이 프로토콜은 원하는 모양, 특히 세포 클러스터의 연구를위한 패턴의 고립 된 섬의 고충실도 단백질 마이크로 패턴의 일관된 생성을 허용합니다. 이 기술은 한 단계만으로 모든 모양과 크기의 고립 된 섬 마이크로 패턴을 만드는 데 사용할 수 있지만 이전에는 이러한 패턴을 만드는 데 두 개의 별도 단계가 필요했습니다. 먼저 PDMS를 제조자의 지침에 설명된 대로 올바른 경화제 대 염기 비율로 혼합한다.
실온에서 15분 동안 가압 인큐베이션하고, 이어서 혼합물을 진공 하에 15분 동안 탈기시킨다. PDMS를 마스터 몰드에 붓고 섭씨 37도까지 설정된 인큐베이터로 옮겨 밤새 경화시킵니다. 인큐베이터에서 마스터 몰드를 제거하고 실온까지 식히십시오.
마스터 몰드가 냉각되는 동안 초음파 처리 25 밀리미터 커버슬립을 에탄올에서 10 분 동안 커버 슬립합니다. 준비 중인 스탬프의 수만큼 커버슬립을 사용하십시오. 커버슬립을 DI 물로 완전히 헹구고 여과된 에어건을 사용하여 건조시킵니다.
커버슬립을 높은 진공 하에서 플라즈마 클리너를 사용하여 일분 동안 플라즈마로 처리하십시오. 커버 슬립이 챔버 내부로 이동하는 것을 방지하기 위해 처리 후 진공을 천천히 해제하십시오. 각 커버슬립을 직사광선이나 오버헤드 조명이 없는 방에 형광 표지 단백질 용액 100마이크로리터로 코팅합니다.
빛으로부터 추가 보호를 위해 샘플을 덮고 실온에서 20 분 동안 배양하십시오. 각 커버슬립을 DI 물로 완전히 헹구십시오. 각 커버슬립의 측면을 종이 타월 또는 유사한 흡수성 물질에 부드럽게 두드려 표면에서 과도한 물을 제거하십시오.
커버 슬립을 적어도 30 분 동안 어둠 속에서 덮지 않은 채로 두어 완전히 말리십시오. 단백질 코팅 커버슬립이 건조되는 동안 메스 또는 날카로운 블레이드로 절단하여 마스터 몰드에서 PDMS 스탬프를 제거합니다. PDMS 스탬프를 높은 진공 하에서 두 분 동안 플라즈마로 처리하십시오.
흄 후드 아래 뚜껑이있는 용기에 우표를 넣은 다음 각 스탬프를 100 % 에탄올에 희석 된 10 % 3-APTMS의 얇은 층으로 코팅하십시오. 우표로 용기를 덮고 실온에서 다섯 분 동안 배양하십시오. 양쪽의 각 스탬프를 DI 물로 철저히 헹구십시오.
우표를 깨끗한 용기에 넣고 DI 물에서 준비한 2.5 % 글루타르 알데히드로 코팅하십시오. 우표를 덮고 실온에서 30 분 동안 배양하십시오. DI 물로 스탬프를 완전히 헹구십시오.
앞서 설명한 것처럼 표면에서 과도한 물을 제거하고 스탬프가 30 분 동안 덮이지 않고 건조되도록하십시오. 30분 후에 단백질이 코팅된 커버슬립이나 스탬프가 완전히 건조되지 않으면 여과된 에어건을 사용하여 완전히 건조시킵니다. 스탬프의 패턴 측면을 커버슬립에 밀어 넣어 완전히 접촉할 수 있도록 충분한 압력을 가합니다.
15 분 동안 방해받지 않고 그대로 두십시오. 그런 다음 PDMS 스탬프를 커버 슬립에서 조심스럽게 벗겨냅니다. 적절한 필터와 함께 형광 현미경을 사용하여 패턴화된 커버슬립의 충실도를 확인합니다.
패턴화된 커버슬립을 즉시 사용하거나 나중에 사용할 때까지 직사광선으로부터 멀리 떨어뜨려 보관하십시오. PAA 하이드로겔 전구체를 제조하기 전에, 개방되기 전에 실온에 도달하도록 냉장고로부터 아크릴산 NHS 에스테르를 제거한다. 70 % 에탄올로 멸균하여 교환 가능한 커버슬립 접시 세트를 준비한 다음 사용 전에 적어도 30 분 동안 생물 안전 캐비닛에서 자외선 하에서 배양하십시오.
