이 작품은 유럽 프로젝트 BRIANBOW (FP7- 젊은 탐험가에 의해 지원되었다, 저자는 원고에 대한 유용한 의견을 박사 코포 Tessadori에게 감사를 표하고, 비디오에 사용 된 그래픽을 생산하는 그녀의 도움 실비아 Chiappalone 것입니다.

절차는 관리 및 실험 동물의 사용을 위해 NIH 기준에 따라 수행하고, 텔 아비브 대학 동물 관리 및 사용위원회 (허가 번호 - L-14-019)에 의해 승인되었다. 인스 트루먼 트와 PDMS 1. 준비 <ol><li> 웨이퍼 준비 (재료의 표를, 또는 미세 실험실에서 웨이퍼 주문), 메스와 핀셋 - 살균이 필요되지 않습니다. </li><li> 다음의 조건에 따라 폴리 D 라이신 (PDL) 용액을 제조 : 4 ㎎ / 0.1 M 보레이트 완충액 ㎖, pH가 8 및 -20 ℃에서. </li><li> 다음 절차에 따라 PDMS 스텐실을 준비합니다 : <ol><li> 베이스 10의 비율로 경화제를 함께 혼합함으로써 폴리 디메틸 실록산 (PDMS, 실리콘 엘라스토머)을 준비 : 1, 그 다음 약 5 분 동안이 물질을 교반한다. </li><li> 15 분 동안 두 번 진공 챔버의 각 시간을두고 확인 거품이 사라 졌어요. </li><li> 언제가스의 사용을 허용하도록 개방 질소 노브를 스피너에 실리콘 웨이퍼 (도 1a)를 배치하고, 이동하는 것을 방지하기 위해 진공을 사용 PDMS 스핀 코터를 준비 준비. </li><li> 웨이퍼 위에 PDMS를 붓고 1,000 rpm에서 1 분간 스피너를 활성화 (약 100 μm의 높이를 만듭니다). </li><li> 30 분 동안 100 ℃에서 핫 플레이트 상에 웨이퍼를 배치했다. </li><li> PDMS이 강화되면, 파스퇴르 피펫을 사용하여, PDMS와 스텐실의 경계를 설명합니다. 30 분 동안 100 ℃에서 핫 플레이트 상에 웨이퍼를 배치했다. </li><li> PDMS 경계가 강화되면, 경계에 따라 스텐실을 잘라 웨이퍼에서 실리콘 스텐실을 벗​​겨 메스를 사용 (하나의 패턴을 포함 제곱 PDMS). </li></ol></li></ol> 2. 페트리 접시 및 커버 슬립 준비 <ol><li> 다음 순서에 따라 23mm 정사각형 유리 커버 슬립을 준비하고 청소 : <ol><li> 증류수, 70 % 에탄올, 아세톤으로 세척 하였다. </li><html><li> 질소 이소프로판올과 빠른 건조와 세척 할 것. </li></ol></li><li> 커버 슬립에 패턴 PDMS 스텐실을 배치하고 부드럽게 그들이 단단히 유리 표면에 부착되어 있는지 확인을 누릅니다. 15 분 동안 진공 챔버에 배치합니다. </li><li> 스텐실에 PDL 1 ㎖를 삭제합니다. 