우리는 기술 지원을 위해 트란 Huynh, 앤드류 산 안토니오 (San Antonio), 제리 린 감사합니다. 이 작품은 건강 보조금 DA023700 국립 연구소에 의해 기금 XX에 DA023700-04S1되었습니다

1. 뇌 슬라이스 준비 <ol><li> 유전자 변형 마우스는 pentobarbital 나트륨 (&gt; 100 밀리그램 / kg, IP)와 깊이 anesthetized 빠르게 목이 베 있으며, 자신의 뇌는 냉동과 산소를​​ 절단 솔루션으로 추출. </li><li> GFP 고글은 마우스의 뇌가 실제로 GFP를 표현하는 경우 시각적으로 상영하는 데 사용됩니다. </li><li> 두께 400 μm의 기본 somatosensory 피질 부분은 자당 함유 인공 뇌척수 (ACSF)에 vibratome로 절단됩니다. 조각 먼저 32 ° C에서 30 분 ~ 1 H에 대한 자당 함유 ACSF에 incubated하고, 초기 잠복기 후, 실온에서 녹화 ACSF으로 전송됩니다. 부화 및 녹화를 통해 슬라이스가 지속적으로 95% O이 -5 % CO 2와 함께 부풀어 오른 있습니다. </li></ol> 2. 장비 시작 전체 시스템 구현은 그림 1에 도시된다. <ol><li> 레이저 냉각 시스템 및 전원 공급 turne입니다d는에 레이저가 준비. </li><li> photostimulation 제어 (스캔 미러 시스템, 광 변조기, 전자 셔터와 포토 다이오드 입력 앰프 포함)와 관련된 모든 하드웨어 설정되어 있습니다. </li><li> electrophysiological 장비 (Multiclamp 700B 앰프 및 마이크로 포함) 설정되어 있습니다. Electrophysiological 녹음 photostimulation, 그리고 슬라이스 준비의 이미지는 현미경의 동력 무대에 장착 슬라이스 재관류 챔버에서 수행된다. </li><li> 영상 카메라 (Retiga 2000, Q-이미징, 오스틴, TX)가 설정되어 있습니다. 조각 적외선 차등 간섭 대비 (DIC) 및 이미징 시스템을 통해 어려운 형광 광학와 수직 현미경 (BW51X, 올림푸스)과 시각화 수 있습니다. </li><li> MATLAB 기반 EPHUS 소프트웨어 및 Q-캡처 카메라 소프트웨어는 최대 시작됩니다. Ephus 소프트웨어의 사용자 정의 - 수정 버전 (Ephus에서 제공 <a href="https://openwiki.janelia.org/">https://openwiki.janelia.org/ &lt;</a>/ a&gt;는) photostimulation 프로토콜을 제어하고 photostimulation 데이터를 수집하는 데 사용됩니다. </li><li> 시스템이 켜져 후, 하나는 레이저 photostimulation 시스템이 작업 상태에 있는지 확인해야합니다. 4 배 현미경 대물은 glutamate uncaging의 UV 깜박를 전달하는 데 사용됩니다 바와 같이, 흰 종이는 시스템이 실행되는 동안 레이저 스캐닝 패턴을 관찰 할 아래 넣어 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 슬라이스 재관류 설정 <ol><li> 가압 재관류 시스템은 슬라이스 챔버에 기록 ACSF을 먹여 설정되어 있습니다. 케어는 챔버의 단면 위 2.0 mm의 일정한 유체 수준을 보장하기 위해 이루어집니다. </li><li> MNI-갇힌-glutamate의 주식 솔루션의 나누어지는이 0.2 MM 갇힌 glutamate의 농도에 대한 ACSF를 순환의 25 ML에 추가됩니다. 