이 방법을 사용하면 P3HR1 세포주에서 Epstein Barr 바이러스 입자를 분리하고 바이러스 스톡을 정량화하여 다양한 연구 목적으로 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 EB 바이러스 주식을 제조하는 비교적 쉽고, 저렴하고, 빠르고, 신뢰할 수 있는 방법을 제공한다는 것이다. 이 기술에 의해 생성 된 중요한 입자는 15 밀리리터 원추형 튜브에서 세포 현탁액 A의 부피를 준비하고, 세포 수가 대략 220 만 세포가되도록 부피를 조정하여 100 밀리미터 배양 용기에 대해 세포 수가 대략 220 만 세포가되도록 EB.To 진단을 위해 많은 시험관 내 또는 생체 내 실험 모델에서 사용될 수 있습니다.
튜브에 5 밀리리터의 완전한 배양 배지를 첨가하십시오. 80 마이크로 리터의 디메틸 설폭 사이드를 튜브에 첨가하십시오. 그런 다음 350 마이크로 리터의 밀리리터 PMA 당 1 밀리그램을 튜브에 첨가하십시오.
PMA의 최종 농도는 밀리리터당 35나노그램이어야 하고 DMSO의 농도는 0.08%총 부피가 10밀리리터가 되도록 배양액 4.27밀리리터를 추가합니다. 튜브의 내용물을 기울여 혼합 한 다음 내용물을 100mm 배양 용기로 옮깁니다. 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 섭씨 37도, 5%이산화탄소에서 5일 동안 그대로 두십시오.
배양기에서 5일간 플레이트의 내용물을 120 G에서 8분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화하고 상층액을 포함하는 무세포 바이러스를 수집하고 세포 펠렛을 버린다. 다시 상층액을 섭씨 4도에서 90분 동안 16, 000 G에서 원심분리하여 바이러스 입자를 펠렛화한다. 상청액을 버리고 바이러스 펠렛을 5밀리리터의 배양 배지에 재현탁시키고, 바이러스 현탁액을 각각 250마이크로리터의 바이러스 현탁액을 함유하는 20개의 튜브에 분취하고, 현탁액을 섭씨 영하 80도에서 보관한다.
DNA에서 단백질을 분리하려면 바이러스 제제가 들어있는 튜브 중 하나에 500 마이크로 리터의 트리스 포화 페놀을 첨가하십시오. 100 마이크로 리터의 물과 잘 와동하여 분홍색 에멀젼을 얻습니다. 9, 650 G에서 15 분 동안 원심 분리하고 상층액을 모아 새로운 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브로 옮깁니다.
차가운 아세트산 나트륨의 상청액 부피의 1/10에 해당하는 것을 넣고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 그런 다음 밀리리터 글리코겐 당 20 밀리그램의 1 마이크로 리터를 넣고 피펫 팅으로 혼합하십시오. 상청액 부피의 3배인 차가운 100%에탄올을 넣고 섭씨 영하 80도에서 밤새 보관합니다.
바이러스 DNA를 섭씨 4도에서 15 분 동안 9, 650 G에서 원심 분리합니다. DNA 펠렛을 얻기 위해 상청액을 버리고 차가운 70 % 에탄올 1 밀리리터로 펠렛을 3 회 세척하십시오. 다시 9, 650 G에서 15분 동안 원심분리하고 상층액을 버린다.
펠렛을 약 10분 동안 공기 건조시킨 후, 펠렛을 10 내지 50 마이크로리터의 뉴클레아제 유리 증류수에 재현탁시킨다. 나중에 처리하기 위해 샘플을 섭씨 영하 20도에서 보관하거나 최대 DNA 용해를 보장하기 위해 밤새 섭씨 4도에서 보관한 다음 섭씨 영하 20도에서 보관합니다. 마이크로 분광 광도계의 받침대를 섬세한 작업으로 세척한 후 준비된 DNA 시료 1 마이크로리터를 로딩하고 시료 내의 DNA 농도를 기록한다.
260-280 나노 미터와 260-230 나노 미터 모두에서 흡광도 비율을 확인하십시오. DNA는 260 나노 미터, 단백질은 280 나노 미터, 페놀과 같은 유기 물질은 230 나노 미터에서 흡수됩니다. 1.8 대 2의 비율은 실시간 PCR에 충분한 것으로 간주됩니다.
PCR 반응 믹스를 준비하려면 5마이크로리터의 사이버 그린 실시간 PCR 믹스를 0.2밀리리터 PCR 튜브에 넣습니다. 마이크로리터 정방향 프라이머 마이크로리터당 7.5피코몰 1마이크로리터 및 역방향 프라이머 마이크로리터당 7.5피코몰 1마이크로리터를 각 튜브에 추가합니다. 여기서, EBV 소형 RNA 2 유전자가 증폭된다.
EBV 게놈 복제 수를 결정합니다. 그런 다음 2 마이크로 리터의 뉴 클레아제 자유수와 1 마이크로 리터의 바이러스 DNA를 튜브 중 하나에 첨가하십시오. 반응 혼합물의 총 부피는 10 마이크로리터이다.
알려진 EBV 게놈 복제 번호를 가진 표준으로 사용될 다른 튜브를 준비하십시오. PCR 혼합물을 섭씨 95도에서 5분 동안 활성화의 초기 단계부터 시작하여 실행합니다. 그런 다음 섭씨 95도에서 15 초 동안 40 사이클, 섭씨 58도에서 30 초 동안 사이클합니다.
모든 데이터 시트를 CSV 파일로 내보내고 표준 튜브당 EBV 게놈 사본 수 및 평균 CQ 값의 로그를 계산합니다. 게놈 카피 수의 로그에 대해 표준물질의 CT 값을 플로팅하여 qPCR 표준 곡선을 생성합니다. 표준 곡선 플롯 방정식을 사용하여, 유도된 바이러스 DNA를 포함하는 PCR 튜브 내의 EBV 게놈 카피의 수를 도출한다.
마지막으로 화면에 표시된 공식을 사용하여 유도 바이러스 제제의 농도를 계산합니다. 여기서 X는 표준 곡선에서 파생된 EBV 게놈 사본의 수이고 F는 PCR 반응당 DNA를 설정하는 데 사용되는 희석 계수입니다. 혈구계 챔버를 사용한 세포 계수가 여기에 표시됩니다.
4 개의 사분면은 광학 현미경을 사용하여 계산됩니다. 여기서 파란색으로 표시된 셀은 계산해야하며 빨간색 셀은 사분면의 상단, 오른쪽, 하단 또는 왼쪽 테두리에 닿기 때문에 계산해서는 안됩니다. 가장 많은 수의 EBV 입자를 생성하는 PMA 및 디메틸 설폭사이드의 농도를 결정하기 위해 최적화 시험이 수행되었습니다.
0.8%의 DMSO 농도와 마이크로리터당 35나노그램의 PMA 농도가 최적이었고 높은 EBV 농도를 초래했습니다. 우리 연구실은이 기술에 의해 생성 된 중요한 입자를 사용하여이 바이러스에 대한자가 면역 또는 염증 반응을 조사했습니다. 뿐만 아니라 새로운 항 EBV 제제를 개발합니다.