두 번 20 분마다의 진공 챔버에 커버 슬립을 삽입하고, 건조 PDL O / N 두십시오. </li><li> 지원 셀 네트워크를 만들 수 페트리 접시를 준비합니다 : <ol><li> RT에서 2 시간 동안 PDL 1 ㎖와 접시 (3.5 cm)의 표면을 커버. 피펫을 사용하여 PDL 드롭을 제거합니다. </li><li> 증류수로 세척하고 건조 둡니다. 커버 슬립의 각 모서리에 실리콘 그리스의 아주 작은 방울을 놓습니다. </li></ol></li><li> 첨부 파일을 확인하기 위해 조심스럽게 페트리 접시 (즉, PDMS이 위를 향하도록한다)과 언론의 중심에 커버 슬립을 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 핀셋을 사용하여 커버 슬립에서 PDMS를 제거합니다. 멸균, 7 분 동안 UV 조명에 노출. </li></ol>르 &quot;&gt; 3. 다중 전극 어레이 (MEA) 제조 <ol><li> 이 순서 (자료 표)에서 청소 MEA : <ol><li> 농축 효소 세제 탭 및 초음파 처리에서 물을 3 회 반복한다. </li><li> 증류수 3 회에 초음파 처리. </li><li> 30 분 동안 UV 증류 3 회 (후드, 1000 μL 팁) 물과 장소 씻으십시오. </li></ol></li><li> 네트워크 준비 지원 : <ol><li> 설계 지원 네트워크 금형을 준비합니다. <ol><li> 12 웰 플레이트 (22mm 직경)에 PDMS를 붓고. </li><li> PDMS 몰드 꺼내서 메스를 이용하여 경화 될 때, 링 모양을 만들 때 중앙에 구멍을 잘랐다. </li><li> MEA (그림 2A)의 중심에 설계 지원 네트워크 금형을 넣고 실온에서 2 시간 동안 PDL과 표면의 나머지 부분을 커버한다. </li></ol></li><li> 피펫을 사용하여 PDL을 제거하고 증류수로 세척한다. </li><li> 곰팡이를 제거하고 (그림 2A) 건조 둡니다. &lt;/ 리&gt; </ol></li><li> 다음과 같은 방법으로 MEA에 스텐실을 맞 춥니 다 : <ol><li> 지정된 마이크로 매니퓰레이터에 스텐실을 놓습니다. 정확하게 전극 패턴 구조를 맞추고 MEA 표면 (그림 2B)에 배치 될 때까지 스텐실을 낮추기 위해 거꾸로 현미경을 사용합니다. 참고 : 잘 청소 MEA와 연락이 PDMS와 MEA 자체 사이의 경쟁 접착력을 제공합니다. </li><li> 미세 조작기를 올리고, 필요한 경우가 MEA로부터 분리 방지 위에 PDMS 압력 소량 적용 핀셋을 사용한다. </li><li> 조심스럽게 MEA 표면에 스텐실을 누르면 단단히 부착, 잘 정렬되어 있는지 확인하기 위해 현미경을 사용합니다. (도 2C-D). </li></ol></li><li> 15 분 동안 진공 챔버에서 MEA를 배치; 스텐실에 PDL의 1 ml의 드롭을 넣어. </li><li> 20 분 각각 진공 챔버로 2 회를​​ 삽입합니다. 