이 방법은 청력과 균형 분야의 근본적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그것은 감각 머리 세포 기능의 두 가지 중요 한 측면을 감지 하는 방법을 설명, mechanotransction 및 사전 시 냅 스 활동. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 동물에서 모발 세포의 기능을 시각화하고 모발 세포 수집이 감각 정보를 감지하고 전송하는 방법을 연구 할 수 있다는 것입니다.
이 절차를 시작하려면 미세 한 집게와 텅스텐 와이어를 사용하여 단단한 캡슐화에 머리와 꼬리를 통해 유충을 고정하는 데 사용되는 핀을 패션합니다. 헤드 핀을 만들려면 0.035 mm 텅스텐 와이어를 한 손에 잡습니다. 반면에 미세 한 집게를 사용 하 여 와이어를 끝에서 1 밀리미터, 90도에서 구부립니다.
포셉을 미세 한 가위로 교환하고 굽힘 후 1 밀리미터를 잘라 핀을 만듭니다. 그런 다음 집게를 사용하여 챔버의 강화 된 캡슐화에 핀을 삽입합니다. 유충을 관혈 챔버의 중앙에 배치하여 실리콘 캡슐화에 대해 측면에 평평하게 놓습니다.
미세 한 집게를 사용 하 여, 0.035 밀리 미터 헤드 핀 애벌레에 수직으로 가져. 눈과 오틱 소포 사이에 헤드 핀을 삽입하고 캡슐화에 아래로 넣습니다. 두 번째 집게 세트를 사용하여 등쪽과 복부 쪽을 따라 유충을 안정화하고 고정합니다.
핀의 수평 부분이 애벌레에 닿고 캡슐화에 모든 방법을 누르지 않도록합니다. 핀을 통풍구로 각도, 또는 유충의 전방을 향해 약간 가리키는, 후속 심장 주사 및 헤어 세포 이미징을 방해하지 않도록. 집게를 사용하여 0.025 밀리미터 꼬리 핀을 노토코드에 삽입하여 꼬리 끝에 최대한 가깝게 넣습니다.
유충에 알파 bungarotoxin을 주입하려면 젤 로딩 파이펫 팁을 사용하여 용액의 3 마이크로 리터를 주입 바늘에 백필하십시오. 거품없이 솔루션이 팁에 균일하게 로드됩니다. 그런 다음 수동 미세 조작기에 부착 된 파이펫 홀더에 심장 주입 바늘을 삽입합니다.
스테레오 현미경하에서, 바늘을 마취 유충의 AP 축에 수직으로 정렬하여 30도 각도로 아래로 향하도록 배치합니다. 다음으로 파이펫 홀더를 압력 인젝터에 연결합니다. 용액에 알파 분가로톡신의 볼러스를 주입하여 바늘 팁이 명확한지 여부를 테스트합니다.
적색이 보이지 않으면 바늘 끝을 핀 가장자리에 매우 부드럽게 긁어 내고 바늘이 맑아지 때까지 다시 시도하십시오. 그 후, 바늘을 심장쪽으로 전진시키고, 심장 바깥쪽에 피부에 닿을 때까지 진행합니다. 바늘을 애벌레에 넣고 심장 앞 피부에 안료 세포의 들여쓰기를 찾아서 바늘이 애벌레에 상대적인 올바른 평면에 위치하도록 하십시오.
그런 다음 바늘이 피부를 관통하고 심장 구멍에 들어갈 때까지 바늘을 더 멀리 진행합니다. 바늘을 약간 뒤로 당기고 알파 분가로톡신의 볼러스를 심장 구멍에 주입합니다. 심장 구멍의 인플레이션을 찾거나 공동으로 들어가는 붉은 염료를 찾습니다.
유충을 세 번 부드럽게 헹구고, 뉴런 버퍼 1밀리리터로 잔류 MS222를 제거합니다. 모든 유체를 제거하지 마십시오. 관혈 챔버에서 뉴런 버퍼의 약 1 밀리리터에서 애벌레를 유지합니다.
이 절차에서 젤 로딩 팁을 사용하여 제대로 깨진 유체 제트 바늘로 네로날 버퍼의 10 마이크로 리터를 백필. 거품없이 끝에 솔루션을 균일하게 로드합니다. 그런 다음, 전동 마이크로 조작기에 부착 된 파이펫 홀더에 바늘을 삽입합니다.
내혈 챔버를 현미경 스테이지의 원형 챔버 어댑터에 넣습니다. 유충이 시야의 중심에 있도록 전동 스테이지를 이동합니다. 이어서, 유충에 대한 AP의 접근이 유체 제트 바늘의 궤적과 대략 정렬되도록 원형 챔버 어댑터를 돌립니다.
