이 작품은 의학 NHMRC 프로그램 권한 부여 # 568969 (PSS) 및 학부, 뉴 사우스 웨일스 대학, 줄기 세포 사업 (KSS)에 의해 지원됩니다.

아래 절차의 모든 클래스 II Biosafety 내각 안에서 무균 기술을 사용하여 수행됩니다. 사용하는 시약과 장비는 아래 테이블에 나열되어 있습니다. 1. 1.1 %의 알긴산의 준비 (W / V) <ol><li> 나트륨 알지네이트요 투석의 0.275 g을 추가 (높은 글루쿠론산 함량 ≥ 60 %, 점도&gt; 200 MPA의 및 내독소 ≤ 100 유럽 연합 (EU) / G) 무균 50 ML 관과 (0.5g 이전 대비 25 ML 멸균 0.1 % 젤라틴 용액을 추가 gelatin/500 ML 밀리 Q H 2 O 및 autoclaving에 의해 해산). </li><li> 부분적으로 알지네이트요 가루를 해산하기 위해 약 30 초간 소용돌이 튜브 그러면 하룻밤 사이에 10 XG에 궤도 믹서에 튜브를 삽입 (실온). </li><li> 알지네이트요 솔루션의 25 ML에 9% 멸균 NaCl (NaCl/50 ML 밀리 Q H 2 O 4.5 g)의 2.778 ML을 추가합니다. 5 분 95 XG의 원심 분리에 의해 다음에 약 30 초간 소용돌이 튜브를. </li><li> 4에서 알지네이트요 솔루션을 저장 °; 단기 저장 (1-2개월) 또는 -20 ° C에서 장기 보관 (년 정도)에 대한 C #. </li></ol> 2. CaCl 2 강수 목욕의 작성 <ol><li> 밀리 Q H 2 O로 1 리터에 CaCl 2 14.7 g. 2 시간 2 O와 HEPES의 2.38 g을 용해 </li><li> 7.4로 산도 수준을 조정합니다. </li><li> 0.22 μm의 필터를 사용하여 솔루션을 소독. </li><li> 강수량 목욕은 실온 (6-12 개월)에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 3. 솔루션 Decapsulating의 작성 <ol><li> Dulbecco의 인산 500 ML에 염분 (D-PBS)를 버퍼, 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 50 ML 및 1M HEPES 5 ML에 추가합니다. </li><li> 20 분 동안 121에서 0.22 μm의 필터 또는 압력솥 ° C를 사용하여 소독. </li><li> 실온 (6-12 개월)에 decapsulating 솔루션을 저장합니다. </li></ol> 4. 세럼 교체 (SR) 중간의 작성 <ol><li> 이전 캡슐에, 드로 사전에 SR 매체를 준비특정 시약 및 장비의 테이블에 scribed. </li></ol> 5. 바위 억제제의 준비 (Y-27632) <ol><li> 인간 D-PBS의 (HSA) 알부민 혈청 5 MM 솔루션을 만드는 0.1 %에서 Y-27632 분말을 희석. </li></ol> 6. 봉지를위한 hESC의 작성 <ol><li> 37 ° C (빛으로부터 보호)에서 두 시간 동안 바위 억제제 (RI)의 10 μm의로 보충 culturing 미디어와 세포를 사전 처리합니다. </li><li> RI 치료 후 37 ° C. 10 분 accutase와 효소 회 D-PBS로 세포를 씻어 문화 판에서 세포를 이동시키다 </li><li> 부드럽게 피펫 또는 셀 스크레이퍼로 세포를 데리고 15 ML 튜브에 수집합니다. 1시 1분 비율로 SR 매체와 accutase를 무력화. </li><li> 단일 세포 현탁액을 준비하려면 40 μm의 필터를 사용하여 무력화 세포를 필터링하고 신선한 50 ML의 원심 튜브에 수집합니다. </li><li> hemacytometer를 사용하여 솔루션의 세포의 총 수를 계산합니다. </리&gt; <li> 세포 현탁액에게 5 분 95 XG을 원심 조심스럽게 나중에 뜨는 버리고. 사전 예열 0.9 % NaCl로 세포를 씻으십시오. 5 분 95 XG를 원심 분리기와 뜨는 버리고. </li></ol> 7. 세포의 캡슐화 <ol><li> 14G X 2 &quot;IV 카테터의 부드러운 플라스틱 튜브에 부착된 1 ML의 주사기를 준비합니다. 이것은 그림 1에서와 같이 주사기 펌프에로드되도록 세포 현탁액을 대기음하는 데 사용됩니다. </li><li> 1,250,000 세포 / ML의 알지네이트요의 밀도에 미리 예열 알지네이트요 솔루션 세포 Resuspend. 