인큐베이터에서 O / N 건조 PDL을 남겨주세요. </li><li> 도금하기 전에, 다자간 환경에서 PDMS에게 스텐실을 제거하고 w 멸균 사용하여 세척ater에. 7 분 동안 UV 조명 아래에 배치합니다. </li></ol> 4. 해​​부와 문화 <ol><li> 헤르 조그 외. 2011 21에 기술 된 바와 같이 문화를 준비합니다. </li></ol> 5. 도금 <ol><li> 혈구 (결과에서 논의 된 회로의 크기에 따라 최적의 농도)을 사용하여, 도금에 필요한 세포의 수를 계산한다. <ol><li> 반드시 계산 챔버 (혈구)를 확인 깨끗하고 그것에 커버 슬립 (청소 사용 알코올)을 배치합니다. </li><li> 매체 (1:20 희석) 190 μL의 도금에서 세포 현탁액 10 μL 희석. </li><li> 로드 (10) 카운팅 챔버의 에지 상으로 희석하고 셀 μL 천천히 자체를 채울 수 있도록 챔버 세포를 피펫. </li><li> 거꾸로 현미경을 사용하여 혈구 그리드를 시각화. 다이렉트 카운팅함으로써 챔버 내의 세포 수를 (건강한 세포가 둥글게한다)을 결정. 큰 광장 witho 내에서 세포를 계산가장자리를 횡단하는 사람들을 UT. </li><li> 세포의 농도를 계산한다 : 세포의 총 수 / 1000 μL = 희석 배수 × × 104 (혈구의 영역) 계산 총 세포. 참고 : 예를 들어, 희석 배수가 20이었고, 계산은 전체 셀 (100)과 같다 : 100 × 20 × 104 = 0.1 × 10 7 세포 / μL 1000 또는 1 × 10 1백분의 6 μL. 0.75 × 106 세포 판형하기 위해, 세포 중 75 μl를 취할. </li></ol></li><li> 단일 MEA 또는 페트리 접시 당 도금에 필요한 세포의 수를 고려해야 응집을 방지하기 위해 세포를 재현 탁하고, patternate 영역의 상단에, 중앙에 그들을 플레이트 (필요한 경우에는 배지에 세포를 희석 할 수있다) . MEA를 들어, 중간에 100 μL 드롭을 배치합니다. 커버 슬립의 경우, 중간에 1000 μL 드롭을 배치합니다. </li><li> 40 분 동안 37 ° C에서 도금 세포를 품어. 1까지, 도금 세포에 도금 매체 추가MEA mL 당 및 커버 슬립 당 ​​2 ml의. </li><li> 0.5 펜 연쇄상 구균, 2 % B-27와 0.75 % 루타가 풍부한 신선한 성장 배지로 희석, 4 일마다 37 ° C로 유지하고. </li><li> 또는 폐해를 방지하기 위해 다른 항 유사 분열 제 6/7 DIV에서, 섬 사이의 연결을 본 후, 10 ㎕의 매체에 희석 / ㎖ FUDR은 (12.5 ml의 MEM (최소 필수 중간 이글) 25 mg을 우리 딘 + 62.5 mg을 유리 딘) 자라. </li></ol>

