이 연구는 NIH 보조금 K08 AI062732, K12 HD001401 및 1UL1RR024139 - 02과 SB - M에 찰스 H. 후드 재단의 아동 건강 연구소 부여에 의해 투자되었다. 와 스토니 브룩 뉴욕 주립 대학의에서 연구 재단.

1. EBV 재고 준비 <ol><li> 멸균 기술을 사용하여 75cm이 조직 문화 플라스크에서 3 × 10 5 세포 / ML에서, 기하 급수적으로 B95 - 8 세포 (13 ATCC # CRL 1612) 성장 Subculture. 전지는 37 0.5 μg / ML에서 각각 10 %의 열 inactivated 태아 소 혈청 (FBS), 페니실린 / 100U/ml에서 스트렙토 마이신과 100 μg / ML을 포함하는 완전한 RPMI 1640에서 성장하고, Amphotericin B 아르 ° C를 면전에서 5% CO 2. </li><li> 마흔 여덟 시간 후, 1 × 10 6 세포 / ML에서 신선한 완료 RPMI 1640에 resuspend 세포. 바이러스 생산을 유발하기 위해서, 표준 CO 2 배양기에서 1 시간 동안 20ng/ml tetradecanoyl phorbol 아세테이트 (TPA)와 세포를 자극. TPA를 제거하는 RPMI 1640과 세포 세 번 씻으십시오. </li><li> 전체 RPMI 1640의 원래 볼륨 (1.2부터)에 세포를 Resuspend 및 96시간에 대한 CO 2 배양기에서 술병을 배치. 이 방법은 전염성 바이러스 파의 높은 titers을 생산하기 위해 표시되었습니다ticles 6. </li><li> 4 10 분 600 X g에서 원심 ° C 세포에서 EBV - 포함된 문화 뜨는 분리 수 있습니다. 년 이상 -70에서 0.45 - 마이크론 필터, 나누어지는 및 저장 ° C를 통해 필터 뜨는. 대안은 ATCC (VR - 1492)에서 EBV를 포함하는 B95 - 8 세포에서 뜨는을 획득하고 ATCC에서 권장하는 희석에 사용하는 것입니다. </li></ol> 2. 말초 혈액 mononuclear 세포 (PBMC)의 분리 <ol><li> heparinized 주사기 또는 heparinized 혈액 튜브에 기증자 10 ML 혈액을 그립니다. 50 ML 원뿔 튜브의 상온 20 ML PBS로 혈액을 희석. </li><li> 15 ML Ficoll Hypaque 림프구 분리 매체와 밑받침 희석 혈액. 30 분 동안 상온에서 브레이크없이 225 X g에서 원심 분리기. </li><li> 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 버피 코트와 송금을 제거합니다. PBS로 50 ML에 볼륨을 인상하고 10 분 동안 상온에서 600 XG에 스핀. </li><li> Pou뜨는 해제 R. 50 ML PBS에서 펠렛을 resuspending 10 분 상온에서 600 X g에서 회전하여 세포를 씻으십시오. 비슷한 방식으로 두 번 이상 씻으십시오. </li><li> Resuspend 완료 RPMI 1 ML에서 세포를 씻어. Trypan 파란색으로 10분의 1 희석을 준비하는 세포의 5 μL를 사용하십시오. hemocytometer를 사용하여 라이브 세포를 세어보세요. </li><li> 2 × 10 6 / ML의 세포 농도를 구하는 25cm이 조직 문화 플라스크에 완료 RPMI를 사용하여 볼륨을 조정합니다. </li></ol> 3. EBV로 감염 <ol><li> 2.6 20 NM의 최종 농도로 세포 현탁액에 FK506을 (AG 과학) 추가합니다. 37 CO 2 배양기에 넣어 플라스크 ° 한 시간 만이라도 C. </li><li> 신속 EBV의 나누어지는을 녹여. 인큐베이터에서 플라스크를 제거하고 10분의 1 희석에있는 세포에 EBV를 추가합니다. 일반적으로이 희석은 방어 50-100을 제공합니다. 37 믹스와 CO 2 배양기에서 똑바로 그것을 배치 소용돌이 플라스크 ° C. </li></ol> 참고 일성공적인 결과를 예측 수행 4 단계에서 단계는 선택 사항입니다. 4 단계는 수행할 수있다면, 당신은 통제로이 X 10 6 세포 / ML에서 취소 감염 PBMC의 추가 휴대용 술병을 품어해야합니다. 4. 