).</li><li>Babiarz, J. E., Ruby, J. G., Wang, Y., Bartel, D. P., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+ES+cells+express+endogenous+shRNAs,+siRNAs,+and+other+Microprocessor-independent,+Dicer-dependent+small+RNAs.">Mouse ES cells express endogenous shRNAs, siRNAs, and other Microprocessor-independent, Dicer-dependent small RNAs.</a> Genes Dev. 22, 2773-2785 (2008).</li><li>Babiarz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNAs:+their+biogenesis,+regulation+and+function+in+embryonic+stem+cells.">Small RNAs: their biogenesis, regulation and function in embryonic stem cells.</a> StemBook. , (2009).</li><li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2008).</li><li>Wang, Y., Medvid, R., Melton, C., Jaenisch, R., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DGCR8+is+essential+for+microRNA+biogenesis+and+silencing+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">DGCR8 is essential for microRNA biogenesis and silencing of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nat Genet. 39, 380-385 (2007).</li><li>Kanellopoulou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicer-deficient+mouse+embryonic+stem+cells+are+defective+in+differentiation+and+centromeric+silencing.">Dicer-deficient mouse embryonic stem cells are defective in differentiation and centromeric silencing.</a> Genes Dev. 19, 489-501 (2005).</li><li>Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom+microarray+platform+for+analysis+of+microRNA+gene+expression.">A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression.</a> Nat Methods. 1, 47-53 (2004).</li><li>Moltzahn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+based+multiplex+qRT-PCR+identifies+diagnostic+and+prognostic+microRNA+signatures+in+sera+of+prostate+cancer+patients.">Microfluidic based multiplex qRT-PCR identifies diagnostic and prognostic microRNA signatures in sera of prostate cancer patients.</a> Cancer Res. 71, 550-560 (2011).</li><li>Mestdagh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+universal+method+for+microRNA+RT-qPCR+data+normalization.">A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization.</a> Genome Biol. 10, R64-R64 (2009).</li></ol>

앨런 미러는 플루 회사의 직원입니다. 그렇지 않으면, 우리는 공개하지 재정적 이해 관계가 없습니다.

miRNAs가 짧고 (18-24 세포핵), 비 코딩 모두 약화 메신저 RNAS (mRNA)와 억제 자신의 번역에 의해 게시 - transcriptionally 유전자 발현을 조절 RNAS을 6. 인간 유전자 중 최소한 한 세 번째 보존 포함 사실 miRNA 자신의 3&#39;UTR에 바인딩 - 사이트 및 pluripotency, 증식 및 apoptosis에 대한 유전자 miRNAs의 뚜렷하지 상호 작용은 세포의 운명 결정, 조직 항상성 및 암 같은 질병에 중요한 기여를 제안합니다. 6,7 따라서 정확한 microRNA 표현 프로파일은 확장의 아르 관심. qRT - PCR의 miRNA 발현 프로 파일링 프로토콜 2 출판 멀티 플렉스를 테스트하려면 우리는 부정적인 컨트롤로 작은 RNA 결함 mESC를 사용합니다. / - - DGCR8 - / - 주사위 놀이를하는 사람 중에 세포는 모든 정식 microRNAs의 결함입니다. 세포는 정식이 아닌 canoncial 모두 micoRNAs 부족 8,9 / - - DGCR8 MES 대 야생 유형의 수준을 비교 세포를, 우리는 몇 가지 10 microRNAs는 야생 형 세포 11 발견되지 않은 표현으로 정확성 부족을 밝혀. 일부는 심지어 녹아웃 세포 (그림 3A)에 비해 낮은 표현 수준을 보여주었다. 우리는 정확성의 부족은 singleplex RT - 부량 전에 연속 2 멀티 플렉스 단계의 대규모 뇌관 이월 (RT 및 Pre - PCR)에 의한지도 모른다고 가상. 그러나, 멀티 플렉스 사전 증폭은 RNA의 시작 농도가 제한 특히, 신호의 강도를 향상시키기 위해 필요합니다. / - - 원시 polyacrylamide의 젤 (그림 2)에서 크기를 선택하여 primers에서 사전 PCR 제품을 멀리 정화함으로써, 우리는 Dgcr8 모두에서 더 많은 microRNAs과 거짓 긍정적인 신호의 손실을 감지하여 정확성에 상당한 개선을 보여주는 수 있으며, 주사위 놀이를하는 사람 - / - 또한 배경 (인물 3A 및 3B) 희귀 Dgcr8 독립 / 주사위 놀이를하는 사람 종속 작은 RNAS (그림 3B) 11의 적절한 분류에 허용되는 변경 qRT - PCR 방식. 따라서 멀리 사전 PCR 제품의 과도한 primers를 정화하기 위해 추가 단계는 대형 멀티 플렉스 프라이머를 사용하면 예제마다 집합 특히, 명확하게 유리한 것입니다. 사전 증폭 사이클의 최적의 번호는 입력 RNA의 농도에 의해 결정됩니다. 하지 미만 또는 균형 overamplify는 특정 실험의 세부 사항으로 안내한다. 이상 천 알려진 microRNAs를 통해 표준의 사용 384 잘 복수의 샘플을 비교 특히 접시가 광범위한 microRNA 프로 파일링 최적되지 않을 수 있습니다. 플루 동적 배열 IFC는 nanoliter 규모 (6.7 NL)에서 하나의 실험 (9,216 반응)에서 96 가지 microRNAs에 대해 96 개인 샘플까지 테스트, pipetting 단계와 필요한 화학 상당한 감소와 수 있습니다. 각 실행에 대한 분석 소프트웨어는 증폭 곡선, 색상 코드 열지도 및 사이클 임계값 값 (CT)를 제공합니다. 동시 대규모 프로 파일링은 실험 차이를 줄여 작은 RNA 컨트롤을 사용하게 다른 정상화 전략을 밖 수행 의미 표현 값 정상화에 대한 수 있습니다. 12 미리 할당된 TaqMan 프로브와 함께 상용 384 잘 플랫폼에 비해, 사용자 정의 만든 프라이머 세트와 높은 처리량 프로 파일링 플랫폼의 조합은 높은 실험 유연성을 제공합니다. 동적 배열 플랫폼과 함께 최적화된 멀티 플렉스 qRT - PCR 방법은 성공적으로 우리는 동시에 384 miRNA (그림 4)의 수준에서 변경 48 전립선 암 환자 세라를 화면과 컨트롤의 증가 (즉, 합성 microRNAs)없이 데이터를 정상화 수있었습니다. 11 샘플 준비의 프로 파일링 결과 단계의 증가에도 불구하고, 설명하는 방식도 제한 시작 소재, 시간 및 miRNA 발현 수준에 대한 큰 샘플 세트를 프로필에 비용 효율 높은 처리량 방법입니다.