<ol>
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E., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+neural+representation+capacity+by+modular+architecture+in+networks+of+cortical+neurons.">Enhancement of neural representation capacity by modular architecture in networks of cortical neurons.</a> European Journal of Neuroscience. 35, 1753-1760 (2012).</li><li>Berdondini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microelectrode+array+(MEA)+integrated+with+clustering+structures+for+investigating+in+vitro+neurodynamics+in+confined+interconnected+sub-populations+of+neurons.">A microelectrode array (MEA) integrated with clustering structures for investigating in vitro neurodynamics in confined interconnected sub-populations of neurons.</a> Sensors and Actuators B-Chemical. 114, 530-541 (2006).</li><li>Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+bursting+activity+in+connected+neuronal+sub-populations.">Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations.</a> PloS One. 9, e107400 (2014).</li><li>Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+synchronous+oscillations+in+freely-organized+small+neuronal+circuits.">Innate synchronous oscillations in freely-organized small neuronal circuits.</a> PloS One. 5, e14443 (2010).</li><li>Shein-Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+neuronal+circuits:+a+new+platform+for+studying+the+role+of+modular+topology.">Engineered neuronal circuits: a new platform for studying the role of modular topology.</a> Frontiers in Neuroengineering. 4, 10 (2011).</li><li>Bonifazi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+large-scale+experimental+and+theoretical+studies+for+the+realization+of+bi-directional+brain-prostheses.">In vitro large-scale experimental and theoretical studies for the realization of bi-directional brain-prostheses.</a> Front Neural Circuits. 7, 40 (2013).</li><li>Jungblut, M., Knoll, W., Thielemann, C., Pottek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triangular+neuronal+networks+on+microelectrode+arrays:+an+approach+to+improve+the+properties+of+low-density+networks+for+extracellular+recording.">Triangular neuronal networks on microelectrode arrays: an approach to improve the properties of low-density networks for extracellular recording.</a> Biomedical Microdevices. 11, 1269-1278 (2009).</li><li>Marconi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+functional+properties+of+neuronal+networks+with+controlled+topology.">Emergent functional properties of neuronal networks with controlled topology.</a> PloS One. 7, e34648 (2012).</li><li>Taylor, A. 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J., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+MEA+platform+with+PDMS+microtunnels+enables+the+detection+of+action+potential+propagation+from+isolated+axons+in+culture.">Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture.</a> Lab Chip. 9, 404-410 (2009).</li><li>Georger, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coplanar+Patterns+of+Self-Assembled+Monolayers+for+Selective+Cell-Adhesion+and+Outgrowth.">Coplanar Patterns of Self-Assembled Monolayers for Selective Cell-Adhesion and Outgrowth.</a> Thin Solid Films. 210, 716-719 (1992).</li><li>Torimitsu, K., Kawana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Growth+of+Sensory+Nerve-Fibers+on+Metal-Oxide+Pattern+in+Culture.">Selective Growth of Sensory Nerve-Fibers on Metal-Oxide Pattern in Culture.</a> Developmental Brain Research. 51, 128-131 (1990).</li><li>Branch, D. W., Corey, J. M., Weyhenmeyer, J. A., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstamp+patterns+of+biomolecules+for+high-resolution+neuronal+networks.">Microstamp patterns of biomolecules for high-resolution neuronal networks.</a> Medical &amp; Biological Engineering &amp; Computing. 36, 135-141 (1998).</li><li>Petrelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-volume+drop+patterning+for+rapid+on-chip+neuronal+connect-ability+assays.">Nano-volume drop patterning for rapid on-chip neuronal connect-ability assays.</a> Lab on a Chip. 13, 4419-4429 (2013).</li><li>Boehler, M. D., Leondopulos, S. S., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+networks+on+reliable+patterned+substrates.">Hippocampal networks on reliable patterned substrates.</a> Journal of Neuroscience Methods. 203, 344-353 (2012).</li></ol>