실험 5-6 H 후 목욕 솔루션과 MNI-glutamate가 새로 고침됩니다. </li><li> 뇌 슬라이스가 기록 챔버로 이동합니다. 하나는 영상을 실행할 수 있습니다ystem는 슬라이스의 품질을 확인하고 해부학 적 기본 somatosensory 지역을 찾을 수 있습니다. 그런 다음 슬라이스는 주문 제작 현 플래티넘 링과 정박 해 있습니다. 녹음하기위한 뇌 영역 위에 닻을 넣어하지 않도록주의하십시오. </li></ol> 4. 전체 세포 패치 - 클램프 녹음 <ol><li> 유리 전극은 (4-6 MΩ 저항) 셀 라벨 및 형태학의 식별 0.1 % biocytin을 포함하는 내부 솔루션으로 끌어 가득합니다. </li><li> 패치 녹화를 수행하려면 셀 60x 목적의 시각화 수 있습니다. 억제 세포 유형 먼저 확인하고 형광등 / DIC 올림푸스 현미경 아래에서 GFP의 표현의 시각화에 따라 선택되며, 녹음 이후 적외선 DIC 비디오 감시하여 왔으며 시각적 인 통제하에 수행됩니다. DIC 및 형광등 모드 사이를 전환 몇 번이 대상 셀에 전극을 접근하는 동안 GFP 세포의 위치를​​ 확인 할 필요가 있습니다. </li><li&gt;을 기존 패치 - 클램핑 기술이 적용되어 있습니다. 전극 긍정적 인 압력으로 가득합니다, 대상 세포막시 알아볼 수 보조개를 확립하기 위해 가까운 세포 표면에 이동, 그리고 부정적인 압력이 빠르게 gigaseal을 형성하고 비디오 모니터에 현재 분사 응답을 모니터링하면서 침입에 적용됩니다. </li><li> 에 침입하면, DIC 및 형광등 모드에 따라 60x의 셀의 이미지가 온라인 확인을 위해 이동합니다. photostimulation 데이터의 수집하기 전에, hyperpolarizing 및 전류 펄스를 depolarizing는 각 셀의 기본 electrophysiological 속성을 검토 주입합니다. </li><li> 일단 안정적으로 전체 셀 녹음이 편리 저항 (보통 MΩ &lt;20)로 달성된다, 현미경 대물은 60x에서 레이저 스캔 photostimulation에 대한 배속으로 전환합니다. 4 배의 슬라이스 이미지가 획득되어 photostimulation 사이트를지도하고 등록을 위해 사용됩니다. </li></ol> 5. 레이저 SCAphotostimulation을 nning <ol><li> photostimulation 및 데이터 수집 매개 변수가 Ephus의 구성 스위치 모듈을 활성화하여 설정합니다. 일반적으로, 1 초 자극 간격 1 밀리 초 레이저 (20 MW)이 photostimulation 매핑에 사용됩니다. 10 kHz에서에서 맛보실 일초의 데이터 흔적을 찾았습니다. </li><li> 4 배 슬라이스 이미지가 Ephus의 매퍼 모듈에로드됩니다. 셀 소마의 위치를​​ 정의하고 있으며, 16x16 규격의 패턴 (80 μm X 80 μm 간격)의 photostimulation 사이트는 모두 대뇌 피질의 레이어를 덮고, 셀 위치 주변에 설정되어 있습니다. </li><li> 기록 뉴런의 여기 프로필은 현재 클램프 모드에서 photostimulation에 대한 응답으로 솟​​고 위치를 검토하여 매핑됩니다. 온라인 디스플레이 기능과의 사용자 친화적 인 소프트웨어가 매핑 실험을 용이하게한다. </li><li> 레이저가 다른에서 스캔하는 동안 지역 흥분성의 회로 연결 기록 세포에서 흥분성의 postsynaptic 전류 (EPSC)의 감지로 매핑됩니다위치. 