high throughput microrna profiling: optimized multiplex qrt-pcr at nanoliter scale on the fluidigm dynamic arraytm ifcs

개발, 조직 homoeostasis과 질병을 기본 핵심 프로세스에서 miRNAs의 광범위한 참여가 연구와 제약 공동체 간의 급증 관심되었다. miRNAs을 연구하기 위해서는 microRNA 수준의 부량가 정확하고 안정적​​인 것을 중요합니다. 작은 RNA 부족한 마우스 배아 줄기 세포 (mESC)에 야생 형 비교하여, 우리는 이전의 출판 멀티 플렉스 qRT - PCR 기술의 정확성과 견고의 부족을 공개했다. 여기, 우리는 극적으로 기술의 정확성과 견고을 증가 singleplex 실시간 감지, 이전 이전 다중화 단계에서 과도한 primers 멀리 정화를 포함하여 최적의 방법을 설명합니다. nanoliter 볼륨에서 microfluidic 칩 기술을 수행하는 방법에 또한, 우리가 설명 크게 시약 비용 절감 및 시간 효율적인 높은 처리량 miRNA 발현 프로 파일링을 수 있습니다.

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High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

여기 샘플 제한된 양의 작업 특히, microRNA (miRNA) 표현 수준에 대해 비용과 시간 효율 높은 처리량 검사 도구로 microfluidic 플랫폼와 함께 최적화된 멀티 플렉스 반전 transcriptase 정량 PCR (qRT - PCR) 프로토콜을 설명합니다.

높은 처리량 MicroRNA의 프로파일 : 최적 멀티 플렉스 플루 동적 ArrayTM의 IFCs에 Nanoliter의 규모 qRT - PCR

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

high-throughput-microrna-profiling-optimized-multiplex-qrt-pcr-at

Research

JoVE Journal

Bioengineering

20.4K 조회수.  University of California San Francisco. 여기 샘플 제한된 양의 작업 특히, microRNA (miRNA) 표현 수준에 대해 비용과 시간 효율 높은 처리량 검사 도구로 microfluidic 플랫폼와 함께 최적화된 멀티 플렉스 반전 transcriptase 정량 PCR (qRT - PCR) 프로토콜을 설명합니다.