이 실용적인 우리가 헤어 셀 스테레오실리의 표면에 기계 전기 변환 기계의 나노 구조 구성 요소의 동적 변화를 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 나노미터 해상도에서 복잡한 지형을 가진 살아있는 세포의 표면의 시간 경과 이미징이며 시료와 물리적 접촉을하지 않고. 이 기술은 거의 모든 살아있는 세포에 적용될 수 있습니다.
우리는 이전에 바이러스에 감염된 폐 상피 세포주 표면을 일치, 근육 세포, 곧 내 이미지 박테리아에서. 각 이미징 세션의 시작 부분에서 나노 피펫을 테스트합니다. 나노피펫을 제작한 후, 거품을 확인하고, 거품을 제거하고, 나노피펫을 호핑 프로브 에 장착하여 이온 전도도 현미경 피펫 홀더에 장착한다.
챔버에 목욕 용액의 4 밀리리터에서 HPICM 단계에 챔버를 배치합니다. 접지 전극을 목욕 용액에 도입하고 패치 클램프 증폭기를 통해 파이펫에 적용되는 전압이 0인지 확인합니다. 마이크로 조작기를 수직 위치에 놓은 후 액체에 닿을 때까지 Z의 파이펫을 이동하고 증폭기를 0으로 설정한 후 100밀리볼트를 추가하여 파이펫 전류를 확인합니다.
실리콘 접착제를 사용하여 AFM 교정 표준을 챔버에 부착하고 4 밀리리터의 HBSS로 샘플을 덮습니다. 양면 테이프를 사용하여 HPICM 설정의 X Y 단계에 챔버를 고정하고 입증된 대로 새 나노피펫을 홀더에 로드합니다. 나노피펫 저항성 및 직경을 테스트한 후 전류를 1나노 앰프로 설정합니다.
거친 패치 클램프 조작기를 사용하여 나노파이펫을 교정 표준의 중앙 위에 위치시키고 세트점을 늘리면서 Z 압전액액터의 센서로부터 실시간으로 신호를 모니터링한다. 안정적인 반복 가능한 Z 접근 주기를 설정한 후, 세트점을 불안정 지점 바로 바로 위에 있는 값으로 줄이고 피펫을 초당 약 5미크론의 속도로 아래로 이동하여 시료에 도달할 때까지 한다. 실시간 Z 위치 신호의 바닥 수준이 증가하여 샘플 표면을 감지하여 나노피펫이 철회되었음을 나타냅니다.
AFM 표준에 고르지 않은 장착으로 인해 관심 영역의 가장 높은 지점은 알 수 없습니다. 따라서 파이펫 후퇴의 진폭을 적어도 200 내지 500 나노미터로 설정한다. Z 압압 액추에이터 운동의 상한을 초과하지 않도록주의, 낮은 해상도에서 이미징을 시작합니다.
이미징 영역에서 샘플의 가장 높은 지점이 확인되면, 새로운 X Y 위치로 이동하기 전에 샘플과의 원치 않는 충돌을 방지하기 위해 Z 축을 따라 약 200 미크론홉 진폭을 감소시키고 파이펫을 철회한다. 관심 영역이 위치했을 때 더 높은 해상도로 이미징을 시작합니다. 청각 헤어 셀 이미징의 경우 치과 치실 또는 유연한 유리 파이펫을 사용하여 코르티의 갓 분리 된 장기를 챔버에 단단히 고정하십시오.
양면 테이프를 사용하여 X Y 압전 스테이지에 챔버를 단단히 고정하고 입증된 대로 새로운 나노피펫을 홀더에 로드합니다. 나노피펫 저항성을 확인한 후, 패치 클램프 마이크로 조작기를 사용하여 코티 X 식물의 장기를 반전된 현미경으로 관찰하면서 모발 세포 부위 위에 나노피펫을 배치한다. 기록, 오실로스코프상의 실시간 전류 및 Z 위치 신호는 시스템이 0.5%6or 이하의 세트 포인트로 안정적인지 확인하고, 입증된 바와 같이 최적의 설정점을 결정하고 시료에 접근한다.
적어도 6~8미크론의 홉 진폭을 사용하여 입증된 바와 같이 시료의 저해상도 이미징을 수행한다. 나노 피펫이 새로운 X Y 위치로 이동해야하는 경우, 조직 내의 키가 큰 특징과의 충돌을 피하기 위해 약 500 나노미터의 파이펫을 철회하고 모발 세포가 있는 관심 영역까지 저해상도 HPICM 이미징을 반복하십시오. 그런 다음 관심 영역을 15분 이내에 더 높은 해상도로 이미지화합니다.
HPICM 프로토콜은 살아있는 쥐 청각 머리 세포 번들과 같은 복잡한 지형을 가진 모든 살아있는 세포를 시각화하는 데 사용될 수 있습니다. HPICM 이미지는 전자 현미경 이미지를 스캔하는 것에 비해 X Y 해상도가 낮지만 다양한 입체 계열을 성공적으로 해결할 수 있습니다. 스테레오실리아 팁의 모양과 인접한 스테레오실리아를 연결하는 작은 5 나노미터 링크.
HPICM 이미징의 비접촉 특성을 감안할 때, 동일한 모발 세포 번들의 연속 타임랩스 이미징은 번들 응집력을 손상시키지 않고 몇 시간 동안 수행될 수 있다. 설정점이 매우 낮을 수록 시스템은 전류의 작은 변동을 셀 표면을 발생시키는 것으로 해석하여 이미지에서 백색 도트 노이즈로 이어질 수 있습니다. 마찬가지로, 큰 홉 진폭은 파이펫의 측면 공명을 증가시킬 수 있으며, 이로 인해 시끄러운 픽셀이 생성될 수도 있습니다.
대조적으로, 홉 진폭이 너무 작거나 설정점이 너무 높으면 나노피펫이 샘플과 충돌하여 이미징 아티팩트 또는 모발 번들 손상이 발생할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 살아있는 세포로 작업할 때 모발 세포 번들 당 15분 미만을 지출하는 것입니다. 헤어 번들의 이미지를 얻은 후, 하나는 메카노 트랜스듀션 채널 속성에 대한 질문에 대답하기 위해 스테레오실리아의 표면에 특정 위치에서 단일 채널 녹음을 얻으려고 시도 할 수 있습니다.
