마우스로부터 분리된 갈색 지질 조직에서 에스테르 와 비 에스테르 단백질의 효율적인 ChIP 시퀀싱을 수행하는 데 사용되는 미터. 이 기술의 주요 장점은 프로토콜이 지질 조직에서 크로마틴 관련 복합체의 효율적인 면역 침전을 위해 최적화되었다는 것입니다. 절개하기 전에 안락사 마우스를 70 %에탄올로 스프레이하십시오.
마우스를 등을 위로 향하게 한 다음 목을 따라 절개를 합니다. 다음으로, 어깨 사이의 피부 바로 아래에 BAT를 배치하고 조심스럽게 백색 지방의 얇은 층을 제거합니다. 각 BAT 패드를 실온에서 150 RPM에서 15분 동안 1%포름알데히드를 함유한 PBS 10 밀리리터로 교차 연결합니다.
15분 후 BAT에 2.5 개의 어어 글리신을 추가하여 교차 연결을 담금질하여 125 밀리머의 최종 농도를 생성합니다. 실온에서 150 RPM에서 회전, 5 분 동안 셰이커에 배치합니다. 그 후 BAT 패드를 저혈압 용해 버퍼 500 마이크로리터로 옮기고 각 BAT 패드에 두 개의 스테인레스 스틸 구슬을 추가합니다.
그런 다음, 비드 계 조직 균질화제를 사용하여 조직을 분쇄한다. 최대 전력에서 5분으로 시작합니다. 필요한 경우 조직이 균질화되고 단일 세포가 분리 될 때까지 시간을 연장하십시오.
샘플을 새로운 튜브로 옮기고 원심분리기는 16도, 000 G에서 10분 동안 섭씨 4도에서 전달합니다. 10분 후, 상체관을 새로운 튜브로 옮기고 세포 펠릿을 얼음 위에 보관합니다. 16, 000 G에서 섭씨 4도에서 상피분리하여 부동 세포의 손실을 방지합니다.
그런 다음 최종 상체를 버리고 SDS 용해 버퍼의 300 마이크로 리터에서 두 세포 펠릿을 1 회 프로테아제 억제제로 다시 중단하십시오. 10분 동안 얼음에 배양하세요. 다음으로, 리세이츠를 초음파 처리하여 DNA 단편을 200 내지 500개의 기본 쌍을 길게 생성한다.
초음파 처리 후, 섭씨 4도에서 16, 000G에서 10 분 동안 원심 분리하여 파편을 제거하십시오. 면역 침전을 수행하기 위해 ChIP 입력으로 크로마틴 용액의 1 %를 제쳐두고 밤새 입력을 섭씨 4도에서 유지하십시오. 다음으로, ChIP 항체를 크롬틴 용액의 1밀리리터에 추가하고 동일한 종의 해당 전면역 IgG 또는 정상 IgG와 병행 면역 침전을 수행한다.
또는 항체 제어가 없는 크로마틴 용액 1밀리리터를 저장하십시오. 회전과 섭씨 4도에서 하룻밤 을 배양. 면역 복합체를 수집하려면 면역 복합체에 50 마이크로리터를 넣고 150 RPM에서 회전하여 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양합니다.
한 시간 후, 4섭씨에서 1000배 G에서 1분간 원심분리로 구슬을 살포합니다. 0.45 마이크로미터 PVDF 원심 필터 컬럼에서 구슬의 순차적 세척을 수행하여 500 마이크로리터의 낮은 염분 세척 버퍼로 컬럼의 구슬을 먼저 이송하여 스트링성이 증가하는 버퍼를 수행합니다. 그런 다음 2500 G.에서 3분 동안 기둥에 있는 구슬을 플로우스루를 버립니다.
낮은 소금 세척 절차에 따라 높은 소금 세척 버퍼로 세척을 반복합니다. 그런 다음 염화물 리튬으로 절차를 반복하고 마지막으로 1 회 TE로 절차를 반복하십시오. 세치가 완료된 후, 기둥의 펠렛 구슬에 용출 완충제 300 마이크로리터를 추가하여 면역 복합체를 엘테한다. 400 RPM의 셰이커에서 실온에서 30분 동안 배양하십시오.
그 후, 신선한 튜브에서 2500 G에서 3 분 동안 열을 회전하여 엘루트를 수집합니다. 하룻밤 사이에 65도에서 수집된 엘루트와 입력을 배양하여 교차 링크를 반전시면 됩니다. DNA를 복구하려면 페놀 클로로폼 IAA 300마이크로리터를 1대1 비율로 엘ute 및 입력에 10초 간 첨가합니다.
다음으로 섭씨 4도에서 21, 000 G에서 20분간 회전합니다. 펠릿을 보관하고 상체를 폐기하십시오. 차가운 70%에탄올 1밀리리터로 펠릿을 씻으십시오.
그런 다음 섭씨 4도에서 21, 000 G에서 5 분간 회전합니다. 상체를 버리고 펠릿을 건조시키십시오. 추가 절차를 위해 DNAse가없는 물의 70 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오.
다음은 야생형 또는 GPS2-A 녹아웃 마우스로부터 분리된 BAT를 이용한 ChIP Q PCR의 예입니다. GPS2는 상이한 세포주에서 핵 인코딩된 미토콘드리아 유전자의 발현에 필요한 것으로 밝혀졌기 때문에 GPS2의 모집은 두 개의 특정 핵 인코딩 된 미토콘드리아 유전자에 대해 테스트되었다. 미토콘드리아에서 고도로 농축된 조직의 예로 마우스로부터 BAT에서 NDUFV1 및 TOMM20.
GPS2 프로모터 점유율은 GPS2-A 녹아웃 마우스와 야생 형 문자 메이트에서 비교되었다. GPS2-A 녹아웃 마우스로부터 BAT의 선택적 표적 유전자에 대한 GPS2 결합에서 예상되는 감소가 관찰되었다. 여기에 기재된 프로토콜을 이용하여, RNA 폴리머라제 2개 및 억압히스톤 마크인 H3K9ME3의 증가된 결합은 GPS2-A 녹아웃 마우스로부터 의 박쥐에 기록되었다.
이러한 결과는 선택된 핵인코딩된 미토콘드리아 유전자에 대한 GPS2모집을 확인하고, GPS2가 H3K9ME3의 축적을 막기 위해 요구되고 따라서 표적 프로모터에 대한 극 2전사 활동의 실속에 요구된다는 것을 보여준다. 여기에 설명된 프로토콜은 갈색 지방 조직에 특별히 최적화되어 있더라도 다른 뮤린 및 인간 조직에서 ChIP를 수행하기 위한 소중한 도구를 나타냅니다. 페노클로로폼을 사용하면 매우 위험할 수 있습니다.
따라서 이 시약을 사용하는 동안 항상 연기 후드 아래에서 작동하는 것이 매우 중요합니다.
