이 작품은 미국의 복구 및 2009 년 재투자 법을 통해 취득 자금을 포함 ANI에 NIH R01 GM56244 지원하고, NIH R01 GM87130에 의해 JARP하는 것이었다

1. 태아의 분리 참고 : 마우스와 관련된 모든 작업이 적절한 동물 관리 및 사용 정책 및 프로토콜에 따라 수행되어야 <ol><li> 여성의 마우스의 짝짓기 플러그의 존재 짝짓기 후 아침 확인하고 다른 케이지에서 그들을 배치하여 스터드 남성에서 여성 성관계를 구분한다. 짝짓기 플러그가 관찰되는 그날 정오가 개발의 배아 일 0.5 (E0.5)로 간주됩니다. </li><li> E8.5에서 (또는 원하는 단계와 다를 경우), 승인된 프로토콜을 사용하여 마우스를 희생. </li><li> 70 % 에탄올로 euthanized 동물의 배를 습식과 복강을 엽니다. 개발 태아의 존재를 나타내는 주입 사이트는 각각의 자궁 호른 (그림 1A)의 길이를 따라 정렬 &quot;문자열에 구슬&quot;로 볼 수 있습니다. 가위를 사용하면, 두 자궁 뿔을를 제거 분리 개별적으로 주입 사이트를 잘라 (그림 1B)와 실내 온도 (RT)를 포함하는 100mm 배양 접시에 넣어 해부 매체 (DMEM 10 % 태아 소 혈청, 20 MM HEPES의 산도 7.4 60 μg / ML 페니실린, 스트렙토 마이신이 당연). </li><li> 포셉를 사용하여 자궁 (그림 1C)에서 각각의 배아 및 주변 세포막을 제거하고 신선한 해부 매체에서 그들을 놓으십시오. </li><li> 포셉를 사용하여 해부 현미경으로 각각의 배아를 분리. 개발이 단계에서, 태아는 정수리 난황, 연락처 deciduum 조직, 내장 난황과 양막합니다. 둘러싸인 양막은 태아와 직접 접촉에있는 투명한 막이다. 내장 난황은 양막과 정수리 부분 노른자의 색 사이에 위치하고 있으며 쉽게 배아를 육성 두드러진 혈관의 존재에 의해 E8.5 - E9.5의 배아에서 구별됩니다. 주변 점막에서 각 배아를 제거하고 여분의 혈액을 제거하기 위해 절개 미디어를 포함하는 새 접시에 개별적으로 전송할 수 있습니다. 발달 단계는 배아에서 배아와 새끼 사이 다를 수 있으며, 대표적인 E8.5 배아 및 대표 E9.5의 배아는 그림 1D 표시됩니다. </li><li> 해부 미디어 (앞의 4 단계에서 설명) 200 μl를 포함하는 1.5 ML eppendorf 튜브 각 배아를 전송합니다. </li></ol> 2. 절연 배의 균질화 <ol><li> 각 eppendorf 튜브에 200 UL의 볼륨 (DPBS 1X Dubbecco의 인산에 희석 살린 버퍼)에 Collagenase 유형 II의 20 단위를 추가합니다. </li><li> 부드럽게 20 분 100 rpm으로 37 ° C 통에 샘플을 흔들. </li><li> 세포의 대단히 짧은 시간을 혼란 pipetting으로 잘 Resuspend. </li><li> 1.5 ML eppendorf 튜브를 통해 위치 살균 셀 스트레이너 (40 μm의 메쉬 크기)의 위에 세포 현탁액을 적용합니다. </li><li> 즉시 분리를 완료 실온 셀 스트레이너 위에 1X DPBS 600 μl를 적용합니다. 스트레이너를 폐기하십시오. </li><li> 4 견본을 원심 분리기 ° C를 5 분 4,000 XG에. </li><li> 뜨는 폐기하십시오. </li><li> RT 1X의 DPBS 1 ML에서 펠렛을 Resuspend. </li><li> RT 1 분 4,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 알티 해부 미디어 200 μl의 펠렛을 Resuspend. </li><li> 배아 세포를 계산합니다. 평균 3-5 X 10 6 cells/E8.5 배아가 있습니다. </li></ol> 3. 크로스 링크 염색질 <ol><li> 1 %의 포름 알데히드의 최종 농도에 대한 200 μl 샘플에 37 % 포름 알데히드 5.6 μl를 추가합니다. </li><li> RT 10 분 샘플을 품어. </li><li> 4 ° C 3 분 4,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 80 μl / ML 테아제 억제제 칵테일 (PIC)를 포함하는 차가운 1X DPBS와 세포 Resuspend. </li><li> 4 견본을 원심 분리기 ° C를 3 분 4,000 XG에. </li><li> 뜨는 폐기하십시오. 이 단계에서는 샘플 -80에서 얼어 수 있습니다 ° C. 냉동, 가교 샘플 몇 달 동안 안정합니다. </li></ol> 4. Sonication <ol><li> RT SDS 용해 버퍼 (1 μl PIC/800 μl 전체 볼륨에서 갓 추가 PIC와 함께 50 MM 트리스 - HCL (산도 8.1), 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % SDS) 100 μl의 세포 펠렛을 Resuspend. resuspended 경우, resuspension을 촉진하기 위해 RT SDS의 용해 버퍼의 추가 100 UL를 추가합니다. pipetting과 전도로 잘 섞는다. </li><li> 10 분 얼음에 세포 현탁액을 품어. </li><li> 200 사이 Diagenode Bioruptor를 사용하여 500 basepairs에 전단 DNA에 lysed 세포를 Sonicate ™ UCD200 (5 분 X 8 회 : 높음 (320w) 전원을 30 초 on/30 초의 진폭 설정 해제). 샘플은 얼음 슬러리 둘러싸여 있어야합니다. 샘플 4 ° C 이상의 따뜻한하거나 동결하는 것을 허용하지 않습니다. 사용 가능한 sonicators 많은 종류가 있습니다. Sonication 조건은 약 500 BP의 길이에 교차 연결된 DNA의 전단의 결과 각 sonicator에 최적화된해야합니다. </li><li> 4 sonicated 샘플을 원심 분리기 ° C, 10 분 14,000 XG에. </li><li> 티새로운 eppendorf 튜브 얼음 사전 냉각에 뜨는를 ransfer. </li><li> 5 aliquots 최대로 sonicated 샘플을 나누십시오. 