세포는 안쪽 흥분성의 전류를 감지하는 전압 클램프 모드에서 -70 뮤직 비디오에서 개최됩니다. EPSC지도 photostimulation 패턴 회전을 2-3 번을 반복하거나 뒤집혀 있습니다. </li><li> 선택 사항 : 지역 억제 회로 연결도 외측 억제 전류를 감지 전압 클램프 모드에서 가까운 0 뮤직 비디오에서 개최 기록 된 세포에서 억제 postsynaptic 전류 (IPSC)의 감지로 매핑 할 수 있습니다. IPSC 매핑에 대한 세슘로 대체 칼륨과 전극 내부 솔루션을 사용하는 것이 가장 좋습니다 것입니다합니다. </li><li> 모든 생리적 assays가 완료 후, 전극은 부드럽게 녹화 셀에서 제거됩니다. 뇌 슬라이스는 밤새 4 % paraformaldehyde에서 촬영하고 고정됩니다. 기록 세포는 biocytin에 대해 얼룩이 있습니다. 셀 형태는 각 기록 세포가 실제로 원래 목표 GFP-표현 interneuron되었음을 확인하는 공 촛점 또는 에피 형광 현미경과 검토하고 있습니다. </li></ol> 6. Photostimulat이온 데이터 분석 우리의 새로 개발 된 방법론 및 소프트웨어 구현 11 원시 데이터지도에서 photostimulation-evoked 신경 이벤트의 검출 및 측정에 적용됩니다. 그림 2에 예시, 색으로 구분지도는 기록 뉴런에 신경 입력의 패턴을 설명하기 구성되어 있습니다. 7. 대표 결과 : electrophysiological 녹음 및 photostimulation 매핑의 예 결과는 그림 2에 표시됩니다. 특정 억제 세포 유형의 대상으로 녹음 알려진 억제 세포 유형에 GFP를 표현 형질 전환 생쥐를 사용하여 가능하게됩니다. 억제 interneurons의 다양성을 감안할 때, GFP의 표현, 고유 전기 생리학 및 형태학의 특성 (그림 2A)의 분석은 최종 세포 유형 분류에 도착하는 결합됩니다. 그림 2B-C는 레이저 스캔 photostimulation 지역 cortic의 다양한 매핑을 허용하는 설명단일 억제 뉴런에 알 회로 연결. 원시 데이터 맵은 그림 2C에 표시됩니다. 직접 uncaging 응답은 데이터 분석 (그림 2C)에서 제외됩니다. 양적 입력지도, 색 그림 2D-F에 표시됩니다. 예를 들어 빠른 속도로 튀어 오르고 억제 interneurons는 레이어 4 깊은 층에서 강한 흥분성의 시냅스 입력 (EPSCs)를 받았습니다. 정의 대뇌 피질의 경로에있는 세포의 시냅스 입력 단체와 관련된함으로써, 우리는 대뇌 피질의 정보 처리에의 가능한 역할 (예를 들면, 피드백과 피드 포워드 억제) 추론 할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3109/3109fig1.jpg" /> 1 그림. 레이저 스캔 photostimulation 일반 시스템 장비. 우리의 전체 시스템은 photostimulation 제어, 비디오 이미징 및 electrophysiological 레코딩 시스템으로 구성되어 있습니다. 우리는 LSPS 시스템의 설계는 이전에 7,17 설명 하였다. 레이저 단위는 355 nm의 UV 라스를 생성하는 데 사용됩니다glutamate의 uncaging에 대한 어. 레이저 빔은 시스템의 광학 경로를 통해 전달됩니다. 레이저 플래시 (예를 들어, 1-3 밀리 초)의 짧은 기간은 전기 광학 변조기 (즉, pockels 셀) 및 기계적 셔터를 사용하여 제어됩니다. 