세포 proliferating 인구 (선택 단계)를 식별 <ol><li> PBS + 5퍼센트 FBS : FACS 버퍼를 준비합니다. 4 저장 ° C. </li><li> 다음과 같은 항체 단계 4.6에서 세포를 얼룩 50 μL 부피 각 혼합합니다. 항체 dilutions는 마우스 IgG (시그마)의 1mg/ml이 항체에 의한 비 특정 바인딩을 억제하기 위해 포함 FACS 버퍼에하여야한다. <ol class="lroman"><li> PE 복합 백신 CD23 항체 (50분의 1 희석)로 단일 얼룩진 </li><li> FITC 복합 백신 CD58 항체 (50분의 1 희석)로 단일 얼룩진 </li><li> PE - Cy5 복합 백신 CD19 항체 (50분의 1 희석)로 단일 얼룩진 </li><li> CD23, CD58, CD19 및 (50분의 1 희석 각)의 트리플 얼룩진 </li><li> PE 복합 isotype 컨트롤과 함께 단일 얼룩진항체가 (안티 CD23 항체와 같은 농도에서) CD23 - PE와 일치 </li><li> (안티 CD58 항체와 같은 농도에서) CD58 - FITC FITC와 일치 복합 isotype 제어 항체와 단일 얼룩진 </li><li> 로 단일 PE - Cy5 묻은 복합 isotype 제어 항체는 일치 CD19 - PE - Cy5 (안티 CD19 항체와 같은 농도에서) </li><li> 세 isotype 제어 항체와 트리플 얼룩. </li></ol> 임시 어둠의 4 ° C에서 믹스를 저장합니다. </li><li> EBV에 3 일이 후 노출에 부드럽게 소용돌이 플라스크는보다 균일한 세포 현탁액을 얻을 수 있습니다. 2ml Eppendorf 튜브에 플라스크에서 2ml를 제거합니다. 3 분 상온에서 3,000 rpm으로 microcentrifuge에 튜브를 돌려. </li><li> 5 X 10월 6일부터 1일까지 X 10 7 세포 / ML에서 FACS 버퍼에 뜨는 및 resuspend 세포를 기음. </li><li> 여덟 50μl 개별 Eppendorf 튜브에 aliquots 또는 96 - 웰 V - 바닥 플레이트를 제거합니다. 스핀 튜브 또는 1,500 X g에서 판3 분. </li><li> 뜨는 및 와동 튜브 / 접시를 폐기하십시오. 각각의 튜브에 Resuspend 세포 / 음 4.2 준비 적절한 항체 dilutions을 포함 FACS 버퍼 50 μL 인치 </li><li> 30 분 어둠 속에서 얼음 튜브 / 플레이트를 품어. 3 분 3,000 rpm으로 원심 분리기 세포는 표면에 뜨는 제거 및 FACS 버퍼 200 μL를 추가합니다. 또 세포를 원심 분리기와 세척을 완료 뜨는 제거합니다. 두 번 더 씻는다를 반복합니다. </li><li> 200 μL FACS에서 Resuspend 세포가 20,000 사건 / 튜브를 취득 흐름 cytometer를 사용하여 데이터를 버퍼와 취득. </li><li> WinMDI를 (PC에서 FACS 데이터 분석을위한 프리웨어)를 사용하여 데이터를 분석할 수 있습니다. 순방향 및 측면 산란 프로파일을 사용하여 라이브 세포 게이트. 그런 다음, 안티 CD19 항체에 일치하는 isotype 제어 항체 물들일 세포와 비교 후 CD19 + (B 세포 마커)의 표현을위한 게이트 살 세포. 플롯 CD19 + B 사는 Y 축에 대한 X 축 및 CD58에 대한 형광 강도에 CD23에 대한 형광 강도와 세포. 결정 CD23 + 및 CD58 + 일치 isotype 제어 항체 물들일 EBV 노출 세포에 비교하여 세포. EBV 노출 문화에 CD23 CD58 + 세포 안녕하세요 (그림 2C)의 존재는 EBV에 감염된 세포 성장 변화의 성공적인 파생물을 예측합니다. 세포 EBV (그림 2A)에 노출 또는 EBV (그림 2B)의 비 immortalizing 변형에 노출되지 않은 경우 반대로, CD23 CD58 + 안녕하세요 전지는 등장하지 않습니다. CD23 안녕 CD58 + 세포가 실험적으로 확산을 받아야 시연 및 이후 LCL (14)을 수립하고 있습니다. </li></ol> 5. LCL의 확장 및 cryopreservation <ol><li> 가벼운 현미경에 의한 세포의 시각화 : EBV 감염 후 일주일함으로써, 세포의 클러스터는 가벼운 현미경으로 볼 수 있습니다. 