우리는 경험적으로 한 E8.5 배아가 5 aliquots로 나눌 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 작은 또는 큰 샘플 크기는 적절하게 크기를 조정하실 수 있습니다. 이 단계에서는 샘플은 -80에 저장할 수 있습니다 ° C 이상 사용까지. </li><li> 상호 링크가 거꾸로 될 때까지 6 단계 -20 ° C에서 입력 및 저장소로 사용하기 위해 예약 한 나누어지는. 1 μl/800에서 갓 추가 PIC를 포함하는 칩 희석 버퍼 (16.7 MM 트리스 - HCL (산도 8.1), 1.2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1.1 % 트리톤 X - 100, 167 MM NaCl 및 0.01 % SDS)에 10 배 다른 aliquots를 희석 μl 버퍼. </li></ol> 5. 사전 지우고 Immunoprecipitation <ol><li> 연어 - 정자의 DNA / 단백질 4 또는 아가로 오스 G - 50 %의 슬러리 ° C, 회전, 1 시간을위한 75 μl 사전 명확 희석 뜨는. 또는 단백질 G 비즈가 칩을 사용하는 항체에 의해 결정되어야 하나 단백질 중 하나를 사용하십시오. 단백질 G 비즈가 염소 항체 드나 마우스 IgG 항체에 대한 1 추천 반면, 예를 들면, 단백질 구슬은 토끼 항체 권장됩니다. 자세한 내용은 비드 제조 업체에 의해 만들어진 권장 사항을 참조하십시오. </li><li> 1 분에 대한 2500 XG 4 ° C에서 원심 분리기. </li><li> 새로운 사전 냉각 eppendorf 튜브에 뜨는를 전송합니다. </li><li> 사전 허가 나누어지는하는 항체 (4 μg / 샘플)을 추가하고 4 박 품어 ° C를 회전. </li></ol> 6. 염색질 단백질 - 비드 콤플렉스 워싱 <ol><li> ° C 회전 1 시간 4 각 유리병과 부화에 연어 정자는 DNA / 단백질 A 또는 G 아가로 오스 슬러리의 60 μl를 추가합니다. 위의 단계 3 미리 삭제에 사용되는 동일한 비드 유형을 사용합니다. </li><li> 1 분 1000 XG 4 ° C에서 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 뜨는을 제거하고 폐기. 얼음에서 DNA - 단백질 비드 복잡한 보관하십시오. </li><li> Resuspend과 같은 세척 버퍼 1, 2와 함께 아래의 감독 펠렛, 3, 4를 씻으십시오. 1-3 ° C가 이러한 버퍼와 세척이 4 수행해야 4 냉장되어야 버퍼 ° C. 와시 버퍼 4 실온에서 수행되어야 상온이 버퍼로 세척에 있어야 씻으십시오. 각 세차 적절한 온도에서 회전 5 분입니다. 4 ° C (세척 버퍼 네 세척을위한 실내 온도) 1 분 1000 XG에서 각 세척, 원심 분리기에 따라 다음 조심스럽게 대기음 또는 표면에 뜨는를 제거하십시오. </li></ol> 버퍼 1 : 낮은 소금 세척 버퍼 (20 MM 트리스 - HCL (산도 8.1), 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % 트리톤 X - 100 150 MM NaCl 및 0.1 % SDS), 1 ML X 2 씻는다. 버퍼 2 : 높은 염분 세척 버퍼 (20 MM 트리스 - HCL (산도 8.1), 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % 트리톤 X - 100 500 MM NaCl 및 0.1 % SDS), 1 ML X 2 씻는다. 버퍼 3 : LiCl 소금 세척 버퍼 (10 MM 트리스 - HCL (산도 8.1), 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % IGEPAL - CA630, 0.25 M LiCl과 1 % deoxycholic의 산성 (나트륨 소금)), 1 X 1 ML 씻으십시오. 버퍼 4 : TE 버퍼 (10 MM 트리스 - HCL (산도 8.1), 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)), 1 ML X 2 씻는다. 7. 염색질 - 항체 복합 용리 <ol><li> 신선한 용출 버퍼 (1 % SDS, 0.1 M NaHCO 3) 250 μl에 씻어 염색질 단백질 - 비드 복잡한을 Resuspend. 다음 회전 15 분 RT에서 품어 5 초에 대해 적극적으로 소용돌이로 샘플을. </li><li> RT 1 분 2,500 XG에 원심 분리기 새로운 eppendorf 튜브에 eluate를 전송합니다. </li><li> 1 단계와 2 단계를 반복하고 같은 eppendorf 튜브에 eluates을 결합. eluates는 상온에서 보관해야합니다. 이 단계를 완료되면, eluates가 더 사용하기 전까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 8. 크로스 링크를 바꾸게되면 DNA를 복구 <ol><li> 500 μl eluate (입력 컨트롤을 40 μl / ML) 20 μl 5 M NaCl을 추가합니다. </li><li> ° C 하루 4 시간을위한 물 목욕 65에서 eluates을 가열. </li><li> 각 샘플 (입력 컨트롤 포함) 10 μl는 DNA 조각의 크기를 확인 0.1-1 kbp를 스패닝 크기 표시 옆에있는 2 % 아가로 오스 겔에서 실행할 수 있습니다. DNA는 얼룩으로 나타납니다 아닌 날카로운 밴드 것입니다. 샘플의 나머지는 65 남아 수 있습니다 ° C 젤가 실행되는 동안. </li><li> QIAquick 젤 추출 키트 (Qiagen)를 사용하여 각 시료에서 DNA를 복구합니다. QIAquick의 스핀 열의와 500 μl의 시료에 이소프로판올 200 μl의 실리카 막과 DNA 흡착을 최적화하기 위해 600 μl QG 버퍼를 (키트에 제공)을 추가합니다. QG 버퍼는 시료의 산도 쉽게 결정을 허용하는 산도 표시기가 포함되어 있습니다. 샘플의 색상은 보라색에 노란색에서 전환하는 경우 (산도&gt; 7.5) 혼합 후, 시료와 혼합 3 M의 NaAcetate 10 μl (산도 5.2) 추가합니다. 