레이저 빔 에너지는 중립적 인 밀도 기울기 휠의 조절과 광 다이오드에 유리 coverslip으로 레이저 빔의 작은 부분을 우​​회에 의해 모니터링된다. 레이저 스캐닝 시스템은 검사 거울, 스캔 렌즈, 튜브 렌즈와 목적 렌즈의 XY 쌍을 포함합니다. 거울은 스캔 렌즈를 통해 레이저 빔을 제공 한 후 빔은 이색 성 거울을 통해 현미경을 입력하고 주문 제작 UV-전송 튜브 렌즈에 의해 초점을 맞추고 있습니다. 빔보다 원주를 축 해상도를 줄여 가능한 2 차원으로 매핑을 유지, 조명 빔 (같은 원추형이 아닌)를 제공 할 수있는 현미경 대물의 뒷면 조리개를 underfills. 4 배 목표 아래, 레이저 빔 uncaging 명소, 각 approximati을 형성NG 초점 평면 (삽입 참조)에서 옆으로 153 μm의 폭 가우스 프로필. 거울과 목표의 뒷면 개구는 목적 렌즈 초점 평면에서 다른 스캔 위치에 미러 위치를 번역, 공액 비행기에 다양한 레이저 자극 위치는 galvanometers 기반 XY 검사 거울을 통해 달성 될 수있다. uncaging 동안, 전체 필드를 포함 패턴 사이트의 변수 번호는 최근에 자극 사이트의 주변을 다시 방문하지 않도록하는 nonraster, nonrandom 순서에 순차적으로 자극되어 있습니다. 더 자세한 정보는 슈 외. (2010)를 참조하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3109/3109fig2.jpg" /> 그림 2. 마우스 기본 감각 피질의 레이어 4 GFP-표현할 빠른 속도로 튀어 오르고 interneuron에 지역 흥분성의 회로 연결을 매핑. A1과 A2는 60x에서 대상 셀의 DIC와 GFP 형광 이미지를 표시생활 뇌 슬라이스의 목적, A3는 후 녹음, 고정 슬라이스의 biocytin의 착색에 의해 밝혀 세포 형태를 보여줍니다 동안. A4 서로 다른 강점 intrasomatic 현재 주사에 대한 응답으로 빠른 속도로 튀어 오르고 억제 interneuron의 특징 기록 된 GFP 세포,의 발사 패턴을 보여줍니다. B 16 배속 photostimulation 사이트 (*)로 겹쳐 슬라이스 이미지를 보여줍니다. 셀 위치는 작은 빨간색 원으로 표시됩니다. C는 셀이 안쪽으로 흥분성의 전류를 감지 할 -70 뮤직 비디오에서 개최되었을 때, B에 표시되는 자극의 위치에서 photostimulation-evoked 응답 흔적의 배열을 보여줍니다. photostimulation 응답의 다양한 형태의 확장과 별​​도로 삽입에 표시된 1과 2의 위치에서 흔적에 설명되어 있습니다. 추적 1 전지 본체와 promximal 수석에 uncaging glutamate 할 수있는 직접 응답의 예 (빨간색 화살촉으로 표시)입니다. 2 다른 흔적은 흥분성의 시냅스에서의 전형적인 예입니다응답 (파란색)를 넣어. 직접 응답과 시냅스 입력을들은 진폭 및 응답 대기 시간으로 구분 될 수 있습니다. D, E와 F는 원시 데이터가 각에서 평균 입력 진폭 C.에 표시되는지도 각각 평균​​ EPSC 진폭의 색으로 구분지도 (16x16 규격의 사이트), EPSC 번호, 사이트 당 처음 발견 EPSC 지연입니다 자극 사이트는 동일한 사이트의 photostimulation 응답에서 차감 기준 자발적인 반응과 함께 분석 창에서 EPSCs의 평균 진폭입니다. EPSCs과 도착 시간 또는 사이트 당 처음 발견 EPSC의 지연의 수는 측정 해본 있습니다. 자세한 내용은 (시 외., 2010)를 참조하십시오.