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기능적으로 상호 연결된 회로로 구성된 시험 관내에서 2D 모듈러 신경 네트워크를 성장 프로토콜을 설명한다. 절차는 세포 접착층을 패턴에 기초한다. 패터닝 PDMS 스텐실 원하는 네트워크 아키텍처의 음 재생 기능에 의해 달성된다. PDMS 스텐실 셀룰러 접착제 층이 증착되는 영역을 정의한다. 세포가 도금되면, 그들은 자발적으로 코팅 된 섬에 조립하고 활성 간 연결 회로에 자기 조직화. MEA?...

실험적이고 이론적 인 증거는 뇌 일시적 서로 다른 기본 성형 및 뇌의 상태와 상호 작용하는 동적 기능 유닛으로 간주 될 수있는 셀 어셈블리 1-5의 배위 활성화를 통해 동작 할 가능성을 지원한다. 기능 모듈 방식에 의존하고 또한 뇌 회로의 구조적 -6,7- 모듈러 조직과 관련된다. 어떻게 기능과 뇌 회로의 구조가 서로 서로를 형성하는 것은 여전히​​ 신경 과학의 주요 열려있는 질문 중 하나입니다. 이 질문에 대한 깊은 이해를 제공하기 위해, 그것이 해결하는 것이 가능하다, 여기서 적어도 부분적으로, 이러한 문제를 최적 실험 프레임 워크를 파악하는 것이 중요하다. 생체 내 실험에서 신경 네트워크의 시공간적 역학의 조작을 제어하기 때문에 체외 신경 네트워크 모델의 개발이 용이 ACC 인해 상당한 관심의 대상이며, 도전essibility, 모니터링, 조작 및 8,9 모델링. 최근, 진보 된 기판의 패터닝 방법에 의해 지원되는 기술에 대한 시험 관내 소정 모듈러 구조 (3)의 범위를 개발하기 위해 부과 된 토폴로지 (10)와 네트워크의 기능적 특성을 연구하는 신경 네트워크를 유도 할 수있다. 특히, 방법은 최근 4,11 물리적 제약을 부과하여 네트워크를 구성하는 데 사용 하였다. 실제로, 신경 네트워크의 구조 및 기능 사이의 관계를 연구하는 신경 세포의 상호 작용을 어셈블리 단순화하지만 그럴듯한 표현을 제공하기 위해, 시험 관내 시스템은 상호 접속 된 신경 하위 집단을 제공한다. 널리 연구 2D 균질의 연결을 문화는 회로의 자기 조직 응급 배선에 어떤 공간 제약을 부과하지 않습니다. 따라서 가능한 접근 방법은 말다툼에서 다른 신경 세포 인구의 위치를​​ 인위적으로 상호 연결된 셀 어셈블리입니다 모양ially 별개의 영역. 이 지역들 사이의 거리가 간 어셈블리 연결을 방지하지 않습니다. 네트워크 복잡성 상당한 오버 제어를 유지하면서 이러한 접근법은 동기화 모델 6,7,12의 풍부한 레퍼토리를 제공하는 것으로 나타났다. 모듈의 연결 조립체의 재현성 배양을 용이하게하기 위해, 프로토콜은 제시되고 설명된다 축삭 및 수상 돌기로 연결된 뉴런 네트워크 클러스터로의 자기 조직화를 조립한다. 의 연결을 문화의 물리적 제한에 대한 고분자 구조는 polydimtheylsiloxane (PDMS)에서 작성되었습니다. PDMS는 널리 가스 (13)에 생체 적합성, 투명성과 투과성 때문에 생물 의학 응용 프로그램에 사용되는 엘라스토머이다. PDMS 스핀 코팅 잭맨 등 알에서 전술 한 바와 같이 &quot;마스터&quot;에 액체 PDMS를. (16) T에 의해 2075 14,15 구조를 준비하고 미세 가공 SU8에서 제외됩니다그는 다른 크기의 간 연결 모듈로 구성되어 신경 네트워크를 패턴 화 달성 그들은 모두를 성공적으로 된 커버와 마이크로 전극 배열 (다자간) 17 ~ 20에서 얻어졌다. 모듈들 사이의 연결 밀도는 모듈들 사이의 일시적인 동기 상태로 균일 문화 전형적인 완전히 동기화 된 네트워크에서, 네트워크 동기화의 기능을 변경할 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PDMS, Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Vacuum Chamber</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>5305-0609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine PDL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone grease - SILICAID 1010</td>
			<td>&#160;aidchim Ltd</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>Laurell - Technologies Corporation</td>
			<td>WS-650-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well culture plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8217;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone grease - SILICAID 1010</td>
			<td>&#160;aidchim Ltd</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA1060-Inv-BC</td>
			<td>Multi Channel Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC02</td>
			<td>Multi Channel Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Biological Industries Beit Haemek</td>
			<td>03-033-1c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Minimum Essential Medium-Eagle</td>
			<td>Biological Industries Beit Haemek</td>
			<td>01-025-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Electrode Arrays 4Q</td>
			<td>Multi Channel Systems</td>
			<td>60-4QMEA1000iR-Ti-pr</td>
			<td>cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicon wafer</td>
			<td>microchem</td>
			<td>SU8-2075</td>
			<td>Preparation protocol: www.microchem.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design, surface treatment, cellular plating, and culturing of modular neuronal networks composed of functionally inter-connected circuits

