건강 그란츠 R01DC10146/R01DC010397 국립 연구소에 의해 지원 작품, P30 DC006276 연구 코어를 NIDCD하고, 헤리. 그 내용은 저자의 단독 책임이며 반드시 NIH 또는 헤리의 공식 견해를 대변하지 않습니다. 저자는 관심에 대한 기존 또는 잠재 갈등을 선언하지 않습니다.

1. OHCs의 분리 <ol><li> 기니 돼지, 마우스 또는 포유류의 동물 모델에서 관자놀이 뼈를 수확하여이 절차를 시작합니다. </li><li> 다음, 달팽이관을 폭로하기 위해 탐문 니퍼를 사용하여 관자놀이 뼈를 열고 Leibovitz L - 15에 젖어. 뼈다귀 쉘 그대로 유지, 신중하게 뼈 초과를 제거합니다. 이 모든 포유 동물 종의 시간적 뼈를에 적용되는 일반적인 절차입니다 반면에 아주 작은 동물로부터 현세의 뼈를을 상대할 때는 기술에 사소한 변화가 필요할 수 있습니다. 오래된 동물 불라는 일반적으로 프로 시저에 추가 합병증을 소개하고, calcified입니다. </li><li> 마이크로 관찰에서 달팽이관의 꼭대기의 영역을 열고 선의 vascularis 및 # 11 메스 블레이드의 끝부분을 사용하여 나선형 인대를 제거 마이크로 지점 선택하고 고급 트위터. </li><li> 트위터를 사용하여 달팽이 modiolus에서 Corti의 오르간을 벗어, 5 분 실온에서 L - 15 1mg/ml collagenase에 넣어. </li><li> 달팽이관의 기저 전환에서 OHCs이 필요한 경우, 선택과 달팽이관의 기반을 덮고있는 뼈다귀 껍질을 제거하고, Corti의 오르간을 제거하기 전에 메스 블레이드를 사용하여 측두 골의 소용돌이를 구분한다. </li><li> 50 μL 해밀턴 주사기를 사용하여 녹화 실로 Corti의 오르간을 전송합니다. 그 후 바늘을 통해 역류하여 세포를 떼어 놓다. </li></ol> 2. 실험 설정 <ol><li> 외부 교류 전기장 (EAEF) 발생기와 이미지 캡처 시스템 (그림 1) 자신의 링크 다이어그램. 제어 회로는 특별히 하우스 귀 연구소의 엔지니어링 핵심 구현되었습니다. </li><li> 실험에 사용된 실험 설정은 대체 LED 기반 조명 시스템 Axiovert 135TV 거꾸로 현미경 (자이스 혈구, 손우드, NY)로 구성되어 있습니다 (하이 파워 LED 시스템 - 36A​​D3500, 광속 기술, 캠벨, CA), 두 전자 micromanipulators (Eppendorf &quot;Patchman&quot;, 독일), 켈러 포트에 PC 제어 울트라 고속 Photron Fastcam X 1024 PCI 카메라 (Photron 미국 주식 회사)와 trinocular 포트에 추가 일반 CCD 카메라. Fastcam 카메라는 높은 주파수 (최대 100,000 프레임)와 고해상도 (예를 들어, 1024 X 1024 1000 FPS에서 픽셀, 10,000 프레임, 18000 FPS에서 384 X 96에서 512 X 128 등)에서 이미지를 캡처할 수 있습니다. CCD 카메라가 다른 모니터에 연결되어있는 반면, 고속 카메라에서 제공하는 이미지는 직접 PC 모니터에서 관찰됩니다. 아날로그 저전력 및 높은 전력 디지털 : LED 기반 조명 시스템은 두 개의 서로 다른 모드에서 작동합니다. 모든 예비 절차 (전극의 위치, 세포 위치, 초점 등)은 저전력 아날로그 모드를 사용하여 수행됩니다. 높은 전력 조명은 카메라 셔터의 조리개에 의해 전환 후 방열을 촉진, 셔터 폐쇄에 의해 꺼져 있습니다. 또한, 동일한 PC에서 실행, 하우스 이어 연구소 공학 코어에서 개발된 만든 소프트웨어는, 고속 카메라, LED 기반 조명 시스템 및 EAEF의 방아쇠를 제어합니다. 전면 포트에 종래의 디지털 카메라는 필요에 따라 여전히 프레임 수 있습니다. (그림 2 A). </li><li> 전극 (0.8 mm의 팁 거리 두 개의 0.25 mm 지름 자세 와이어)은 전자 micromanipulators 중 하나를 사용하여 위치를 주도하고 있습니다. 전극들의 위치는 시각과 미세한 이미지를 통해 모니터링되며 이미지의 초점 평면의 변화는 전극이 실험 챔버의 바닥을 만진 것을 나타냅니다. 처음에는, 전기 분야는 외부 전극을 사용하여 보정합니다. 이 전극은 전기 분야의 &quot;지도&quot;를 생성, 다른 지점에서 전위를 측정합니다. 단일 절연 외부 머리카락 세포가 적용 EAEF하기 위해 세로 축 평행으로 전극의 팁 사이에 위치하는 경우, 그것은 elongating과 전기장의 동일한 주파수로 단축 이동합니다. 세포가 필드에 수직 배치하는 경우 OHC 응답 (휨)의 다른 종류의 관찰과 조사 수 있습니다. (그림 2 B) </li></ol> 3. EAEF의 자극 및 이미지 캡처 <ol><li> 네 가지 자극 프로토콜은 (그림 3) 선택됩니다 <ol><li> 지속적인 단일 주파수 (그림 3 A). 자극 모드, 주파수, 진폭 및 파도 유형이 집에서 만든 제어 소프트웨어 (빨간 동그라미)를 사용하여 선택할 수 있습니다. </li><li> bursted 단일 주파수 (그림 3 B). 버스트 사이의 파열 및 공백의 길이도 선택할 수 있습니다. </li><li> 선형 스위프 (그림 3 C). 초기 및 최종 주파수는 선택할 수 있습니다. </li><li> 멀티 자극 (그림 3 D). 단일 주파수 및 선형 지나간다는 하나의 실험에서 조합하여 사용할 수 있습니다. 