이것은 열에있는 비즈에 바인딩 DNA를 극대화하기 위해 혼합물의 산도를 감소시킵니다. </li><li> 전에 칼럼을로드하는 모든 SDS의 침전물이 존재하는지 여부를 확인하기 위해 혼합물을 확인합니다. SDS 강수량이 발생한 경우에는 샘플로 예열한다42 ° C의 물 목욕 침전이 사라질 때까지. </li><li> QIAquick의 스핀 열 (키트에 보라색 열)로 혼합 700 μl를로드 1 분 14,000 XG에서 RT에서 원심 분리기. 진행하기 전에 칼럼에서를 통해 흐름을 삭제하고 샘플의 나머지와 함께이 단계를 반복합니다. </li><li> 열을 씻어 500 μl QG 버퍼를 추가합니다. 2 분 14,000 XG에서 RT에서 원심 분리기. 진행하기 전에 칼럼에서를 통해 흐름을 폐기하십시오. </li><li> 제조 업체의 지시에 따라 에탄올 것이 추가되었습니다하기 위해 PE 세척 버퍼 700 μl (키트에 공급)로 컬럼을 씻으십시오. 1 분 14,000 XG에서 RT에서 원심 분리기. 진행하기 전에 칼럼에서를 통해 흐름을 폐기하십시오. </li><li> 완전히 칼럼에서 PE 버퍼의 나머지 부분을 제거하기 위해 원심 분리 단계를 반복합니다. 을 통해 흐름과 수집 튜브를 폐기하십시오. </li><li> 60 μl EB 버퍼 (용출 버퍼 키트에서 제공)을 추가하여 새로운 eppendorf 튜브에 열을에서 Elute의 DNA. </li><li> 1 분 14,000 XG에 실온에서 원심 분리기. eluted DNA가 검출 때까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. 복구 재료의 260 신호는 일반적으로 나누어지는 당 ~ 6-7 UG 총 복구를 위해, 90-120 NG / UL의 농도를 나타냅니다. 그러나 이러한 샘플 280분의 260 비율은 RNA의 예제에있다는 것을 제안, 일반적으로&gt; 1.8입니다. 따라서 복구 DNA의 정확한 금액은 낮을 수 있습니다. </li></ol> 9. 복구된 DNA 분석 <ol><li> SDS는 PCR DNA 형성 촉매 효소의 활동을 방해할 수 있습니다. SDS는 PCR을 수행하기 전에 완전히 제거하여야한다. 1 분 14,000 XG 4에서 잔여 SDS와 원심 분리기 ° C을 촉진하기 위해 얼음에 DNA를 품어. 새로운 eppendorf tube.This 단계에 뜨는을 전송 것은 좋습니다. </li><li> DNA의 eluates은 기존의 PCR 또는 분석 각 시퀀스에 대한 구체적인 primers와 양적 실시간 PCR (Q - PCR)을 통해 검색하실 수 있습니다. 전체 DNA를 eluate 5-10 μl 한 PCR 또는 Q - PCR 반응에 사용할 수 있습니다. 입력 컨트롤 PCR은 다른 샘플의 크기와 비교하여 DNA의 5-10 배 희석과 함께 수행할 수 있습니다. PCR 및 Q - PCR 조건하지만, 다양, 시작 물질의 제한된 양을 추가 PCR 사이클이 필요합니다. 기존의 PCR 검출을 위해, 우리는 40주기 시작하며 필요에 따라 조정하는 것이 좋습니다. </li></ol> 10. 대표 결과 우리는 E8.5과 E9.5의 배아 (그림 2) 모두에서 칩을 수행하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 결과는 myogenin가 E8.5과 E9.5의 배아에서 myogenin 모터에 존재하는 것을 보여줍니다. 칩 정화의 DNAs은 기존의 PCR (그림 2A)와 양적 실시간 PCR (그림 2B)에 의해 분석되었다. 대조적으로, myogenin이 표현되지 않은 난황에서 myogenin 모터에 바인딩 myogenin의 징후가 없었다. 인터페론 - γ (IFNγ) myogenin 바인딩 사이트를 일치 시퀀스를 포함 발기인은, 부정적인 시퀀스 제어로 사용되었다. 예상했던대로, myogenin는 테스트를 조직 샘플의에서 IFNγ업자에 바인딩되지 않았습니다. 골격근에 엽 성의 전구 물질 있으며,, E8.5 9.5 배아에서 myogenin은 특히 somites (6,10 그림 3)에 표시됩니다. 따라서 결과는 myogenin가 E8.5과 E9.5에서 somites에 myogenin 모터에 바인딩된을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. E8.5 배아 해부. (A) 절연 자궁 호른 (상단 패널, 하단 패널에 표시 상위 확대). (B) 자궁 경적 개별 배아를 포함하는 개별 주입 사이트를 분리하는 가위로 잘라. (C) 공룡의 태아가 해부하는 동안 자궁에서 튀어나온. 화살표는 여전히 엑스트라 배아 조직의 적용 배아를 표시합니다. 같은 쓰레기에서 (D) 2 E8.5 배아. 왼쪽의 배아 선회하는 과정을 시작하지 않았습니다. 오른쪽에 배아가 돌고를 겪고 있습니다. 맨 오른쪽 - 대표 E9.5의 배아. <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 칩 분석은 E8.5과 E9.5의 배아에서 myogenin 모터에 바인딩 myogenin를 시연. myogenin 항체 또는 불특정 IgG가 전사의 시작 사이트를 -79에서 69 상대적으로 myogenin 모터의 일부를 증폭 primers로 수행된을 사용하여 칩 실험에서 정화 DNA의 5 UL의 (위) 기존의 PCR 분석되는 -12 또는 전사 시작 사이트의 ~ 1,075 BP 상류에 위치한 myogenin 바인딩 사이트를 일치하는 시퀀스를 포함하는 IFNγ 프로 모터의 일부를 증폭 primers에있는 myogenin 바인딩 사이트가 포함되어 있습니다. 사용 IFNγ의 프라이머 절차가 GAC TCA AGA CCC CGA GGC - 3 &#39;와 5&#39; - TGA GGA GGC TGG AGG AGG CC - 3&#39;5&#39; - GCT되었습니다. (A)에 사용되는 동일한 샘플 (아래) 정량 실시간 PCR 분석.표준 편차 - 데이터 입력 + /의 %로 꾸몄다 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. Myogenin 특별히 E8.5과 E9.5의 태아의 somites에 표시됩니다. myogenin의 현장 하이브리드화의 전체 마운트 somites에서 특정 mRNA 표현을 보여줍니다. 200 μm의 - E8.5 이미지의 크기 바. E9.5 이미지 크기 모음 - 500 μm의.