뇌는 조정 활성화 및 신경 어셈블리의 동적 통신을 통해 작동합니다. 가장 큰 의문은 가장 다양한 뇌 기능의 기초가 동적 모티프의 광대 한 레퍼토리는, 뇌 회로의 고정 위상 및 모듈 형 조직에서 나올 수있는 방법이다. 고유 실험 어려움을 제시 신경 회로의 생체 내 연구에 비해 체외 준비가 조작하고 실험 신경 시스템의 구조적, 역학적, 화학적 특성을 조사하기 위해 훨씬 더 큰 가능성을 제공합니다. 이 작품은 공간적으로 별개의, 기능적으로 상호 연결된 신경 어셈블리로 구성 모듈 형 네트워크의 성장 수있는 시험 관내 실험 방법을 설명합니다. 프로토콜 복잡도의 위상 다른 레벨에서 신경 네트워크의 2 차원 구조를 제어한다. 원하는 네트워크 패턴이 될 수 있습니다일반 커버 슬립 기판 내장 된 마이크로 전극 배열에 모두 달성했다. 미세 가공 된 구조물은 실리콘 웨이퍼 상에 양각 및 원하는 네트워크 아키텍처의 부정적인 특징을 통합 생체 적합성 고분자 스텐실을 만드는 데 사용된다. 스텐실은 세포 접착을 촉진하는 분자 층으로 표면 코팅 과정 동안 배양 기판 상에 배치된다. 스텐실 제거한 후, 뉴런 도금 이들은 자발적 코팅 분야로 재. 구획 간 거리가 감소함으로써, 격리 또는 상호 연결된 하나의 연결 회로를 얻을 수있다. 세포 생존을 촉진하기 위해, 세포는 배양 접시의 외주에 위치하고지지 신경 네트워크와 공 배양된다. 기판 매립 마이크로 전극 배열 및 칼슘 이미징을 사용하여 각각 얻어진 모듈러 네트워크 활동의 전기 생리 광학 녹음 제시된다. 각 모듈은 spont을 표시하는 동안aneous 글로벌 동기화가 모듈 간 동기화의 발생 회로들 사이의 연결 밀도에 의해 조절된다.

약 100 ㎛의 두께를 갖는 특징 실리콘 웨이퍼 상 SU8-2075 PDMS 몰드를 형성하기 위해 사용되었다. 패턴은 변의 길이와의 거리가 200 내지 700 ㎛의 (도 1b)를 가변하여, 여러 사이즈의 사각형으로 구성되었다. 사각형의 크기와 20 배 목표의 (측면 길이 &lt;400 μm의와 섬에 대한) (측면 길이 &lt;800 μm의와 섬에 대한) 10 배의 시야에 맞게 선택되었다. 세 개의 매개 변수, 즉 회로 사이의 도금 셀 밀?...

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Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-connected Circuits

이 원고는 공간적으로 제한, 기능적으로 상호 연결된 신경 회로로 구성된 체외 모듈 형 네트워크에서 성장하는 프로토콜을 설명합니다. 마스크는 폴리머 기판 위에 배양 세포 접착을 촉진하는 단백질 패턴 층을 사용한다. 도금 뉴런 코팅 분야 자발적인 연결을 설정 및 전기 생리 활성을 나타내는에서 성장.

설계, 치료, 세포 도금 및 기능적으로 간 연결 회로의 구성, 모듈 형 신경 네트워크의 배양 표면

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire ...

design-surface-treatment-cellular-plating-culturing-modular-neuronal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.4K 조회수.  Tel-Aviv University.  이 원고는 공간적으로 제한, 기능적으로 상호 연결된 신경 회로로 구성된 체외 모듈 형 네트워크에서 성장하는 프로토콜을 설명합니다. 마스크는 폴리머 기판 위에 배양 세포 접착을 촉진하는 단백질 패턴 층을 사용한다. 도금 뉴런 코팅 분야 자발적인 연결을 설정 및 전기 생리 활성을 나타내는에서 성장. 