해당 매개 변수를 선택한 후, 컨트롤 소프트웨어는 시스템을 구성하고 연산자에서 하나의 버튼을 클릭하여 가벼운 동기화 비디오 녹화 및 세포 자극을 시작하실 수 있습니다컴퓨터 화면. </li></ol></li><li> 이미지는 높은 주파수에서 추가 분석을 위해 AVI 형식으로 캡처됩니다. </li></ol> 4. 대표 결과 <ol><li> 이 영화에 두 개의 분리된 바깥쪽 세포는 종축에, 그들이 병렬 또는 횡단하는 것입니다 외부 교류 전기 분야, 각각과 자극을 받고있는 길이 또는 곡률의 변화를 보여줍니다. (동영​​상 # 2). </li><li> OHCs 운동성이있는 응답 ProAnalyst 소프트웨어 (Xcitex 주식 회사, 캠브리지, MA)를 사용하여 라인을 분석하고 있습니다. 이 소프트웨어에서 &quot;기능 추적&quot;기능은 두 지점 프레임으로 프레임 (그림 4) 사이의 거리를 제공합니다. 그리고 세포 (기저 극, 녹색)의 기본, 꼭대기 (붉은 색 Cuticular 판)에서 선택된 지점 사이의 거리를 단축 셀 동안 작고이며, 세포 연신율과 함께 증가합니다. 영화는 프레임간에게 길이의 변화를 분석하는 소프트웨어를 보여줍니다. 이미지의 하단에있는 패널은 운동의 흔적을 보여줍니다. 이 예제에서는 길이의 전체 변화는 6.5 픽셀에 대해서입니다. </li><li> ProAnalyst 소프트웨어에서 &quot;컨투어 추적&quot;기능은 셀 가장자리를 감지하고 자동으로 광학과 (그림 5)의 영역을 측정할 수 있습니다. </li><li> 폴리스티렌 microspheres 무작위로 목욕 솔루션에 추가되고 단단히 플라즈마 막 (그림 6)에 첨부합니다. 다른 microspheres 동시에 선택할 수 있으며, 소프트웨어가 자동으로 모두 프레임으로 프레임을 추적할 수 있습니다. 이러한 방법으로, 세포는 섹션에 나누어 각 섹션의 운동성 독립적으로 평가할 수있다. (그림 6) </li><li> 선택하여 microspheres은 셀 이미지의 측면 가장자리에 위치하고, 각 세그먼트의 길이 변화와 하나의 세그먼트 존중의 각도 변경 (벤딩) 기타도 독립적으로 평가할 수있다. (그림 6B) </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. EAEF 생성기 및 이미지 캡처 시스템과 함께 해당 링크 다이어그램. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig2.jpg" alt="그림 2"/> 실험 설정의 그림 2.) 그림. 전극과 하나의 OHC 전기 필드의 세로 축 병렬로 그들 사이에 위치를 묘사 만화로 현미경 단계의 B) 세부. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. 단일 주파수 자극에 대해 구성된 수제 제어 소프트웨어의) 사용자 인터페이스를 제공합니다. 선택한 매개 변수는 빨간색으로 동그라미 있습니다. B) 집에서 만든 제어 소프트웨어의 사용자 인터페이스는 버스트 단일 주파수 자극에 대한 구성. 선형 스위프 자극에 대해 구성된 집에서 만든 제어 소프트웨어의 C) 사용자 인터페이스를 제공합니다. 멀티 자극에 대해 구성된 수제 제어 소프트웨어의 D) 사용자 인터페이스를 제공합니다. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig4.jpg" alt="그림 4"/> 그림 4. 기본 (녹색)과 ProAnalyst 소프트웨어의 &#39;기능 추적 &quot;기능을 이용하여 각각의 셀,의 꼭대기 (적색)에서 선택한 두 지점과 OHC의 싱글 프레임. 세포 아래의 곡선은 전기 자극과 관련된 선택된 지점 사이의 거리에있는 정기적인 변화를 보여줍니다. 수직 막대 다른 프레임을 이동하는 것은 개별적인 분석을 위해 선택할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig5.jpg" alt="그림 5"/> 그림 5. ProAnalyst의 &quot;컨투어 추적&quot;기능은 셀 가장자리를 감지하고 자동으로 광학 부분의 영역을 측정합니다. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig6.jpg" alt="그림 6"/> 그림 6. 폴리스티렌 microspheres (위) 및 microspheres 개별적으로 (아래)을 선택 5가 동일한 이미지로 장식된 격리 OHC의) 캡처한 이미지. 다른 색상은 각 microsphere에 할당되었고, 그들의 변위는 개별적으로 자동으로 프레임에서 추적 프레임 수, 분석 및 비교. B) 임의의 길이의 세그먼트 microspheres은 세포의 가장자리에 위치한 폴리스티렌을 선택하여 정의될 수 있으며,이 세그먼트의 길이의 변화뿐만 아니라 다른 하나의 세그먼트 존중의 방향 변경 (세포 굽힘) 자동으로 프레임을 평가할 수 이미지 분석 소프트웨어 프레임. 영화 1. 실험용 돼지 OHCs의 격리가. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2965/2965_Movie1_web.mov">비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오</a> 영화 2. 전형적인 electromotility과 굽힘 반응을 보여주는 EAEF에 OHCs의 평행과 수직이. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2965/2965_Movie2_web.mov">비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오</a>