그림 3은 플라스크에 초기 미세한 클러스터 (그림 3B)의 예를 보여줍니다. </li><li> 시간이 진행되면서 미세한 클러스터는 큰 그러한 것을 대단히 짧은 시간이 표시되는가macroscopically 술병 인치 그림 3C는 가벼운 현미경에 의해 설립된 LCL의 세포의 큰 클러스터를 보여줍니다. </li><li> 세포를 먹이 : 일 12 일 문화 플라스크에 배지의 볼륨을 두 번. 그 후, 전체 RPMI를 사용하여 볼륨을 2-3 배 증가하여 문화를 확장합니다. </li><li> 먹이 세포의 주기성은 세포 성장 속도에 따라 결정되어야합니다. 문화 매체가 노란색 켜면, 일반적으로 위와 같이 미디어를 대체하는 시간이다. 일반적으로이 한번 주당 발생합니다. 그러나, 일부 세포 라인은 더 많거나 적은 빈도로 공급해야 할 수 있습니다. 다음 몇 주 동안 75-100 ML에 문화를 확장합니다. </li><li> Cryopreservation : 세포를 냉동하면 상온에서 10 분 동안 600 X g에서 원심 세포. 1 X 10 7 세포 / ML 90 % FBS를 포함하는 차가운 냉동 미디어와 10 % dimethylsulfoxide에 뜨는 및 resuspend 세포 펠렛을 제거합니다. 액체 질소에 넣어 튜브. </li></ol> 6. 대표 결과 : 성공적인 결과는 CD23 CD58 + 세포 안녕의 존재가 예측됩니다. EBV에 노출된 후 3-4일에 살고 세포의 약 2-3 %가이 프로필 (그림 2C)가한다. 기타 CD23의 하위 인구 +, CD23 - CD58 +, CD58과 - 전지는 EBV에 노출된 후 최소한의 확산 14 보여주 관찰했다. EBV의 비 immortalizing 부담을 품고 HH514 - 16 세포 (그림 2B)에서 EBV에 노출된 취소 감염된 세포 (그림 2A)와 세포는 CD23 CD58 + 세포 안녕을 설명하지 않습니다. 일주일 이내에, 앞서 언급한 EBV 감염 후 플라스크에 세포의 작은 클러스터 조명 현미경 (그림 3B)에서 볼 수 있습니다 : 당신은 또한 성공적인 결과를 모니터링하는 가벼운 현미경으로 세포를 시각화 수 있습니다. 시간 진행과 세포가 LCL로 발전로서 미세한 클러스터는 대단히 짧은 시간은 술병에 macroscopically 볼 수 있습니다 그러한 (3C 그림) 큰됩니다. 그림 1. lymphoblastoid 세포 라인의 생성 및 cryopreservation을위한 워크플로. 주변 혈액 Ficoll 기울기를 통해 centrifuged입니다. 설립 그라디언트의 버피 코트를 입고 PBMC 선물은 EBV의 또한 다음 FK506에 노출되어 있습니다. EBV - 노출된 세포는 37 ° C 수립 이후 cryopreservation에 대한 LCL을 확대하여 5 % CO 2의 존재에 재배하고 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3321/3321fig2.jpg" /> 그림 2. EBV에 노출 후 확산을 받아야 것으로 예상 B 세포의 하위 인구의 식별. 취소 감염된 PBMC (A) 또는 PBMC가 HH514 - 16 세포 (B) 또는 FK506의 존재에 B95 - 8 세포 (C)에서 파생된 EBV에 노출하는 것은 일 3 수확했다. 세포는 CD19, CD23, CD58에 대한 감독 및 fluorochrome - 복합 항체로 얼룩진했다. 라이브 세포에 게이팅 후의, 취소 감염 (A)와 EBV 노출 (B와 C) CD19 + B 세포는 CD23과 CD58의 표현을위한 검사되었습니다. CD23의 CD58와 높은 수준 (CD23 CD58 + 하이)를 표현하는 B 세포의 하위 인구가 그려져 있습니다, 오직 능력 변환 EBV (B95 - 8 세포에서 파생된)에 노출 세포에서 관찰했다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3321/3321fig3.jpg" /> 그림 3. EBV에 감염된 세포에서 세포 클러스터의 시각화. PBMC는 FK506과 치료 및 EBV에 감염되었습니다. 취소 감염 (A)와 EBV 노출 (B) 세포 위상 콘트라스트 현미경 (10X 배율)로 일주 후 감염 검사되었습니다. 다섯 주 오래된 lymphoblastoid 전지 라인은 C로 표시됩니다

