이 방법은 IM 환자의 동일한 질병 상태에서 다른 면역 세포의 특성을 분석할 수 있게 하여 EBV 감염 메커니즘에 대한 이해를 넓힐 것입니다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 의사 인 Linlin Zhang이 될 것입니다. 시작하려면 1.5밀리리터 미세 원심분리 튜브에서 이전에 분리된 PBMC를 취하고 실온에서 300분 동안 10G에서 회전시킵니다.
상청액을 버리고, 제조된 완충액 80 마이크로리터로 세포를 재현탁시킨다. 다음으로, 20 마이크로리터의 CD 14 마이크로비드를 세포 현탁액에 첨가하고, 피펫팅에 의해 잘 혼합하고, 튜브를 얼음 상에서 15분 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 1 밀리리터의 완충액을 사용하여 PBMC를 세척하고 실온에서 10 분 동안 300G에서 원심 분리합니다.
전체 상청액을 버리고, 세포를 500 마이크로리터의 완충액으로 재현탁시킨다. 자기 분리의 경우 마그네틱 비드 분리기에 컬럼을 놓고 3밀리리터의 버퍼로 세척하여 컬럼을 프라이밍합니다. 다음으로, 세포 현탁액을 컬럼에 추가합니다.
통과시키고 표지되지 않은 세포를 15 밀리리터 원심 분리 튜브에 모으십시오. 3 밀리리터의 완충액으로 컬럼을 3 번 세척하고 15 밀리리터 원심 분리 튜브에 전체 유출 물을 수집합니다. 이제 컬럼을 새 15밀리리터 원심분리 튜브에 넣고 컬럼에 5밀리리터의 버퍼를 추가합니다.
플런저를 컬럼에 단단히 밀어 넣어 자기적으로 표지된 셀을 튜브로 플러시합니다. 자기적으로 표지된 셀을 300G에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거한 후, 세포를 500 마이크로리터의 PBS에 재현탁시키고, 후속 전사체 시퀀싱을 위해 세포 현탁액을 1.5 밀리리터 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다.
수집된 표지되지 않은 세포를 300 G에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛하고, 세포를 1.5 밀리리터 마이크로원심분리 튜브에 100 마이크로리터의 PBS에 재현탁시킨다. 이어서, 2 마이크로리터의 각각의 표지된 항체를 세포 현탁액에 첨가하고, 빛으로부터 보호하면서 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션한다. 다음에, PBMC 세포 현탁액을 1.5 밀리리터 마이크로원심분리 튜브에 분취하여 음성 대조군 샘플 CD3, CD4, CD8, 및 CD19, 단일 염색 샘플, 및 CD 56, 또는 CD16 염색 샘플을 설정하였다.
그런 다음 각 튜브에 상응하는 형광 표지 항체 2 마이크로 리터를 추가하고 빛으로부터 보호하면서 얼음 위에서 30 분 동안 배양합니다. 배양 후, 이전에 입증된 바와 같이 PBS로 모든 세포를 세척하고, 500 마이크로리터의 PBS에 재현탁시킨다. 셀 분류 시스템을 열고 전원 켜기 프로그램을 실행합니다.
그런 다음 85마이크로미터 노즐을 설치하고 분류 스트림을 엽니다. 정렬 전압을 4, 500V로 설정하고 주파수를 47로 설정합니다. 브레이크 오프 창에서 간격을 8로 설정하고 스위트 스폿 자동 정렬 모드를 켜서 액적 진폭 값을 자동으로 결정합니다.
마지막으로 사이드 스트림 창에서 액적 지연을 30.31로 조정합니다. 순방향 대 측면 산점도를 사용하여 다각형 게이트 P1을 그려 온전한 림프구 집단을 식별합니다. 다음으로, 전방 산점도 영역 대 높이 점도를 사용하여 다각형 게이트 P2를 그려 단일 셀을 식별하고 이중선을 제외합니다.
그런 다음 CPCY 5.5 영역 도트 플롯 당 CD 19 FITC 영역 대 CD 3을 사용하여 직사각형 게이트 P3을 그려 CD 3 양성 T 세포 및 CD 19 양성 B 세포를 선택합니다. 다음으로, CD 4 APCCY 7 영역 대 CD 8 PE 영역 점도표를 사용하여 직사각형 게이트를 그려 CD 4 및 CD 8 양성 T 셀을 선택합니다. 마지막으로, 측면 산란 영역 대 CD 56 또는 CD 16 APC 영역 점도를 사용하여 직사각형 게이트를 그려 CD 56 또는 CD 16 양성 자연 살해 세포를 선택합니다.
음성 컨트롤 튜브의 경우 획득 대시보드에서 로드를 클릭하고 소프트웨어에서 세포분석기 설정을 선택합니다. 인스펙터 창에서 파라미터 탭을 클릭하고 순방향 산란, 측면 산란 및 다양한 형광 염료의 전압을 조정합니다. 단일 염색 튜브를 세포분석기에 로드한 후 획득 대시보드에서 로드를 클릭한 다음 보정 탭을 클릭하여 텍스트에 설명된 대로 보정을 조정합니다.
튜브를 세포 분석기에 넣기 전에 세포 현탁액을 부드럽게 소용돌이하십시오. 4개의 수집 흐름 튜브에 200마이크로리터의 FBS를 추가하고 튜브를 소용돌이합니다. 세포 분석기 수집 챔버에 넣으십시오.
4개의 플로우 튜브에서 다양한 유형의 셀을 개별적으로 수집합니다. 분리된 세포를 300G에서 5분 동안 스핀다운하고 전사체 시퀀싱을 위해 200마이크로리터의 RNA 분리 시약을 세포 팔레트에 추가합니다. 본 연구에서, 상이한 샘플의 말초 혈액으로부터의 면역 세포 서브 집단은 면역 자기 비드 및 형광 활성화 세포 분류의 기술을 결합하여 효율적으로 분류되었다.
중요하게도 이 프로토콜에서 세포 분류 단계는 세포 생존율을 개선하도록 최적화되었습니다. 분류 된 면역 세포는 건강한 Epstein-Barr 바이러스 운반체 및 감염되지 않은 샘플 모두에 비해 감염성 단핵구증 환자에서 CD 3, CD 8 양성 T 세포의 비율이 증가한 것으로 나타났습니다. 대조적으로, 건강한 EBV 보균자 및 EBV에 감염되지 않은 소아에 비해 감염성 단핵구증 환자에서 CD 3, CD 4 양성 T 세포 및 CD 19 양성 B 세포의 비율 감소가 관찰되었습니다.
또한, 감염성 단핵구증 환자에서 감염되지 않은 EBV 소아에 비해 CD 56 또는 CD 16 양성 자연 살해 세포의 비율이 감소하는 것이 관찰되었습니다. 세포 생존력을 유지하는 것은 후속 실험에 필수적입니다. 분류 과정에서 세포를 얼음이나 냉장고에 보관하면 세포 생존에 도움이됩니다.