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	<li>Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+insights+into+the+morphogenesis+of+inner+ear+hair+cells.">Genetic insights into the morphogenesis of inner ear hair cells.</a> Nat Rev Genet. 5, 489-498 (2004).</li><li>Ashmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+outer+hair+cell+motility.">Cochlear outer hair cell motility.</a> Physiol Rev. 88, 173-210 (2008).</li><li>Dallos, P., Fakler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prestin,+a+new+type+of+motor+protein.">Prestin, a new type of motor protein.</a> Nature Rev. Mol. Cell Biol. 3, 104-111 (2002).</li><li>Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+outer+hair+cell+bending+in+an+external+electrical+field.">Cochlear outer hair cell bending in an external electrical field.</a> Biophys. J. 73, 1665-1672 (1997).</li><li>Matsumoto, N., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+Prestin-Dependent+and+Prestin-Independent+Components+from+Complex+Motile+Responses+in+Guinea+Pig+Outer+Hair+Cells.">Extraction of Prestin-Dependent and Prestin-Independent Components from Complex Motile Responses in Guinea Pig Outer Hair Cells.</a> Biophys J. 89, 4343-4351 (2005).</li><li>Matsumoto, N., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prestin-dependent+and+prestin-independent+motility+of+guinea+pig+outer+hair+cells.">Prestin-dependent and prestin-independent motility of guinea pig outer hair cells.</a> Hear Res. 208, 1-12 (2005).</li><li>Ashmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+remarkable+cochlear+amplifier.">The remarkable cochlear amplifier.</a> Hear Res. 266, 1-17 (2010).</li><li>Kitani, R., Kakehata, S., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motile+responses+of+cochlear+outer+hair+cells+stimulated+with+an+alternating+electrical+field.">Motile responses of cochlear outer hair cells stimulated with an alternating electrical field.</a> Hearing Research. , (2011).</li><li>Dallos, P., Evans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+outer+hair+cell+motility:+corrections+and+addendum.">High-frequency outer hair cell motility: corrections and addendum.</a> Science. 268, 1420-1421 (1995).</li><li>Frank, G., Hemmert, W., Gummer, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+dynamics+of+high-frequency+electromechanical+transduction+in+outer+hair+cells.">Limiting dynamics of high-frequency electromechanical transduction in outer hair cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 4420-4425 (1999).</li><li>Santos-Sacchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+frequency+limit+and+phase+of+outer+hair+cell+motility:+effects+of+the+membrane+filter.">On the frequency limit and phase of outer hair cell motility: effects of the membrane filter.</a> J. Neurosci. 12, 1906-1916 (1992).</li><li>Inou&#233;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Video Microscopy. , (1986).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 제시 실험 방법은 세포의 움직임에 어떤 제한없이 kHz에서 범위에서 OHC 운동성이있는 응답을 추정 수 있습니다. 다른 자극 프로토콜, 추가적인 마커 (microspheres)은 전기장에 대하여 세포의 방향에 잘 변화로, 그것이 가능한 이전에 액세스할 세부 수준 OHC의 운동성의 새로운 측면을 조사합니다. 다른 방법은, 예를 들어 photodiodes 9 레이저 도플러 vibrometry 10을 사용 이들은 세포?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> Leibovitz의 L - 15 </td><td> Gibco </td><td> 21,083 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase (타입 4) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> C5138 </td><td> L - 15 1mg/mL </td></tr></tbody></table>