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E., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus-expressed+myogenic+determination+factors+require+E12+complex+formation+for+binding+to+the+myosin-light-chain+enhancer.">Baculovirus-expressed myogenic determination factors require E12 complex formation for binding to the myosin-light-chain enhancer.</a> Eur J Biochem. 198, 187-193 (1991).</li><li>Chakraborty, T., Brennan, T., Olson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+trans-activation+of+a+muscle-specific+enhancer+by+myogenic+helix-loop-helix+proteins+is+separable+from+DNA+binding.">Differential trans-activation of a muscle-specific enhancer by myogenic helix-loop-helix proteins is separable from DNA binding.</a> J Biol Chem. 266, 2878-2882 (1991).</li><li>French, B. A., Chow, K. L., Olson, E. N., Schwartz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterodimers+of+myogenic+helix-loop-helix+regulatory+factors+and+E12+bind+a+complex+element+governing+myogenic+induction+of+the+avian+cardiac+alpha-actin+promoter.">Heterodimers of myogenic helix-loop-helix regulatory factors and E12 bind a complex element governing myogenic induction of the avian cardiac alpha-actin promoter.</a> Mol Cell Biol. 11, 2439-2450 (1991).</li><li>Brennan, T. J., Chakraborty, T., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+of+the+myogenin+basic+region+identifies+an+ancient+protein+motif+critical+for+activation+of+myogenesis.">Mutagenesis of the myogenin basic region identifies an ancient protein motif critical for activation of myogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 5675-5679 (1991).</li><li>Lassar, A. B., Davis, R. L., Wright, W. E., Kadesch, T., Murre, C., Voronova, A., Baltimore, D., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+activity+of+myogenic+HLH+proteins+requires+hetero-oligomerization+with+E12/E47-like+proteins+in+vivo.">Functional activity of myogenic HLH proteins requires hetero-oligomerization with E12/E47-like proteins in vivo.</a> Cell. 66, 305-315 (1991).</li><li>Chakraborty, T., Brennan, T. J., Li, L., Edmondson, D., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+homooligomerization+contributes+to+the+dependence+of+myogenin+on+E2A+products+for+efficient+DNA+binding.">Inefficient homooligomerization contributes to the dependence of myogenin on E2A products for efficient DNA binding.</a> Mol Cell Biol. 11, 3633-3641 (1991).</li><li>Cserjesi, P., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenin+induces+the+myocyte-specific+enhancer+binding+factor+MEF-2+independently+of+other+muscle-specific+gene+products.">Myogenin induces the myocyte-specific enhancer binding factor MEF-2 independently of other muscle-specific gene products.</a> Mol Cell Biol. 11, 4854-4862 (1991).</li><li>Braun, T., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+four+human+muscle+regulatory+helix-loop-helix+proteins+Myf3-Myf6+exhibit+similar+hetero-dimerization+and+DNA+binding+properties.">The four human muscle regulatory helix-loop-helix proteins Myf3-Myf6 exhibit similar hetero-dimerization and DNA binding properties.</a> Nucleic Acids Res. 19, 5645-5651 (1991).</li><li>Serna, d. e. l. a., L, I., Ohkawa, Y., Berkes, C. A., Bergstrom, D. A., Dacwag, C. S., Tapscott, S. J., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+targets+chromatin+remodeling+complexes+to+the+myogenin+locus+prior+to+forming+a+stable+DNA-bound+complex.">MyoD targets chromatin remodeling complexes to the myogenin locus prior to forming a stable DNA-bound complex.</a> Mol Cell Biol. 25, 3997-4009 (2005).</li><li>Blais, A., Tsikitis, M., Acosta-Alvear, D., Sharan, R., Kluger, Y., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+initial+blueprint+for+myogenic+differentiation.">An initial blueprint for myogenic differentiation.</a> Genes Dev. 19, 553-569 (2005).</li><li>Cao, Y., Kumar, R. M., Penn, B. H., Berkes, C. A., Kooperberg, C., Boyer, L. A., Young, R. A., Tapscott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+gene-specific+analyses+show+distinct+roles+for+Myod+and+Myog+at+a+common+set+of+promoters.">Global and gene-specific analyses show distinct roles for Myod and Myog at a common set of promoters.</a> EMBO J. 25, 502-511 (2006).</li><li>Ohkawa, Y., Yoshimura, S., Higashi, C., Marfella, C. G., Dacwag, C. S., Tachibana, T., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenin+and+the+SWI/SNF+ATPase+Brg1+maintain+myogenic+gene+expression+at+different+stages+of+skeletal+myogenesis.">Myogenin and the SWI/SNF ATPase Brg1 maintain myogenic gene expression at different stages of skeletal myogenesis.</a> J Biol Chem. 282, 6564-6570 (2007).</li><li>Davie, J. K., Cho, J. H., Meadows, E., Flynn, J. M., Knapp, J. R., Klein, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+gene+selectivity+of+the+myogenic+basic+helix-loop-helix+transcription+factor+myogenin+in+embryonic+muscle.">Target gene selectivity of the myogenic basic helix-loop-helix transcription factor myogenin in embryonic muscle.</a> Dev Biol. 311, 650-664 (2007).</li><li>Metivier, R., Penot, G., Hubner, M. R., Reid, G., Brand, H., Kos, M., Gannon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor-alpha+directs+ordered,+cyclical,+and+combinatorial+recruitment+of+cofactors+on+a+natural+target+promoter.">Estrogen receptor-alpha directs ordered, cyclical, and combinatorial recruitment of cofactors on a natural target promoter.</a> Cell. 115, 751-763 (2003).</li><li>Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).</li></ol>