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 문서에서 설명하는 방법은 빠른 불멸화 및 cryopreservation 시간으로 기증자 말초 혈액에서 LCL를 생성합니다. FK506의 사용을 통해, T 세포 면역 반응 억제제를, 그리고 전염성 바이러스의 높은 titers 우리는 주변 혈액 mononuclear 세포에서 EBV에 감염된 B 세포의 증식을 촉진 할 수 있습니다. 이러한 개입은 후속 실험을 위해 세포의 급속한 확대의 결과로, 설명한 방법보다 효율적으로합니다. 전통적으로 성장 변화는 EBV 6 15 노출 후 주일 가벼운 현미경에 의한 세포의 클러스터의 시각화에 의해 감시되었다. 그러나, 세포의 클러스터링은 EBV - 인한 성장 변환의 특정 표시되지 않습니다. 우리는 이전에 삼일 후미 빠르면 성공적인 결과를 결정하기 위해 정확하고 구체적인 방법을 제공 유동세포계측법 14를 통해 proliferating 세포 인구의 지속적인 신분을 증명하고있다EBV에 B 세포의 보틀 노출.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Amphotericin B </td><td> 피셔 Bioreagents </td><td> BP 928-250 </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxide </td><td> 시그마 </td><td> D 2650 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청, 열 inactivated </td><td> 시그마 </td><td> F 4135 </td></tr><tr><td> Ficoll Hypaque의 림프구 분리 미디어 </td><td> Mediatech </td><td> 25-072 </td></tr><tr><td> FK506 </td><td> AG 과학 </td><td> F 1030 </td></tr><tr><td> 마우스 혈청에서 IgG </td><td> 시그마 </td><td> 전 8765 </td></tr><tr><td> PE에 복합 마우스 안티 - 인간 CD23 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555,711 </td></tr><tr><td> PE에 복합 마우스 isotype IgG1 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554,680 </td></tr><tr><td> FITC에 복합 마우스 안티 - 인간 CD58 </td><td> 피어스 써모 SCientific </td><td> MA1 - 82159 </td></tr><tr><td> FITC에 복합 마우스 isotype IgG1 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550,616 </td></tr><tr><td> PE - Cy5에 복합 마우스 안티 - 인간 CD19 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555,414 </td></tr><tr><td> PE - Cy5에 복합 마우스 isotype IgG1 </td><td> Dako </td><td> X 0,955 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 미디어 </td><td> 시그마 </td><td> R 8758 </td></tr><tr><td> Tetradecanoyl phorbol 아세트산 (TPA) </td><td> Calbiochem </td><td> 407,952 </td></tr><tr><td> FACS 버퍼 (1X 인산은 식염수 버퍼 + 5% 태아 소 혈청)을 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

