마이크로패터닝은 세포 모양과 세포 간 기계의 활동 사이의 연결을 이해하기 위해 과학자들이 사용하는 강력한 기술입니다. 몇몇 기술은 연구원이 세포 모양을 조절하는 것을 허용하더라도, 이 기술은 수시로 몇몇 생물학 실험실에 접근할 수 없는 특화된 장비를 요구합니다. 이 비디오는 시판되는 다광화상 이미징 시스템에서 마이크로패터닝을 자동화하는 데 필요한 단계를 안내합니다.
이 프로토콜의 한 가지 장점은 특수 장비의 사용을 피한다는 것입니다. 또한 일반적으로 마이크로패턴에서 가장 시간이 많이 소요되는 공정인 포토마스크를 재구성하지 않고도 패턴을 쉽게 변경할 수 있습니다. 당사의 이미지 처리 도구는 공정하고 자동화된 방식으로 단백질의 대표적인 분포를 반영하는 평균 세포 이미지를 생성합니다.
실험에서 커버립을 사용하지만 자동화된 워크플로우를 사용하면 슬라이드와 유리 바닥 접시에 패턴을 표시할 수도 있습니다. 적절한 현미경 설정이 시스템이 올바른 초점 평면을 식별하고 자동화 된 방식으로 패턴을 식별하는 데 매우 중요하기 때문에이 방법의 시각적 데모는 중요합니다. 지시에 따라 PVA 솔루션을 준비합니다.
8개 부품 PVA에 HCL 1부를 추가합니다. 튜브를 조심스럽게 혼합하려면 몇 번 반전하십시오. 용액 2밀리리터를 작은 페트리 접시에 붓고 깨끗한 전처리된 커버슬립을 액체에 담급니다.
셰이커에서 실온에서 5분간 배양하세요. 조심스럽게 솔루션에서 커버 슬립을 제거합니다. 커버슬립 스피너를 사용하여 40초 동안 코트를 회전시십시오.
그 동안, 핀셋을 청소. 커버슬립을 상자에 옮기고 하룻밤 사이에 4도건조합니다. 현미경 소프트웨어를 켭니다.
먼저 레이저 라인을 750나노미터로 설정합니다. 그런 다음 이미지라는 새 광학 구성을 설정합니다. 이것은 우리가 반사체를 통해 커버 슬립을 이미지 할 수있는 기준 광학 구성입니다.
다른 옵션을 기본값으로 두고 적절한 목표를 선택합니다. 이 광학 구성에서 하드웨어 설정을 구성합니다. 적외선 레이저를 자극 레이저로 설정합니다.
광선 스플리터를 광선 경로에 배치하여 이미징을 위해 IR 레이저를 사용합니다. 갈바노 스캐너 장치와 적절한 D 스캔 감지기를 선택합니다. 커버슬립의 작은 피처를 캡처하기에 충분한 스캔 크기와 거주 시간을 선택합니다.
IR 레이저 사용 상자가 선택되어 있는지 확인합니다. 커버슬립 표면의 밝지만 포화되지 않은 이미지를 얻기 위해 획득 레이저 전력 및 검출기 민감도를 조정합니다. 스캔 영역 창에서 확대/축소를 하나로 설정하여 전체 시야 필드를 캡처합니다.
광학 구성을 저장합니다. 이제 현미경이 집중되고 ROI 마스크를 로드하며 자동화된 방식으로 패턴을 생성할 수 있는 일련의 광학 구성을 설정합니다. 첫 번째 광학 구성을 통해 현재 시야에 자동 초점을 맞추는 데 사용되는 수탁마커를 인쇄할 수 있습니다.
이미지 광학 구성을 복제하고 이름을 바꾸면 신탁 마커를 인쇄합니다. 이 단계에서 인쇄하기 때문에 빔 스플리터를 라이트 경로 밖으로 이동하고 적절한 이색 거울로 바꿉을 바꿉시다. 시간을 절약하기 위해 가장 작은 스캔 크기를 선택합니다.
이 단계에서는 이미징이 필요하지 않으므로 검출기 감도를 0으로 설정합니다. 인쇄를 가능하게 하는 레이저 전력을 늘립니다. 스캔 영역 창에서 확대/축소를 최대로 설정하고 스캔 영역을 시야 중간에 배치합니다.
이제 PVA 표면의 고르지 못한 현상을 설명하기 위해 Z 스택 실험을 설정합니다. Z 위치에서 상대적으로 이동을 설정합니다. 적절한 Z 장치를 선택합니다.
그런 다음 이미지 광학 구성을 복제하고 이름을 바꾸면 자동 초점입니다. 가장 작은 스캔 크기를 선택하고 스캔 영역 창의 줌 계수를 줄여 뷰 필드가 신탁 마커보다 약간 더 큽니다. 이렇게 하면 커버슬립의 다른 작은 기능이 자동 초점 작업을 방해하지 않습니다.
장치 메뉴에서 자동 초점 설정을 선택합니다. Z 스택 실험에서 스캔 두께를 설정합니다. 현미경은이 범위를 통해 스캔하고 신탁 마커를 사용하여 최고의 초점 평면을 찾을 것입니다.