동물 실험은 매사 추세츠 의과 대학 IACUC 대학에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.

설명 칩 프로토콜에서는, 우리는 myogenic 조절기 myogenin가 단일 E8.5과 E9.5의 배아에있는 골격근 전구체 조직에서 myogenin 모터와 관련된 것을 보여줍니다. 이전 연구는 광범위 11-20 타겟 유전자 규제 시퀀스의 관련 부분을 인코딩 체외 번역 또는 bacterially 생산 myogenin 및 radiolabeled DNA에 활용하여 체외 겔 이동 실험의 초기부터 시작 시퀀스를 포함하는 E 상자에 바인딩...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>ChIP Assay Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Upstate Cell Signaling Solutions, Millipore</td>
<td>17-295</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase Type II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17101015</td>
<td>Dilution by 1 x PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s modified eagle medium (DMEM) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Labs, Invitrogen</td>
<td>12100-061</td>
<td>High glucose content</td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s phosphate buffered saline 1X (DPBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Labs, Invitrogen</td>
<td>14190-144</td>
<td>Calcium chloride free, Magnesium chloride free</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech, Inc.</td>
<td>35-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel extraction kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>QIAquick</td>
<td>28704</td>
<td>50 reaction kit</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin/streptomycin stock solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Labs, Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5000 &mu;g/ml concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P8340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Salmon sperm DNA /Protein A agarose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>16-157</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>myogenin antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
<td>sc-576</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal rabbit IgG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>12-370</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Platinum PCR Supermix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11306-016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GoTaq Q-PCR master mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>A6001</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