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Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into diverse subtypes based on their immunochemical, morphological, and physiological properties1-4. Although previous research has revealed much about intrinsic properties of individual types of inhibitory neurons, knowledge about their local circuit connections is still relatively limited3,5,6. Given that each individual neuron's function is shaped by its excitatory and inhibitory synaptic input within cortical circuits, we have been using laser scanning photostimulation (LSPS) to map local circuit connections to specific inhibitory cell types. Compared to conventional electrical stimulation or glutamate puff stimulation, LSPS has unique advantages allowing for extensive mapping and quantitative analysis of local functional inputs to individually recorded neurons3,7-9. Laser photostimulation via glutamate uncaging selectively activates neurons perisomatically, without activating axons of passage or distal dendrites, which ensures a sub-laminar mapping resolution. The sensitivity and efficiency of LSPS for mapping inputs from many stimulation sites over a large region are well suited for cortical circuit analysis.
Here we introduce the technique of LSPS combined with whole-cell patch clamping for local inhibitory circuit mapping. Targeted recordings of specific inhibitory cell types are facilitated by use of transgenic mice expressing green fluorescent proteins (GFP) in limited inhibitory neuron populations in the cortex3,10, which enables consistent sampling of the targeted cell types and unambiguous identification of the cell types recorded. As for LSPS mapping, we outline the system instrumentation, describe the experimental procedure and data acquisition, and present examples of circuit mapping in mouse primary somatosensory cortex. As illustrated in our experiments, caged glutamate is activated in a spatially restricted region of the brain slice by UV laser photolysis; simultaneous voltage-clamp recordings allow detection of photostimulation-evoked synaptic responses. Maps of either excitatory or inhibitory synaptic input to the targeted neuron are generated by scanning the laser beam to stimulate hundreds of potential presynaptic sites. Thus, LSPS enables the construction of detailed maps of synaptic inputs impinging onto specific types of inhibitory neurons through repeated experiments. Taken together, the photostimulation-based technique offers neuroscientists a powerful tool for determining the functional organization of local cortical circuits.

This paper introduces an approach of combining laser scanning photostimulation with whole cell recordings in transgenic mice expressing GFP in limited inhibitory neuron populations. The technique allows for extensive mapping and quantitative analysis of local synaptic circuits of specific inhibitory cortical neurons.

레이저 스캐닝 Photostimulation에 의해 억제 Neuronal 회로를 매핑

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into ...

연구

신경과학

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

글루타민산 염과 GABA의 빠른 마이크로 이온 도입 : 시냅틱 통합을 조사하는 유용한 도구

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell level. The technique allows experimenters to examine temporally and regionally specific firing patterns in order to correlate recorded action potentials with ongoing behavior. Moreover, single-unit recordings can be combined with a plethora of other techniques in order to produce comprehensive explanations of neural function. In this article, we describe the anesthesia and preparation for microwire implantation. Subsequently, we enumerate the necessary equipment and surgical steps to accurately insert a microwire array into a target structure. Lastly, we briefly describe the equipment used to record from each individual electrode in the array. The fixed microwire arrays described are well-suited for chronic implantation and allow for longitudinal recordings of neural data in almost any behavioral preparation. We discuss tracing electrode tracks to triangulate microwire positions as well as ways to combine microwire implantation with immunohistochemical techniques in order to increase the anatomical specificity of recorded results.

Implanting organized arrays of microwires for use in single-unit electrophysiological recordings presents a number of technical challenges.&#160;Methods for performing this technique and the equipment necessary are described.&#160;Also, the beneficial use of organized microwire arrays to record from distinct neural subregions with high spatial selectivity is discussed.

동물 행동하자, 깨어있는 단일 단위 레코딩을위한 Microwires의 조직 된 배열을 주입하기위한 절차

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

소뇌 과립 신경 세포의 유전자 조작<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em&gt; 신경 세포의 형태와 마이그레이션을 연구하는

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation of a given stimulus might be dependent on context and history. If this is actually the case, bi-directional interactions between the brain (or if need be a reduced model of it) and sensory-motor system can shed a light on how encoding and decoding of information is performed. Here an experimental system is introduced and described in which the activity of a neuronal element (i.e., a network of neurons extracted from embryonic mammalian hippocampi) is given context and used to control the movement of an artificial agent, while environmental information is fed back to the culture as a sequence of electrical stimuli. This architecture allows a quick selection of diverse encoding, decoding, and learning algorithms to test different hypotheses on the computational properties of neuronal networks.

In this paper, an experimental framework to perform closed-loop experiments is presented, in which information processing (i.e., coding and decoding) and learning of neuronal assemblies are studied during the continuous interaction with a robotic body.