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	<li>Ascoli, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Petilla+terminology:+nomenclature+of+features+of+GABAergic+interneurons+of+the+cerebral+cortex.">Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex.</a> Nature. 9, 557-568 (2008).</li><li>Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneurons+of+the+neocortical+inhibitory+system.">Interneurons of the neocortical inhibitory system.</a> Nature. 5, 793-807 (2004).</li><li>Xu, X., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+specificity+of+functional+input+to+distinct+types+of+inhibitory+cortical+neurons.">Laminar specificity of functional input to distinct types of inhibitory cortical neurons.</a> J Neurosci. 29, 70-85 (2009).</li><li>Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemical+characterization+of+inhibitory+mouse+cortical+neurons:+three+chemically+distinct+classes+of+inhibitory+cells.">Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells.</a> J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).</li><li>Dantzker, J. L., Callaway, E. 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S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+labeling+and+functional+manipulation+of+specific+neuron+types+in+mouse+brain+by+Cre-activated+viral+gene+expression.">High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression.</a> PLoS ONE. 3, e2005-e2005 (2008).</li><li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections.">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).</li><li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. 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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Photostimulation 기반의 매핑 기법을 효과적으로 대뇌 피질의 회로를 분석하는 적용되었습니다. 많은 다른 장소에서 presynaptic 뉴런의 클러스터 photostimulation과 postsynaptic 신경 세포의 동시 녹음이 흥분성의의 공간적 분포의 정량적 측정을 제공하기 때문에 전체 셀 녹음과 함께 레이저 스캐닝 photostimulation는 하나의 뉴런에 presynaptic 입력 소스의 판상 분포의 고해상도 매핑 할 수 있습니다 또는 억제 입?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 유전자 변형 마우스 라인 </td><td> 잭슨 연구실 또는 기타 소스 </td><td></td><td> 슈와 캘러웨이 (2009)를 참조하시기 바랍니다 </td></tr><tr><td> GFP 고글 </td><td> BLS (주), 헝가리 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> vibratome </td><td> Leica 시스템 </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> MNI 갇힌 glutamate (4 - 메 톡시-7-nitroindolinyl-갇힌 L-glutamate) </td><td> Bioscience Tocris, Ellisville, MO </td><td> 고양이 번호 1490 </td><td></td></tr><tr><td> biocytin </td><td></td><td> B4261 </td><td></td></tr><tr><td> 전극 풀러 </td><td> 셔터 악기, Novato, CA </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> 전극을 만들기위한 유리 튜브 </td><td&gt; </td><td> BF150-86-10 </td><td></td></tr><tr><td> 700B 앰프를 Multiclamp </td><td> 분자 장치, 서니 베일, CA </td><td> 700B를 Multiclamp </td><td></td></tr><tr><td> 디지털 CCD 카메라 </td><td> Q-이미징, 오스틴, TX </td><td> Retiga 2000 </td><td></td></tr><tr><td> 연구 현미경 </td><td> 올림푸스, 도쿄, 일본 </td><td> BW51X </td><td></td></tr><tr><td> UV 레이저 단위 </td><td> DPSS 레이저, 산타 클라라, CA </td><td> 모델 3501 </td><td></td></tr><tr><td> 레이저 스캐닝 phostimulation에 대한 다른 장비 </td><td></td><td></td><td> 슈 외를 참조하시기 바랍니다. (2010) </td></tr></tbody></table> 솔루션 : <ul><li> 자당 함유 슬라이스 절단 용 인공 뇌척수 (ACSF) (mm 단위 : 85 NaCl, 75 자당, 2.5 KCl, 25 포도당, 1.25 아냐 2 PO 4, 4 MgCl 2, 0.5 CaCl 2,, 24 NaHCO 3). </lI&gt; <li> 녹음 ACSF (mm 단위 : 126 NaCl, 2.5 KCl, 26 NaHCO 3, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 1.25 아냐 2 PO 4, 10 포도당) </li><li> 전극 내부 솔루션 (MM의 : 126 K-글루 콘산, 4 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-MG, 0.3 GTP-NA, 10 phosphocreatine, 산도 7.2, 300 mOsm). </li></ul>

mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation

억제 뉴런은 대뇌 피질의 기능에 중요한 수 있습니다. 그들은 전체 대뇌 피질의 neuronal 인구의 약 20 %를 구성하고 자세한 1-4의 immunochemical, 형태학, 그리고 생리 학적 특성에 따라 다양한 하위 유형으로 세분화 할 수 있습니다. 이전 연구 억제 뉴런의 개별 유형의 고유 특성에 대해 많은 발표했지만, 지역 회로 연결에 대한 지식은 아직 3,5,6 상대적으로 제한됩니다. 각 신경 세포의 기능이 대뇌 피질의 회로 내에서의 흥분성의 억제 신경과 입력에 의해 형성되는 감안할 때, 우리는 특정 억제 세포 유형에 대한지도 지역 회로 연결에 레이저 스캐닝 photostimulation (LSPS)를 사용하고 있습니다. 기존의 전기 자극 또는 glutamate 뒤를 자극에 비해 LSPS 개별적으로 기록 뉴런 3,7-9에 광범위한 매핑 및 지방 기능 입력의 정량 분석을 허용하는 독특한 장점이 있습니다. 레이저 사진glutamate의 uncaging을 통해 자극을 선택적으로 통과 또는 하위 박판 매핑 해상도를 보장 말초 수석의 axons을 활성화하지 않고 perisomatically 뉴런을 활성화한다. 넓은 지역 이상 많은 자극을 사이트에서 매핑 입력을위한 LSPS의 감도와 효율성은 잘 대뇌 피질의 회로 분석에 적합합니다. 여기 전체 세포 패치가 현지 억제 회로 매핑에 대한 클램핑과 함께 LSPS의 기술을 소개합니다. 특정 억제 세포 유형의 대상으로 녹음 대상 세포 유형의 일관성 샘플링 및 기록 된 세포 유형의 모호 식별 할 수 피질 3,10에 제한 억제 뉴런의 인구에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하는 유전자 변형 마우스의 사용에 의해 촉진 아르 . LSPS 매핑에 관해서는, 우리는 시스템 장비를 설명 실험 절차 및 데이터 수집을 설명하고, 마우스 기본 somatose의 회로 매핑 현재의 예nsory 피질. 저희 실험에서 도시, 갇힌 glutamate는 UV 레이저 광분해에 의해 뇌 슬라이스의 spatially 제한된 지역에서 활성화되어, 동시 전압 클램프 녹음 photostimulation-evoked 신경 반응을 검출 할 수 있습니다. 대상 신경 세포에 흥분성의 또는 억제하거나 신경 입력의지도는 잠재적 인 presynaptic 사이트의 수백을 촉진하기 위해 레이저 빔을 검색하여 생성됩니다. 따라서, LSPS 반복 실험을 통해 억제 뉴런의 특정 유형에 impinging 신경 입력의 상세지도를 건설 할 수 있습니다. 함께 촬영, photostimulation 기반 기술은 neuroscientists에게 지역의 대뇌 피질 회로의 기능 조직을 결정하기위한 강력한 도구를 제공합니다.

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Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

본 논문은 제한된 억제 뉴런의 인구에 GFP를 표현 형질 전환 생쥐에서 전체 셀 녹음과 photostimulation를 검색 레이저를 결합 방법을 소개합니다. 이 기술은 특정 억제 대뇌 피질의 뉴런의 지역 신경 회로의 광범위한 매핑 및 정량 분석​​ 할 수 있습니다.

레이저 스캐닝 Photostimulation에 의해 억제 Neuronal 회로를 매핑

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.2K 조회수.  University of California, Irvine. 본 논문은 제한된 억제 뉴런의 인구에 GFP를 표현 형질 전환 생쥐에서 전체 셀 녹음과 photostimulation를 검색 레이저를 결합 방법을 소개합니다. 이 기술은 특정 억제 대뇌 피질의 뉴런의 지역 신경 회로의 광범위한 매핑 및 정량 분석​​ 할 수 있습니다.