chromatin immunoprecipitation assay for tissue-specific genes using early-stage mouse embryos

1-3 살아있는 세포의 맥락에서 발생하는 염색질의 상호 작용 : 염색질 immunoprecipitation (칩)은 단백질을 식별하는 강력한 도구입니다. 이 기술은 널리 기본 조직에서 낮은 정도 조직 문화 세포에 악용하고있다. 특히 개발 초기 시간에 쥐 배아 조직에 칩의 응용 프로그램, 조직의 한계와 배아의 세포와 조직 유형의 이질에 의해 복잡합니다. 여기 dissociated 배아 하루 8.5 (E8.5) 배아를 사용하여 칩을 수행하는 방법을 제시한다. 염색질 상호 작용 : 단일 E8.5 배아에서 가지각색 염색질은 컨트롤과 특정 단백질의 조사를 위해 조사 충분한 자료를 수있는 다섯 aliquots에로까지 나눌 수 있습니다. 조직 특정 유전자 발현 프로그램의 사양 중 염색질 상호 작용 : 우리는 단백질을 문서로 시작이 기술을 활용합니다. 모든 상호 작용이 발생 여부를 구별하지 않고 염색질 상호 작용의 일부, 또는 하나의 셀 타입 (S) : 결과가 단백질의 검출이기 때문에 배아에서 세포 유형의 이질 반드시이 기술의 응용 프로그램을 제한합니다. 그러나, 도중에 조직 특정 유전자 검사 또는 조직 특정 유전자 발현의 발병 다음 두 가지 이유 때문에 가능합니다. 첫째, 조직 구체적인 요인 immunoprecipitation 반드시 요소가 표현되는 세포 유형에서 염색질를 분리합니다. 둘째, coactivators 및 유전자 활성화와 관련된 포스트 translational 수정을 포함 histones의 immunoprecipitation은 유전자가되는 세포 유형의 유전자와 유전자의 규제 시퀀스에서 찾을 수 있어야하거나 활성화되었습니다. 이 기술은 대부분의 조직 특정 유전자 활성화 이벤트의 연구에 적용해야합니다. 예제는 아래에서 설명에서 우리는 골격근 특정 유전자 프로 모터에 바인딩 요소를 검토 E8.5과 E9.5 마우스 배아를 활용. 트렁크와 사지의 골격 근육이 형성하는 전구체 조직 아르 Somites는 E8.5 - 9.5 4,5에서 존재하고 있습니다. Myogenin는 골격 근육 차별 6-9에 필요한 규제 요소입니다. 데이터 myogenin가 E8.5과 E9.5의 배아 자체 발기인와 관련된 것을 보여줍니다. myogenin에만 개발 6,10이 단계에서 somites 표현이기 때문에, 데이터 자체 모터와 myogenin 상호 작용은 이미 E8.5 태아의 골격 근육 전구체 세포에서 발생한 것을 나타냅니다.

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Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

우리는 마우스 배아 조직에서 조직 특정 유전자 발현의 시작하는 동안이나 이후에 조직 특정 유전자의 상호 작용 요소를 식별하는 방법은 염색질의 immunoprecipitation (칩)을 보여줍니다. 그것이 정상적인 배아 발달 동안 발생으로이 프로토콜은 조직 특정 유전자 활성화의 연구에 대해 광범위하게 적용되어야합니다.