폐쇄 루프 신경 로봇 실험은 신경 네트워크의 전산 등록을 테스트하는

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and accurately reconnect them with an appropriate target. Here a procedure is described to rapidly initiate, elongate, and precisely connect new functional neuronal circuits over long distances. The extension rates achieved reach over 1.2 mm/h, 30-60 times faster than the in vivo rates of the fastest growing axons from the peripheral nervous system (0.02 to 0.04 mm/h)28 and 10 times faster than previously reported for the same neuronal type at an earlier stage of development4. First, isolated populations of rat hippocampal neurons are grown for 2-3 weeks in microfluidic devices to precisely position the cells, enabling easy micromanipulation and experimental reproducibility. Next, beads coated with poly-D-lysine (PDL) are placed on neurites to form adhesive contacts and pipette micromanipulation is used to move the resulting bead-neurite complex. As the bead is moved, it pulls out a new neurite that can be extended over hundreds of micrometers and functionally connected to a target cell in less than 1 h. This process enables experimental reproducibility and ease of manipulation while bypassing slower chemical strategies to induce neurite growth. Preliminary measurements presented here demonstrate a neuronal growth rate far exceeding physiological ones. Combining these innovations allows for the precise establishment of neuronal networks in culture with an unprecedented degree of control. It is a novel method that opens the door to a plethora of information and insights into signal transmission and communication within the neuronal network as well as being a playground in which to explore the limits of neuronal growth. The potential applications and experiments are widespread with direct implications for therapies that aim to reconnect neuronal circuits after trauma or in neurodegenerative diseases.

This procedure describes how to rapidly initiate, extend and connect neurites organized in microfluidic chambers using poly-D-lysine-coated beads fixed to micropipettes that guide neurite elongation.

재귀 신경 회로의 연구 : 빠른 신경 돌기 확장과 기능적 신경 연결을위한 새로운 방법

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at the plasma membrane. Here, we present detailed protocols for 2 methods that facilitate the study of such processes, both of which are based on the principle of the biotinylation of cell-surface proteins. The first is designed to allow for the semi-quantitative determination of the relative levels of a particular protein at the cell-surface. In it, the lysine residues of the plasma membrane proteins of cells are first labeled with a biotin moiety. Once the cells are lysed, these proteins may then be specifically precipitated via the use of agarose-immobilized streptavidin by exploiting the natural affinity of the latter for biotin. The proteins isolated in such a manner may then be analyzed via a standard western blotting approach. The second method provides a means of determining the endocytic rate of a particular cell-surface target over a period of time. Cell-surface proteins are first modified with a biotin derivative containing a cleavable disulfide bond. The cells are then shifted back to normal culture conditions, which causes the endocytic uptake of a proportion of biotinylated proteins. Next, the disulfide bonds of non-internalized biotin groups are reduced using the membrane-impermeable reducing agent glutathione. Via this approach, endocytosed proteins may thus be isolated and quantified with a high degree of specificity.

Two biotinylation-based methods, designed for determining the cell-surface expression and endocytic rate of proteins expressed at the plasma membrane, are presented in this report.

Biotinylation을 사용하여 기본 Astrocyte 문화에서 단백질의 세포 표면 표현 및 Endocytic 속도를 결정

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a closed-loop event-triggered manner. Although many studies are focusing on the possible benefits and side-effects of TES in healthy and pathologic brains, there are still many fundamental open questions regarding the mechanism of action of the stimulation. Therefore, there is a clear need for a robust and reproducible method to test the acute and the chronic effects of TES in rodents. TES can be combined with regular behavioral, electrophysiological, and imaging techniques to investigate neuronal networks in vivo. The implantation of transcranial stimulation electrodes does not impose extra constraints on the experimental design while it offers a versatile, flexible tool to manipulate brain activity. Here we provide a detailed, step-by-step protocol to fabricate and implant transcranial stimulation electrodes to influence brain activity in a temporally constrained manner for months.

This detailed protocol describes transcranial stimulation electrode placement on the temporal bone in order to investigate the short- and long-term effects of transcranial electrical stimulation in freely moving rats.

만성 Transcranial 전기 자극 및 쥐 Intracortical 녹음

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Optogenetic 쥐 행동에 Hippocampal 세타 진동의 유입

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

깨어 있는 생쥐의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...