investigating outer hair cell motility with a combination of external alternating electrical field stimulation and high-speed image analysis

OHCs는 Corti, 포유류의 내이 (内耳) 안에있는 청각 기관의 오르간에 위치하고 원통형 sensorimotor 세포입니다. 이름은 &quot;세포는&quot;stereocilia, 소리 에너지를 1 감지 및 전달을위한 중요한 요소들의 특징 혀끝의 번들에서 유래. OHCs 변경할 수있는 형태를 연장하다 단축하고, 벤드 -에, 전기 기계 및 화학 자극에 응답하여, 모터의 응답이 음향 신호의 증폭 달팽이 2 중요 간주됩니다. I) electromotility, 일명 빠른 운동성, 밀도 OHC 플라즈마 막의 포장 모터 단백질의 전기 구동 conformational 변화에서 파생 마이크로초 범위의 길이 변경, II) 느린 운동성,의 모양 변경 : OHC의 자극은 두 가지 운동성이있는 답변을 유도 초 밀리초는 cytoskeletal 개편 2, 3을 포함하는 범위입니다. OHC 벤딩은 측면 플라즈마 막, 또는 그 모터 단백질 (예를 들어, 세포의 긴 축에 전기 현장 직각 포함) 4 비대칭 전기 자극에서 모터 단백질의 비대칭 분포에서 중 electromotility과 관련된, 그리고 결과입니다. 기계 및 화학적 자극은 세포 및 / 또는 그들의 환경의 이온 조건의 변화 또한 플라즈마 막 - 임베디드 모터 단백질 5, 6을 자극 수 있지만, 본질적으로 느린 운동성이있는 응답을 유도. OHC 운동성이있는 응답 달팽이 앰프의 필수 요소, 음향 주파수 (대략 인간 20 Hz로 20 kHz에서에서)에서 이러한 운동성이있는 반응의 정성 및 정량 분석되기 때문에 연구 7 청각 분야에서 매우 중요한 문제입니다. 고속 videocameras, LED 기반의 조명 시스템, 정교한 이미지 분석 소프트웨어를 결합하여 새로운 이미징 기술의 개발은 이제 외부 교류 전기장 (EAEF)에 안정적인 질적 및 절연 OHCs의 운동성이있는 응답의 양적 연구를 수행할 수있는 기능을 제공합니다 8. 이것은 이전의 접근 9-11의 한계의 대부분을 circumvents 간단하고 비침습 기술입니다. 또한, LED 기반의 조명 시스템은 샘플에 사소한 열 효과를 극도의 밝기를 제공하며, 때문에 비디오 현미경의 사용, 광학 해상도는 기존의 가벼운 현미경 기술 12보다 적어도 10 배 이상이다. 예를 들어, 실험 설치가 여기서 설명과 함께 약 20 NM의 세포 길이의 변화는 일상적으로하고 안정적​​으로 10 kHz에서의 주파수에서 감지하고,이 해결 방법은 더 낮은 주파수에서 향상시킬 수 있습니다. 우리는이 실험 접근 OHC의 운동성를 기본 세포와 분자 메커니즘에 대한 우리의 이해를 확장하는 데 도움이됩니다 확신하고 있습니다.