흄 후드 아래에서 DI 물에서 준비된 40 % 아크릴 아미드 1.25 밀리리터를 15 밀리리터 원뿔형 튜브에 첨가하십시오. 동일한 튜브에 DI 물에서 준비된 비스 아크릴 아미드 용액 175 마이크로 리터를 첨가하십시오. 그런 다음 500 마이크로 리터의 10X PBS를 넣은 다음 2.915 밀리리터의 DI 물을 첨가하십시오.
이 전구체의 피펫 969 마이크로리터를 1.5 밀리리터 마이크로원심분리 튜브에 넣고 나머지는 섭씨 4도에서 최대 2주 동안 보관한다. 신선한 마이크로 원심분리 튜브에서 50 ~ 100 밀리그램의 APS를 측정하고 DI 물에서 밀리리터 당 100 밀리그램으로 희석하십시오. 후드에서 NHS 에스테르를 열고 마이크로 원심 분리 튜브에서 최대 세 밀리그램의 NHS를 조심스럽게 측정하십시오.
NHS 에스테르를 1X PBS에서 밀리리터 당 1 밀리그램으로 희석하십시오. 흄 후드 아래에서, 두 마이크로리터의 TEMED를 PAA 전구체의 969 마이크로리터 분취량을 함유하는 마이크로원심분리 튜브에 첨가한다. 1 몰 HCL의 15 마이크로리터를 첨가하여 하이드로겔 용액의 pH를 감소시키고 NHS 에스테르의 가수분해를 피한다.
NHS 에스테르 용액 10 마이크로리터를 튜브에 첨가한다. 생물 안전 캐비닛에서 다음 단계를 수행하십시오. 30mm 커버슬립을 3-APTMS와 글루타르알데히드 처리면이 있는 커버슬립 접시 세트의 중간 부분에 조심스럽게 놓고 플라스틱 링을 위에 조이십시오.
최소 광 노출로 패턴화된 커버슬립을 설정하여 다음 단계를 준비합니다. 다섯 마이크로리터의 APS 용액을 PAA 전구체 분취량 튜브에 피펫한 다음, 반전시키고 혼합한다. 즉시이 용액 35 마이크로 리터를 30 밀리미터 커버 슬립에 피펫하십시오.
패턴화 된 커버 슬립을 단백질 쪽을 아래로 내려 놓은 용액에 놓습니다. 하이드로젤에 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 하이드로 겔을 빛으로부터 보호하고 90 분 동안 중합 할 수 있도록하십시오.
하이드로겔이 중합되면 면도날이나 메스를 사용하여 상부 커버슬립을 제거하고, 커버슬립이 겔 표면의 패턴을 망치지 않도록 한 번 제거한 후 겔에서 떨어지거나 미끄러지지 않도록 하십시오. 하이드로겔 내에 남아있는 NHS 에스테르를 부동태화시키기 위해, 두 밀리리터의 멸균 PBS를 겔에 첨가하고, 섭씨 37도에서 45분 동안 인큐베이션한다. 즉시 실험을 위해 겔을 준비하거나 추가 사용 시까지 섭씨 네 도의 멸균 PBS에 밤새 보관한다.
하이드로젤은 형광 피브로넥틴으로 간접적으로 패터닝되어 클러스터 내의 세포 견인력을 시각화하고 측정하고 미리 결정된 크기와 모양의 섬 패턴을 만들었습니다. 패턴 품질은 PDMS 스탬프가 주조 된 마스터 몰드의 충실도와 직접 관련이있었습니다. 이 방법은 미리 결정된 모양의 고립되고 잘 정의 된 섬 패턴을 제조 할 수 있습니다.
피브로넥틴 부착 도트는 섬의 원하는 영역 내에서만 존재하였다. 접착 점의 이러한 고립 된 섬은 클러스터 모양을 더 잘 제어 할 수있었습니다. 두 개의 작은 3-APTMS로 PDMS 스탬프를 코팅하는 것은 제거 방법의 효과를 제한하지만 너무 많으면 스탬프 표면에 주황색 잔류 물이 생성되기 때문에 중요합니다.
여기서 만들어진 패턴은 개별 세포와 클러스터 모두에서 세포 견인력을 결정하는 데 사용할 수 있으며, 이는 기계적 항상성을 유지하는 능력에 대한 통찰력을 제공합니다.