전달된 빛과 차동 간섭 대비를 사용하여 유충을 초점으로 가져와 10배 목표 아래에 중앙에 삽입합니다. 그런 다음 10배 목표를 높입니다. 전동 마이크로 조작기를 사용하여 유체 제트 바늘을 시야 중앙으로 가져와 서 전달된 빛에 의해 조명되고 뉴런 버퍼를 거의 만지지 않습니다.
위치를 확인하기 위해 애벌레에 초점을 10배 목표를 낮춥니다. 유체 제트 바늘에 목표를 허덕. 유충의 등쪽과 평행한 위치에 도달할 때까지 x 및 y축의 미세 조작기로 유체 제트 바늘을 이동합니다.
그 후, 애벌레에 다시 초점을 맞춥니다. 바늘을 z 축에 내려 놓고 바늘을 물고기의 등쪽 면을 따라 바늘을 몸에서 1밀리미터 떨어진 곳에 놓습니다. 조심스럽게 유체 제트 바늘이 애벌레의 AP 미드 라인을 따라 정렬되도록 원형 챔버 어댑터를 이동합니다.
다음으로 60배의 물 목표로 전환합니다. 목표가 신경 완충제에 에머드되어 있는지 확인합니다. 신경마비를 찾기 위해 미세 한 초점을 사용합니다.
그 후 방색 된 단계를 이동하여 시야의 중심에 관심있는 신경을 배치합니다. 물고기의 등쪽 을 따라 유체 제트 바늘 팁을 유지합니다. 유충이나 챔버 표면에 유체 제트 바늘 끝을 만지지 마십시오.
신경종의 바깥쪽 가장자리에서 100 마이크로미터되도록 미세 조작기와 유체 제트 바늘을 배치합니다. 그런 다음, 정물 머리 번들의 끝에 초점을 맞춥니다. 유체 제트 바늘의 바닥은이 평면에 초점을 맞추어야합니다.
수동에서 외부 모드로 고속 압력 클램프를 설정하여 이미징 소프트웨어의 입력을 수신합니다. 제로 버튼을 눌러 고속 압력 클램프를 0으로 설정하고 세트 포인트 노브를 사용하여 휴식 압력을 약간 긍정적으로 설정합니다. 헤드 스테이지 출력에 부착된 PSI 기마계를 사용하여 고속 압력 클램프의 휴식 출력을 확인합니다.
모발 번들을 자극하는 데 필요한 압력을 결정하려면 200-500 밀리초 동안 0.125 및 0.25 볼트 출력으로 테스트 자극을 적용합니다. 각 테스트 자극에 대해, 헤어 번들의 끝, 키노실리아의 편향의 거리를 측정합니다. 번들을 약 5 마이크로미터의 거리를 이동하는 압력을 선택합니다.
키노실리아의 팁이 전체 시간에 초점을 유지하도록 하십시오. 단일 평면 이미지를 획득하려면 프레임 30 후 3초 후에 80 프레임 획득 중에 전달할 자극을 선택합니다. 메카노감감하는 칼슘 반응을 측정하려면, 압정 모발 번들의 기초에 초점을 맞추고 이미지 수집을 시작합니다.
사전 합성 칼슘 반응을 측정하려면, 모발 세포의 기초에 초점을 맞추고, 이미지 수집을 시작합니다. 시뮬레이션 중 신경종 내에서 GCaMP6S 강도의 현수성 변화를 시각화하는 단계는 여기에 설명되어 있습니다. 타임스탬프에 따라 왼쪽에서 오른쪽으로 시간이 표시됩니다.
맨 위 행에는 70프레임 GCaMP6S F 이미지 시퀀스의 14개의 측두엽 중 5개가 표시됩니다. 두 번째 행에서는 각 GCaMP6S F 비닝 이미지에서 기준선이 제거되어 델타 F 이미지를 만듭니다. 세 번째 행에서 델타 F 이미지가 회색 눈금에서 빨간색 핫 조회 테이블로 변환되었습니다.
맨 아래 행에서 세 번째 행은 맨 위 행의 F 이미지에 오버레이되었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 유충이 올바르게 고정되어 있는지 확인하고 원고에 설명된 대로 적절한 컨트롤을 사용하여 데이터에서 모션 아티팩트를 제외하는 것이 중요합니다. 알파 분가로톡신으로 작업하는 것은 위험할 수 있습니다.
그것을 취급하는 동안 장갑을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취하는 것이 중요합니다.