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Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

electromotility, 슬로우 운동성 및 굽힘을 포함한 외부 머리카락 세포 (OHC) 운동성이있는 응답을, 조사를 위해 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. OHC의 운동성는 외부 교류 전기장과 자극에 의​​해 elicited 및 방법은 고속 영상 녹화, LED 기반의 조명, 그리고 마지막 세대 이미지 분석 소프트웨어를 활용합니다.

외부 교류 전기 필드 자극 및 고속 이미지 분석의 조합 아웃터 헤어 셀 운동성를 조사

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives ...

investigating-outer-hair-cell-motility-with-combination-external

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.4K 조회수.  House Ear Institute. electromotility, 슬로우 운동성 및 굽힘을 포함한 외부 머리카락 세포 (OHC) 운동성이있는 응답을, 조사를 위해 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. OHC의 운동성는 외부 교류 전기장과 자극에 의​​해 elicited 및 방법은 고속 영상 녹화, LED 기반의 조명, 그리고 마지막 세대 이미지 분석 소프트웨어를 활용합니다.

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TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS display abnormalities in the expression of FMR1 - a protein required for typical, healthy neural development.3 Recent data has suggested that the loss of this protein can cause the cortex to be hyperexcitable thereby affecting overall patterns of neural plasticity.4,5
In addition, Fragile X shows a strong comorbidity with autism: in fact, 30% of children with FXS are diagnosed with autism, and 2 - 5% of autistic children suffer from FXS.6
Transcranial Magnetic Stimulation (a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses 7,8) represents a unique method of exploring plasticity and the manifestations of FXS within affected individuals. More specifically, Theta-Burst Stimulation (TBS), a specific stimulatory protocol shown to modulate cortical plasticity for a duration up to 30 minutes after stimulation cessation in healthy populations, has already proven an efficacious tool in the exploration of abnormal plasticity.9,10 
Recent studies have shown the effects of TBS last considerably longer in individuals on the autistic spectrum - up to 90 minutes.11 This extended effect-duration suggests an underlying abnormality in the brain's natural plasticity state in autistic individuals - similar to the hyperexcitability induced by Fragile X Syndrome.
In this experiment, utilizing single-pulse motor-evoked potentials (MEPs) as our benchmark, we will explore the effects of both intermittent and continuous TBS on cortical plasticity in individuals suffering from FXS and individuals on the Autistic Spectrum.

In this article, we examine the effects of Theta-Burst TMS stimulation on cortical plasticity in individuals suffering from Fragile X syndrome and individuals on the autistic spectrum.

TMS : 연약한 X 증후군 및 자폐증과 개인의 소성의 Mechasnism를 탐험하는 세타 - 버스트 프로토콜을 사용하여

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

연구

신경과학

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

사용하는 마우스 대뇌 피질과 해마의 시각화 및 Dendrites와 쪽이의 유전자 조작<em&gt; utero에서</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

적외선 신경 자극의 메커니즘을 조사하는 전체 세포 패치 클램프

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

A Human-machine-interface Integrating Low-cost Sensors with a Neuromuscular Electrical Stimulation System for Post-stroke Balance Rehabilitation