초기 마우스 배아를 사용하는 조직 특정 유전자에 대한 염색질의 Immunoprecipitation 분석

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

chromatin-immunoprecipitation-assay-for-tissue-specific-genes-using

Research

JoVE Journal

Biology

18.0K 조회수.  University of Massachusetts Medical School. 우리는 마우스 배아 조직에서 조직 특정 유전자 발현의 시작하는 동안이나 이후에 조직 특정 유전자의 상호 작용 요소를 식별하는 방법은 염색질의 immunoprecipitation (칩)을 보여줍니다. 그것이 정상적인 배아 발달 동안 발생으로이 프로토콜은 조직 특정 유전자 활성화의 연구에 대해 광범위하게 적용되어야합니다.

비디오: Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development. These proteins have been shown to be critical for cell fate determination, cell migration, and formation of neural circuits. Neuronal induction and patterning involve bone morphogenetic protein (BMP), sonic hedgehog (SHH), fibroblast growth factor (FGF), among others. In particular, the expression pattern of Fgf8 is in close proximity to regions expressing BMP4 and SHH. This expression pattern is consistent with developmental interactions that facilitate patterning in the telencephalon.

Here we provide a visual demonstration of a method in which an in ovo preparation can be used to test the effects of Fgfs in the formation of the forebrain. Beads are coated with protein and placed in the developing neural tube to provide sustained exposure. Because the procedure uses small, carefully placed beads, it is minimally invasive and allows several beads to be placed within a single neural tube. Moreover, the method allows for continued development so that embryos can be analyzed at a more mature stage to detect changes in anatomy and in neural patterning. This simple but useful protocol allows for real time imaging. It provides a means to make spatially and temporally limited changes to endogenous protein levels.

A variety of growth factors and proteins interact to induce cells to take on different cell fates during development. Here we demonstrate the use of an in ovo preparation to address possible interactions between different proteins in development by placing beads on E2.5 chick embryos.

초기 치킨 태아의 성장 팩터 - 코팅 비즈 배치

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

연구

생물학

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental factors that might result in epigenetic alterations of gene expression and other molecular pathology. Traditionally, however, expression studies in postmortem brain were confined to quantification of mRNA or protein. The limitations encountered in postmortem brain research   such as variabilities in autolysis time and tissue integrities   are also likely to impact any studies of higher order chromatin structures. However, the nucleosomal organization of genomic DNA   including DNA:core histone binding - appears to be largely preserved in representative samples provided by various brain banks. Therefore, it is possible to study the methylation pattern and other covalent modifications of the core histones at defined genomic loci in postmortem brain. Here, we present a simplified native chromatin immunoprecipitation (NChIP) protocol for frozen (never-fixed) human brain specimens. Starting with micrococcal nuclease digestion of brain homogenates, NChIP followed by qPCR can be completed within three days. The methodology presented here should be useful to elucidate epigenetic mechanisms of gene expression in normal and diseased human brain.

Until recently, expression studies on human brain were limited to quantification of RNA or protein. With the chromatin immunoprecipitation techniques described in this paper, it will be possible to map histone methylation and other epigenetic regulators of gene expression in postmortem brain.

인간 두뇌 조직에 대한 염색질 어세이

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

인간 배아 줄기 세포에서 염색질의 Immunoprecipitation

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

인간의 세포에서 활성 유전자 발현의 어세 동적 히스톤 수정을 염색질 Immunoprecipitation (칩)

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell nuclei1. The technique uses DNA probes with unique sequences that hybridize to whole chromosomes or specific chromosomal regions, and serves as a powerful adjunct to classic cytogenetics. For instance, many earlier studies reported the frequent detection of increased chromosome aberrations in leukemia patients related with benzene exposure, benzene-poisoning patients, and healthy workers exposed to benzene, using classic cytogenetic analysis2. Using FISH, leukemia-specific chromosomal alterations have been observed to be elevated in apparently healthy workers exposed to benzene3-6, indicating the critical roles of cytogentic changes in benzene-induced leukemogenesis. 
Generally, a single FISH assay examines only one or a few whole chromosomes or specific loci per slide, so multiple hybridizations need to be conducted on multiple slides to cover all of the human chromosomes. Spectral karyotyping (SKY) allows visualization of the whole genome simultaneously, but the requirement for special software and equipment limits its application7. Here, we describe a novel FISH assay, OctoChrome-FISH, which can be applied for Chromosomics, which we define here as the simultaneous analysis of all 24 human chromosomes on one slide in human studies, such as chromosome-wide aneuploidy study (CWAS)8. The basis of the method, marketed by Cytocell as the Chromoprobe Multiprobe System, is an OctoChrome device that is divided into 8 squares, each of which carries three different whole chromosome painting probes (Figure 1). Each of the three probes is directly labeled with a different colored fluorophore, green (FITC), red (Texas Red), and blue (Coumarin). The arrangement of chromosome combinations on the OctoChrome device has been designed to facilitate the identification of the non-random structural chromosome alterations (translocations) found in the most common leukemias and lymphomas, for instance t(9;22), t(15;17), t(8;21), t(14;18)9. Moreover, numerical changes (aneuploidy) in chromosomes can be detected concurrently. The corresponding template slide is also divided into 8 squares onto which metaphase spreads are bound (Figure 2), and is positioned over the OctoChrome device. The probes and target DNA are denatured at high-temperature and hybridized in a humid chamber, and then all 24 human chromosomes can be visualized simultaneously. 
OctoChrome FISH is a promising technique for the clinical diagnosis of leukemia and lymphoma and for detection of aneuploidies in all chromosomes. We have applied this new Chromosomic approach in a CWAS study of benzene-exposed Chinese workers8,10.