establishment of epstein-barr virus growth-transformed lymphoblastoid cell lines

엡스타인 - 바 바이러스 (EBV)와 B 세포의 감염은 체외에서 lymphoblastoid 셀 라인 (LCL)의 설립에 결과 증식 및 후속 불멸화 발생합니다. LCL은 latently EBV에 감염되므로, 그들은 EBV 지연 및 바이러스 기반의 B 세포 증식과 tumorigenesis 1 조사 모델 시스템을 제공합니다. LCL은 immunologic의 assays 2, 3의 다양한 항원을 제시하는 데 사용되었습니다. 또한, LCL은 인간 단클론 항체 4, 5를 생성하고 기본 생물 학적 물질에 대한 액세스가 6, 7 제한됩니다 잠재적으로 무제한 소스를 제공하는 데 사용할 수 있습니다. 다양한 방법은 LCL을 생성 설명했습니다. 이전 방법은 phytohemagglutinin, lipopolysaccharide 8로 mitogens의 사용을 포함하고, EBV - 중재 불멸화의 효율성을 높이기 위해 mitogen 9 pokeweed있다. 최근 다른 immunosuppr를 사용한같은 시클 로스 포린과 같은 essive 에이전트는 감염된 B 세포 7, 10-12의 T 세포 - 매개 살인을 억제합니다. EBV 감염의 세포 라인 설립 시간의 상당한 길이는 EBV 중심 B 세포의 성장 변환에 대한 더 빠르고, 좀 더 신뢰할 수있는 방법에 대한 요구 사항을 드라이브. 높은 titer EBV와 immunosuppressive 대리인의 조합을 사용하여, 우리는 지속적으로, 감염 변환, 그리고 주변 혈액에서 B 세포의 LCL를 생성할 수 있습니다. 이 방법은 세포의 체외 클러스터에 감염된 말초 혈액 mononuclear 세포의 작은 금액이 시연 수 있습니다 사용합니다. FK506, 면역 반응 억제제 T 세포의 존재에 EBV와 CD23의 존재. 전통적으로, proliferating B 세포의 가지는 EBV로 감염 후 일주일에 대한 세포의 미세한 클러스터의 시각화에 의해 모니터링됩니다. LCL의 대단히 짧은 시간은 몇 주 후에 육안으로 볼 수 있습니다. 우리는 결정하기 위해 분석을 설명하는 초기 EBV - 중재 g 경우rowth 변환은 세포의 현미경 클러스터가 시연 수 있습니다 전에도 성공이다. CD23의 존재는 하이 CD58 + 세포로 초기 셋처럼 일 후 감염에게 관찰은 성공적인 결과를 나타냅니다.

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Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

우리는 엡스타인 - 바 바이러스를 사용하여 변형 B 세포 라인을 생성하는 방법을 설명합니다. 우리는 또한 감염 후 삼일 빠르면 변환을 받다 운명 B 세포를 식별할 수있는 소설 분석을 설명합니다.

엡스타인 - 바 바이러스 성장 변화 Lymphoblastoid 전지 라인 구축

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

establishment-epstein-barr-virus-growth-transformed-lymphoblastoid

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Immunology and Infection

39.8K 조회수.  State University of New York at Stony Brook. 우리는 엡스타인 - 바 바이러스를 사용하여 변형 B 세포 라인을 생성하는 방법을 설명합니다. 우리는 또한 감염 후 삼일 빠르면 변환을 받다 운명 B 세포를 식별할 수있는 소설 분석을 설명합니다.

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Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified mice, such as Atm-/- and p53-/- consistently develop thymic lymphoma early in life 1,2, and thus, can serve as a reliable source for derivation of murine T-cell lines. Here we present a detailed protocol for the development of established murine thymic lymphoma T-cell lines without the need to add interleukins as described in previous protocols 1,3. Tumors were harvested from mice aged three to six months, at the earliest indication of visible tumors based on the observation of hunched posture, labored breathing, poor grooming and wasting in a susceptible strain 1,4. We have successfully established several T-cell lines using this protocol and inbred strains ofAtm-/- [FVB/N-Atmtm1Led/J] 2 and p53-/- [129/S6-Trp53tm1Tyj/J] 5 mice. We further demonstrate that more than 90% of the established T-cell population expresses CD3, CD4 and CD8. Consistent with stably established cell lines, the T-cells generated by using the present protocol have been passaged for over a year.

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

In this video we demonstrate a protocol to establish mouse thymic lymphoma cell lines. By following this protocol, we have successfully established several T-cell lines from Atm-/- and p53-/- mice with thymic lymphoma.