A stroke is caused when an artery carrying blood from heart to an area in the brain bursts or a clot obstructs the blood flow to brain thereby preventing delivery of oxygen and nutrients. About half of the stroke survivors are left with some degree of disability. Innovative methodologies for restorative neurorehabilitation are urgently required to reduce long-term disability. The ability of the nervous system to reorganize its structure, function and connections as a response to intrinsic or extrinsic stimuli is called neuroplasticity. Neuroplasticity is involved in post-stroke functional disturbances, but also in rehabilitation. Beneficial neuroplastic changes may be facilitated with non-invasive electrotherapy, such as neuromuscular electrical stimulation (NMES) and sensory electrical stimulation (SES). NMES involves coordinated electrical stimulation of motor nerves and muscles to activate them with continuous short pulses of electrical current while SES involves stimulation of sensory nerves with electrical current resulting in sensations that vary from barely perceivable to highly unpleasant. Here, active cortical participation in rehabilitation procedures may be facilitated by driving the non-invasive electrotherapy with biosignals (electromyogram (EMG), electroencephalogram (EEG), electrooculogram (EOG)) that represent simultaneous active perception and volitional effort. To achieve this in a resource-poor setting, e.g., in low- and middle-income countries, we present a low-cost human-machine-interface (HMI) by leveraging recent advances in off-the-shelf video game sensor technology. In this paper, we discuss the open-source software interface that integrates low-cost off-the-shelf sensors for visual-auditory biofeedback with non-invasive electrotherapy to assist postural control during balance rehabilitation. We demonstrate the proof-of-concept on healthy volunteers.

A novel low-cost human-machine interface for interactive post-stroke balance rehabilitation system is presented in this article. The system integrates off-the-shelf low-cost sensors towards volitionally driven electrotherapy paradigm. The proof-of-concept software interface is demonstrated on healthy volunteers.

후 스트로크 균형 재활을위한 신경 근육 전기 자극 시스템과 저가 센서를 통합하는 인간 - 기계 인터페이스

A stroke is caused when an artery carrying blood from heart to an area in the brain bursts or a clot obstructs the blood flow to brain thereby preventing ...

Assessment of Neuromuscular Function Using Percutaneous Electrical Nerve Stimulation

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, spinal and peripheral levels). The present protocol describes how this method can be used to stimulate the posterior tibial nerve that activates plantar flexor muscles. Percutaneous electrical nerve stimulation consists of inducing an electrical stimulus to a motor nerve to evoke a muscular response. Direct (M-wave) and/or indirect (H-reflex) electrophysiological responses can be recorded at rest using surface electromyography. Mechanical (twitch torque) responses can be quantified with a force/torque ergometer. M-wave and twitch torque reflect neuromuscular transmission and excitation-contraction coupling, whereas H-reflex provides an index of spinal excitability. EMG activity and mechanical (superimposed twitch) responses can also be recorded during maximal voluntary contractions to evaluate voluntary activation level. Percutaneous nerve stimulation provides an assessment of neuromuscular function in humans, and is highly beneficial especially for studies evaluating neuromuscular plasticity following acute (fatigue) or chronic (training/detraining) exercise.

We present a protocol to assess changes in neuromuscular function. Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method that evokes muscular responses. Electrophysiological and mechanical properties of these responses permit the evaluation of neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, spinal and peripheral levels).

경피적 전기 신경 자극을 사용하여 신경 근육 기능의 평가

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, ...

Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central nervous system. Changes in ENS function are a major cause of GI symptoms and disease and may contribute to GI symptoms reported in neuropsychiatric disorders including autism. It is well established that isolated colon segments generate spontaneous, rhythmic contractions known as Colonic Migrating Motor Complexes (CMMCs). A procedure to analyze the enteric neural regulation of CMMCs in ex vivo preparations of mouse colon is described. The colon is dissected from the animal and flushed to remove fecal content prior to being cannulated in an organ bath. Data is acquired via a video camera positioned above the organ bath and converted to high-resolution spatiotemporal maps via an in-house software package. Using this technique, baseline contractile patterns and pharmacological effects on ENS function in colon segments can be compared over 3-4 hr. In addition, propagation length and speed of CMMCs can be recorded as well as changes in gut diameter and contraction frequency. This technique is useful for characterizing gastrointestinal motility patterns in transgenic mouse models (and in other species including rat and guinea pig). In this way, pharmacologically induced changes in CMMCs are recorded in wild type mice and in the Neuroligin-3R451C mouse model of autism. Furthermore, this technique can be applied to other regions of the GI tract including the duodenum, jejunum and ileum and at different developmental ages in mice.

This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.

비디오 이미징 및 시공간지도는 마우스에서 위장관 운동성을 분석하는

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central ...