그런 다음 이미지 광학 구성을 복제하고 이름을 바꾸면 ROI로드합니다. 마스크가 이 광학 구성으로 촬영한 이미지에 로드되므로 ROI 마스크와 동일한 스캔 크기를 설정합니다. 우리는 해상도와 속도 사이의 최적의 균형을 달성하기 위해 2048 픽셀을 사용했다.
이제 커버슬립을 패턴화하는 데 사용되는 광학 구성을 설정합니다. 인쇄 신탁 마커 광학 구성을 복제하고 마이크로 패턴의 이름을 바꿉니다. 확대/축소 계수를 하나로 설정합니다.
PVA를 축하하는 자극 레이저 전력을 증가시다. 적절한 스캔 속도를 선택합니다. ND 자극 창에서 ND 자극 실험을 설정합니다.
시간 일정에 몇 단계를 추가하고 각 단계를 자극시 설정합니다. 자극 영역과 지속 시간이 올바른지 확인합니다. 동일한 창에서 스테이지 이동 주 Z 함수를 각 단계 앞에 사용하도록 설정합니다.
이것은 다시 Z 방향으로 의 편차를 설명합니다. 마지막으로, 패턴을 찾는 데 도움이 될 수 있는 커버 슬립에 표시되는 레이블을 만들기 위해 광학 구성을 설정합니다. 인쇄 수탁 마커를 복제하고 레이블 표면의 이름을 바꿉니다.
레이저 전력을 크게 늘리고 줌을 하나로 설정합니다. PVA 코팅 커버슬립을 홀더에 옮기. 직립 현미경의 경우 PVA 표면이 아래로 향하도록 하십시오.
커버슬립을 안정화하기 위해 모서리에 물을 추가합니다. 현미경 단계에 홀더를 마운트합니다. 목표를 낮추고 그 사이에 물을 추가합니다.
현미경 소프트웨어에서 IR 레이저 셔터를 켜고 패터닝 전에 자동 정렬을 수행합니다. 이미지 광학 구성으로 전환합니다. 목표를 커버슬립에 가깝게 천천히 이동시키면서 시야를 스캔합니다.
처음에는 이미지가 매우 어둡게 나타납니다. 이미지 밝기가 약간 증가할 때까지 목표를 커버슬립에 더 가깝게 이동합니다. 이것은 목표에 직면 하는 커버 슬립 표면.
밝기가 감소하고 다시 증가할 때까지 목표를 계속 이동합니다. 이것은 우리가 패턴 것입니다 PVA 표면입니다. 커버슬립 결함이나 먼지와 같은 작은 기능에 초점을 맞추고 Z 드라이브에 0을 설정합니다.
레이블 표면 광학 구성으로 전환합니다. 캡처를 클릭합니다. 이미징으로 돌아가서 스캔합니다.
유리 손상은 라벨이 성공적으로 인쇄되었음을 보여줍니다. 유리 입자를 피하기 위해 스테이지를 1~2개의 뷰 필드로 이동합니다. 확인을 스캔합니다.
장치 메뉴에서 스테이지 이동 매크로를 엽니다. 변수 M과 N을 패턴화할 원하는 뷰 필드 수로 설정합니다. 매크로를 저장하고 실행합니다.
패터닝이 완료되면 이미지 광학 구성으로 전환하고 패턴을 스캔합니다. 각 시야의 패턴 섬은 명확한 테두리를 가지고 있고 빛을 고르게 반사해야합니다. 어둡고 고르지 않은 패턴은 불완전한 PVA 제거를 제안합니다.
이것은 일반적으로 부족한 레이저 힘 또는 잘못된 초점 평면 때문입니다. 레이저 전력이 너무 높게 설정되면 PVA가 거품을 일으킬 수도 있습니다. 커버립에 세포를 도금 한 후, 세포는 확산패턴의 모양을 취해야 한다.
이것은 석궁 패턴에 도금된 인간 섬유아세포의 면역형광 이미지입니다. 셀은 라멜리포디아의 액틴이 풍부한 림을 표시합니다. 양쪽을 따라 두껍고 복부 스트레스 섬유와 횡가로 연결된 등쪽 응력 섬유.
미오신 라이트 체인은 조밀한 라멜리포디아 림 뒤에 앉아 액틴 번들을 따라 줄무늬 패턴을 보였다. 맞춤형 이미지 처리 도구를 사용하여 평균적인 관심 단백질 이미지를 생성했습니다. 이 이미지는 위에서 설명한 액틴 구조가 많은 수의 패턴에서 일관되다는 것을 보여줍니다.
평균 화 후 미신의 개별 구조를 잃지만 액틴 번들을 따라 국소화가 보존됩니다. 이 비디오를 시청한 후 최소한의 수동 작업으로 상용 멀티포토른 시스템을 사용하여 마이크로 패터닝 워크플로우를 설정할 수 있어야 합니다. 불완전한 패턴을 생성하지 않도록 자신의 시스템에 대한 레이저 전력을 최적화하거나 PVA 최대 효율은 자동 초점 및 마이크로 패터닝 단계의 매개 변수를 조정하여 달성 될 수있다.
세포 형태와 관련 된 세포 통로 조사 하는 것 외에도, 이 기술은 또한 약물 선별 및 세포 모양의 변이에 민감한 다른 응용 프로그램에 적용 될 수 있습니다.