에서 Thymic 림프종 T - 세포 라인의 유도 ATM - / -</sup과 p53의 - / -</sup 마우스

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

연구

면역학 및 감염병학

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

탯줄 혈액에서 세포 독성 T 림프구 확장이 대상 사이토 메갈로 바이러스, 엡스타인 - 바 바이러스, 그리고 아데노 바이러스

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that express fluorescent fusion proteins have enabled real-time visualization of transport and spread of alphaherpes virus infection of neurons. The utility of novel fluorescent fusion proteins to viral membrane, tegument, and capsids, in conjunction with live cell imaging, identified viral particle assemblies undergoing transport within axons. Similar tools have been successfully employed for analyses of cell-cell spread of viral particles to quantify the number and diversity of virions transmitted between cells. Importantly, the techniques of live cell imaging of anterograde transport and spread produce a wealth of information including particle transport velocities, distributions of particles, and temporal analyses of protein localization. Alongside classical viral genetic techniques, these methodologies have provided critical insights into important mechanistic questions. In this article we describe in detail the imaging methods that were developed to answer basic questions of alphaherpes virus transport and spread.

Live cell imaging of alphaherpes virus infections enables analysis of the dynamic events of directed transport and intercellular spread. Here, we present methodologies that utilize recombinant viral strains expressing fluorescent fusion proteins to facilitate visualization of viral assemblies during infection of primary neurons.

Alphaherpes 바이러스 선행 성 전송 및 확산의 라이브 셀 이미징

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

유전자 또는 약물 치료에 사용하기 위해 HIV-1 생산을 표적 RNA를의 효능 및 독성 평가

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new method with a powerful and simple strategy for the establishment of B-LCLs, the red blood cell lysis method. This method simplified the PBMC separation procedure with red blood cell removal, and used as little as 0.5 mL of whole blood for establishing EBV-immortalized cell lines, which can proliferate to large cell numbers in a relatively short amount time with a 100% success rate. The method is simple, reliable, time saving, and applicable to treating a large number of the clinical samples.

A simple red blood cell lysis method for establishing B-LCLs was developed with high immortalization efficiency, requiring a small amount of blood and saving time from initiation to cryopreservation.

B 임파 세포 라인의 설립에 대한 간단한 적혈구 용해 방법

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed feeder cells, purified NK or T cells with as much as 10 mL of blood, or a high-dose of IL-2. This study presents a new method with a powerful and simple strategy to establish NK and T cell lines by culturing the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with the addition of recombinant human IL-2 (rhIL-2), and uses as little as 2 mL of whole blood. The cells can proliferate quickly in two weeks and be maintained for more than 3 months. With this method, 7 NK or T cell lines have been established with a high success rate. This method is simple, reliable, and applicable to establishing cell lines from more cases of CAEBV or NK/T cell lymphoma.

A simple method for obtaining NK and T cell clones from CAEBV patients was developed with high efficiency, a small amount of peripheral blood, and a low-dose of IL-2.

NK과 만성 활성 엡 스타인-바 바이러스 감염을 가진 환자에서 T 셀 라인을 설정 하는 효율적이 고 간단한 방법

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

코딩 및 비 코딩 RNA 클래스의 식별 표시 돼지에서 전 혈

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our knowledge of prevention and treatment of viral infection. The fruit fly Drosophila melanogaster has proven to be one of the most efficient and productive model organisms to screen for antiviral factors and investigate virus-host interaction, due to powerful genetic tools and highly conserved innate immune signaling pathways. The procedure described here demonstrates a nano-injection method to establish viral infection and induce systemic antiviral responses in adult flies. The precise control of the viral injection dose in this method enables high experimental reproducibility. Protocols described in this study include the preparation of flies and the virus, the injection method, survival rate analysis, the virus load measurement, and an antiviral pathway assessment. The influence effects of viral infection by the flies' background were mentioned here. This infection method is easy to perform and quantitatively repeatable; it can be applied to screen for host/viral factors involved in virus-host interaction and to dissect the crosstalk between innate immune signaling and other biological pathways in response to viral infection.

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

This protocol describes how to establish viral infection in vivo in Drosophila melanogaster using the nano-injection method and basic techniques to analyze virus-host interaction.

바이러스 성 감염 및 초파리 Melanogaster 상호 작용 호스트-바이러스의 분석의 설립

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

광견병 백신 효능을 평가하기 위한 시험관 내 ELISA 테스트

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...