비디오: Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

연구

신경과학

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

신경 발사 환율의 조작에 의해 성상 세포 수용체의 가소성을 유도

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-connected Circuits

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire of dynamical motifs, which underlie most diverse brain functions, can emerge out of a fixed topological and modular organization of brain circuits. Compared to in vivo studies of neuronal circuits which present intrinsic experimental difficulties, in vitro preparations offer a much larger possibility to manipulate and probe the structural, dynamical and chemical properties of experimental neuronal systems. This work describes an in vitro experimental methodology which allows growing of modular networks composed by spatially distinct, functionally interconnected neuronal assemblies. The protocol allows controlling the two-dimensional (2D) architecture of the neuronal network at different levels of topological complexity.
A desired network patterning can be achieved both on regular cover slips and substrate embedded micro electrode arrays. Micromachined structures are embossed on a silicon wafer and used to create biocompatible polymeric stencils, which incorporate the negative features of the desired network architecture. The stencils are placed on the culturing substrates during the surface coating procedure with a molecular layer for promoting cellular adhesion. After removal of the stencils, neurons are plated and they spontaneously redirected to the coated areas. By decreasing the inter-compartment distance, it is possible to obtain either isolated or interconnected neuronal circuits. To promote cell survival, cells are co-cultured with a supporting neuronal network which is located at the periphery of the culture dish. Electrophysiological and optical recordings of the activity of modular networks obtained respectively by using substrate embedded micro electrode arrays and calcium imaging are presented. While each module shows spontaneous global synchronizations, the occurrence of inter-module synchronization is regulated by the density of connection among the circuits.

This manuscript describes a protocol to grow in vitro modular networks consisting of spatially confined, functionally inter-connected neuronal circuits. A polymeric mask is used to pattern a protein layer to promote cellular adhesion over the culturing substrate. Plated neurons grow on coated areas establishing spontaneous connections and exhibiting electrophysiological activity.

설계, 치료, 세포 도금 및 기능적으로 간 연결 회로의 구성, 모듈 형 신경 네트워크의 배양 표면

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake through electroporation in brain explants with targeted laser illumination and matching filter goggles during the procedure. The described technique of in vitro electroporation by itself yields relatively good visual control for targetting certain areas of the brain. By combining it with laser excitation of fluorescent genetic markers and their read-out through band-passing filter goggles, which can pick up the emissions of the genetically labeled cells/nuclei and the fluorescent tracing dye, a researcher can substantially increase the accuracy of injections by finding the area of interest and controlling for the dye-spread/uptake in the injection area much more efficiently. In addition, the laser illumination technique allows to study the functionality of a given neurocircuit by providing information about the type of neurons projecting to a certain area in cases where the GFP expression is linked to the type of transmitter expressed by a subpopulation of neurons.

We describe a technique to label neurons and their processes via anterograde or retrograde tracer injections into brain nuclei using an in vitro preparation. We modified an existing method of in vitro tracer electroporation by taking advantage of fluorescently labeled mouse mutants and basic optical equipment in order to increase labeling accuracy.

레이저 유도 신경 세포의 추적에서 뇌 외식

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and accurately reconnect them with an appropriate target. Here a procedure is described to rapidly initiate, elongate, and precisely connect new functional neuronal circuits over long distances. The extension rates achieved reach over 1.2 mm/h, 30-60 times faster than the in vivo rates of the fastest growing axons from the peripheral nervous system (0.02 to 0.04 mm/h)28 and 10 times faster than previously reported for the same neuronal type at an earlier stage of development4. First, isolated populations of rat hippocampal neurons are grown for 2-3 weeks in microfluidic devices to precisely position the cells, enabling easy micromanipulation and experimental reproducibility. Next, beads coated with poly-D-lysine (PDL) are placed on neurites to form adhesive contacts and pipette micromanipulation is used to move the resulting bead-neurite complex. As the bead is moved, it pulls out a new neurite that can be extended over hundreds of micrometers and functionally connected to a target cell in less than 1 h. This process enables experimental reproducibility and ease of manipulation while bypassing slower chemical strategies to induce neurite growth. Preliminary measurements presented here demonstrate a neuronal growth rate far exceeding physiological ones. Combining these innovations allows for the precise establishment of neuronal networks in culture with an unprecedented degree of control. It is a novel method that opens the door to a plethora of information and insights into signal transmission and communication within the neuronal network as well as being a playground in which to explore the limits of neuronal growth. The potential applications and experiments are widespread with direct implications for therapies that aim to reconnect neuronal circuits after trauma or in neurodegenerative diseases.