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific frequency and in turn modulate ongoing cortical oscillatory activity. This neurotool allows the establishment of a causal link between endogenous oscillatory activity and behavior. Most of the tACS studies have shown online effects of tACS. However, little is known about the underlying action mechanisms of this technique because of the AC-induced artifacts on Electroencephalography (EEG) signals. Here we show a unique approach to investigate online physiological frequency-specific effects of tACS of the primary motor cortex (M1) by using single pulse Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) to probe cortical excitability changes. In our setup, the TMS coil is placed over the tACS electrode while Motor Evoked Potentials (MEPs) are collected to test the effects of the ongoing M1-tACS. So far, this approach has mainly been used to study the visual and motor systems. However, the current tACS-TMS setup can pave the way for future investigations of cognitive functions. Therefore, we provide a step-by-step manual and video guidelines for the procedure.

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) allows the modulation of cortical excitability in a frequency-specific fashion. Here we show a unique approach which combines online tACS with single pulse Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) in order to "probe" cortical excitability by means of Motor Evoked Potentials.

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Transcranial Electrical Brain Stimulation in Alert Rodents

Transcranial electrical brain stimulation can modulate cortical excitability and plasticity in humans and rodents. The most common form of stimulation in humans is transcranial direct current stimulation (tDCS). Less frequently, transcranial alternating current stimulation (tACS) or transcranial random noise stimulation (tRNS), a specific form of tACS using an electrical current applied randomly within a pre-defined frequency range, is used. The increase of noninvasive electrical brain stimulation research in humans, both for experimental and clinical purposes, has yielded an increased need for basic, mechanistic, safety studies in animals. This article describes a model for transcranial electrical brain stimulation (tES) through the intact skull targeting the motor system in alert rodents. The protocol provides step-by-step instructions for the surgical set-up of a permanent epicranial electrode socket combined with an implanted counter electrode on the chest. By placing a stimulation electrode into the epicranial socket, different electrical stimulation types, comparable to tDCS, tACS, and tRNS in humans, can be delivered. Moreover, the practical steps for tES in alert rodents are introduced. The applied current density, stimulation duration, and stimulation type may be chosen depending on the experimental needs. The caveats, advantages, and disadvantages of this set-up are discussed, as well as safety and tolerability aspects.

This protocol describes a surgical set-up for a permanent epicranial electrode socket and an implanted chest electrode in rodents. By placing a second electrode into the socket, different types of transcranial electrical brain stimulation can be delivered to the motor system in alert animals through the intact skull.

경고 설치류에 Transcranial 전기 두뇌 자극

Transcranial electrical brain stimulation can modulate cortical excitability and plasticity in humans and rodents. The most common form of stimulation in ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a closed-loop event-triggered manner. Although many studies are focusing on the possible benefits and side-effects of TES in healthy and pathologic brains, there are still many fundamental open questions regarding the mechanism of action of the stimulation. Therefore, there is a clear need for a robust and reproducible method to test the acute and the chronic effects of TES in rodents. TES can be combined with regular behavioral, electrophysiological, and imaging techniques to investigate neuronal networks in vivo. The implantation of transcranial stimulation electrodes does not impose extra constraints on the experimental design while it offers a versatile, flexible tool to manipulate brain activity. Here we provide a detailed, step-by-step protocol to fabricate and implant transcranial stimulation electrodes to influence brain activity in a temporally constrained manner for months.

This detailed protocol describes transcranial stimulation electrode placement on the temporal bone in order to investigate the short- and long-term effects of transcranial electrical stimulation in freely moving rats.

만성 Transcranial 전기 자극 및 쥐 Intracortical 녹음

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to amplify the weak vibration of low-level sound signal. The morphology and electrophysiological property of outer hair cells (OHCs) develop in early postnatal ages. The maturation of outer hair cell may contribute to the development of the auditory system. However, the process of OHCs development is not well studied. This is partly because of the difficulty to measure their function by an electrophysiological approach. With the purpose of developing a simple method to address the above issue, here we describe a step-by-step protocol to study the function of OHCs in acutely dissociated cochlea from postnatal rats. With this method, we can evaluate the cochlear response to pure tone stimuli and examine the expression level and function of the motor protein prestin in OHCs. This method can also be used to investigate the inner hair cells (IHCs).

This protocol describes methods to record the auditory brainstem response from postnatal rat pups. To examine the functional development of outer hair cells, the experimental procedure of whole-cell patch clamp recording in isolated outer hair cells is described step-by-step.

청각 Brainstem 응답 및 출생 후 쥐에 외부 머리 세포 전체 셀 패치 클램프 기록

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...