A novel fluorescence in situ hybridization (FISH) method that simultaneously examines both numerical and structural chromosome alterations, particularly the specific chromosomal translocations associated with leukemia and lymphoma, of all 24 human chromosomes on a single device in one hybridization, is described.

Chromosomics : 수치과 구조 변경의 탐지는 모두 24 인간의 염색체로 동시에 소설 OctoChrome 생선 분석을 사용

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at different developmental stages. Epigenetic regulation contributes to a broad spectrum of biological processes, including cellular differentiation during embryonic development and homeostasis in adulthood. A critical strategy in epigenetic studies is to examine how various histone modifications and chromatin factors regulate gene expression. To address this, Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) is used widely to obtain a snapshot of the association of particular factors with DNA in the cells of interest.
ChIP technique commonly uses cultured cells as starting material, which can be obtained in abundance and homogeneity to generate reproducible data. However, there are several caveats: First, the environment to grow cells in Petri dish is different from that in vivo, thus may not reflect the endogenous chromatin state of cells in a living organism. Second, not all types of cells can be cultured ex vivo. There are only a limited number of cell lines, from which people can obtain enough material for ChIP assay.
Here we describe a method to do ChIP experiment using Drosophila tissues. The starting material is dissected tissue from a living animal, thus can accurately reflect the endogenous chromatin state. The adaptability of this method with many different types of tissue will allow researchers to address a lot more biologically relevant questions regarding epigenetic regulation in vivo1, 2. Combining this method with high-throughput sequencing (ChIP-seq) will further allow researchers to obtain an epigenomic landscape.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Recently high-throughput sequencing technology has greatly increased sensitivity of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiment and prompted its application using purified cells or dissected tissue. Here we delineate a method to use ChIP technique with Drosophila tissue, which can address the endogenous chromatin state in a well-characterized biological system.

사용 염색질 Immunoprecipitation (CHIP) Drosophila 조직

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used method for determining the interactions of different proteins with DNA in chromatin of living cells. Examples include sequence-specific DNA binding transcription factors, histones and their different modification states, enzymes such as RNA polymerases and ancillary factors, and DNA repair components. Despite its ubiquity, there is a lack of up-to-date, detailed methodologies for both bench preparation of material and for accurate analysis allowing quantitative metrics of interaction. Due to this lack of information, and also because, like any immunoprecipitation, conditions must be re-optimized for new sets of experimental conditions, the ChIP assay is susceptible to inaccurate or poorly quantitative results.
Our protocol is ultimately derived from seminal work on transcription factor:DNA interactions1,2 , but incorporates a number of improvements to sensitivity and reproducibility for difficult-to-obtain cell types. The protocol has been used successfully3,4 , both using qPCR to quantify DNA enrichment, or using a semi-quantitative variant of the below protocol.
This quantitative analysis of PCR-amplified material is performed computationally, and represents a limiting factor in the assay. Important controls and other considerations include the use of an isotype-matched antibody, as well as evaluation of a control region of genomic DNA, such as an intergenic region predicted not to be bound by the protein under study (or anticipated not to show changes under the experimental conditions). In addition, a standard curve of input material for every ChIP sample is used to derive absolute levels of enrichment in the experimental material. Use of standard curves helps to take into account differences between primer sets, regardless of how carefully they are designed, and also efficiency differences throughout the range of template concentrations for a single primer set. Our protocol is different from others that are available5-8 in that we extensively cover the later, analysis phase.

We describe a robust method for chromatin immunoprecipitation using primary T cells. The method is founded on standard approaches, but uses a specific set of conditions and reagents that improve efficiency for limited a quantities of cells. Importantly, a detailed description of the data analysis phase is presented.

바이오 매스의 제한 금액을 사용하여 효율적으로 염색질 immunoprecipitation의

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

높은 처리량 시퀀싱을위한 고품질 염색질 면역 침전의 DNA 템플릿의 생성 (칩 SEQ)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

에서 초기 단계의 배아의 효율적이고 신속한 분리<em&gt; 애기 장대</em&gt; 씨앗

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Zebrafish의 태아의 조직 특이 형광의 반 자동화 이미징

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...