This procedure describes how to rapidly initiate, extend and connect neurites organized in microfluidic chambers using poly-D-lysine-coated beads fixed to micropipettes that guide neurite elongation.

재귀 신경 회로의 연구 : 빠른 신경 돌기 확장과 기능적 신경 연결을위한 새로운 방법

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a closed-loop event-triggered manner. Although many studies are focusing on the possible benefits and side-effects of TES in healthy and pathologic brains, there are still many fundamental open questions regarding the mechanism of action of the stimulation. Therefore, there is a clear need for a robust and reproducible method to test the acute and the chronic effects of TES in rodents. TES can be combined with regular behavioral, electrophysiological, and imaging techniques to investigate neuronal networks in vivo. The implantation of transcranial stimulation electrodes does not impose extra constraints on the experimental design while it offers a versatile, flexible tool to manipulate brain activity. Here we provide a detailed, step-by-step protocol to fabricate and implant transcranial stimulation electrodes to influence brain activity in a temporally constrained manner for months.

This detailed protocol describes transcranial stimulation electrode placement on the temporal bone in order to investigate the short- and long-term effects of transcranial electrical stimulation in freely moving rats.

만성 Transcranial 전기 자극 및 쥐 Intracortical 녹음

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

연 접 기능 그대로 신경 회로 내에 유전자 최저 효과 특성 인공 microRNAs Optogenetics 결합

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Optogenetic 쥐 행동에 Hippocampal 세타 진동의 유입

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively thin to properly visualize and access neurons for patch-clamping or imaging, and in vitro examination of brain circuitry is limited to only what is physically present in the acute slice. To maintain the benefits of in vitro slice experimentation while preserving a larger portion of presynaptic nuclei, we developed a novel slice preparation. This &#8220;wedge slice&#8221; was designed for patch-clamp electrophysiology recordings to characterize the diverse monaural, sound-driven inputs to medial olivocochlear (MOC) neurons in the brainstem. These neurons receive their primary afferent excitatory and inhibitory inputs from neurons activated by stimuli in the contralateral ear and corresponding cochlear nucleus (CN). An asymmetrical brain slice was designed which is thickest in the rostro-caudal domain at the lateral edge of one hemisphere and then thins towards the lateral edge of the opposite hemisphere. This slice contains, on the thick side, the auditory nerve root conveying information about auditory stimuli to the brain, the intrinsic CN circuitry, and both the disynaptic excitatory and trisynaptic inhibitory afferent pathways that converge on contralateral MOC neurons. Recording is performed from MOC neurons on the thin side of the slice, where they are visualized using DIC optics for typical patch-clamp experiments. Direct stimulation of the auditory nerve is performed as it enters the auditory brainstem, allowing for intrinsic CN circuit activity and synaptic plasticity to occur at synapses upstream of MOC neurons. With this technique, one can mimic in vivo circuit activation as closely as possible within the slice. This wedge slice preparation is applicable to other brain circuits where circuit analyses would benefit from preservation of upstream connectivity and long-range inputs, in combination with the technical advantages of in vitro slice physiology.

Integration of diverse synaptic inputs to neurons is best measured in a preparation that preserves all pre-synaptic nuclei for natural timing and circuit plasticity, but brain slices typically sever many connections. We developed a modified brain slice to mimic in vivo circuit activity while maintaining in vitro experimentation capability.

생체 내 신경 회로 연결성 모방을 위한 체외 쐐기 슬라이스 준비

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.