천천히 주사기에 혼합하고 거품을 생성하지 마십시오. </li><li> 그림 1에서와 같이 비드 발생기, 주사기 펌프 및 공기 유량계를 설정합니다. 이러한 장치의 자세한 내용은 특정 시약 및 장비의 테이블에 나열되어 있습니다. </li><li> 주사기로 aspirated 세포로 정맥 주사 카테터의 플라스틱 튜브를 버리고 캡슐 머신에 주사기를 첨부합니다. 10cm 간격이있다는 것을 확인<html> 십대 초반은 캡슐 머신의 끝과 수거 지점 그림 1과 같이. </li><li> 20 ML / HR, 공기 흐름 8 L / 분의 속도 및 100 kPa (캡슐의 크기는 공기 유량을 변경하여 변경할 수있다)의 압력에서 주사기 펌프를 설정하여 세포를 캡슐. </li><li> 캡슐을 안정화하기위한 7 분을위한 사전 예열 강수량 목욕 20 ML 가득 배양 접시 (100 X 15mm)로 캡슐화된 세포를 수집합니다. </li><li> 0.9 % NaCl의 20 ML 가득한 50 ML의 원심 튜브에 부드러운 흡인에 의해 캡슐화된 세포를 전송합니다. </li><li> 캡슐은 튜브의 바닥에 정착하도록 허용하는 것은 부드럽게 뜨는 버리고. 0.9 % NaCl로 세척 과정을 반복합니다. </li><li> 문화 플라스크에 RI (10 μm의), 이체로 보완하고 37 ° C / 5% CO 2에서 incubated 사전 예열 culturing 매체에 캡슐화된 세포를 Resuspend. </li></ol> 8. DA 뉴런에 캡슐화된 hESC의 분화 ve_content &quot;&gt; 캡슐 hESC는 분화 이전 3 일간 RI으로 처리됩니다. <ol><li> 종자 마우스 stromal 세포주의 1.0 × 10 4cm 2 회 0.1 %의 젤라틴 코팅 T75 술병과 조건 24 시간 분화하기 전에 검찰 신경 분화 매체 (자료 표)에 PA6 세포. 밀도에서 PA6 세포 </li><li> 50 ML의 원심 튜브에 캡슐을 전송하고 그들이 튜브의 바닥에 정착하실 수 있습니다. </li><li> 뜨는을 취소하고 PA6 세포 바른 DA 신경 분화 매체에 캡슐을 resuspend. </li><li> 문화 일 4 미디어 변화와 매일 함께 28일 대한 PA6 세포 단일층 (7.5 × 10 5 PA6 세포 당 9 X 10 6 hESCs)와 캡슐 hESC는 그 이후 (매체마다의 절반 밖에 변경). </li><li> PA6 세포와 문화 3 주가 지난 후, 100 NG / ML 쉬이잇 나머지 주 100 NG / ML FGF8a 함께 검찰 신경 분화 미디어를 보완. </리&gt; </ol> 9. 캡슐화된 hESC의 Decapsulation <ol><li> 15 ML의 원심 튜브에 캡슐을 대기음들을 튜브 하단에 정착하실 수 있습니다. 그렇다면 신중하게 뜨는 버리고. </li><li> 두번 D-PBS로 캡슐 씻으십시오. 다음 뜨는을 제거 캡슐은 튜브의 아래쪽에 정착하자. </li><li> 캡슐 5 ML decapsulating 솔루션을 추가합니다. 4-5 분 상온에서 사전에 인큐베이션에 대한 열망을 통해 철저하게 정지를 섞습니다. </li><li> 3 분 95 XG에 decapsulated 세포를 원심 분리기와 뜨는 버리고. </li><li> 3 분 95 XG에서 원심 분리에 의해 다음에 D-PBS로 세포 펠렛 씻으십시오. 반복합니다. </li><li> decapsulated 세포가 더 단일층으로서 교양이나 스트림 분석에 사용 될 수 있습니다. </li></ol> 10. 대표 결과 알지네이트요의 microcapsules의 직경 400-500 μm의입니다. 캡슐 내에서 세포의 수가 estimat였다실행 당 캡슐 총 나눈 세포의 총 수를 계산하여 에드. 따라서 캡슐 당 약 5.0 X 10 4 세포 추정되었다. 이것에서 우리는 캡슐에 포함할 수있는 세포의 최대 개수는 약 1.0 × 10 5 것을주지. 캡슐 hESC의 생존 능력은 carboxyfluorescein의 디아 세 테이트 succinimidly 에스테르 (CFDA) / propidium의 요오드화물 (PI) 분석을 사용하여 결정&gt; 80 % (그림 2)과 같다. 우리는 1.1 %까지 2.2 %에서 알지네이트요 농도를 줄임으로써 및 바륨 염화에서 염화칼슘으로 강수량 목욕을 변경하여 hESC의 캡슐의 조건을 최적화했습니다. 이러한 조건에서 우리는 1.1 %의 칼슘 알지네이트요로 캡슐되었습니다에만 세포가 살아남을 수 있다고 보여주었다, 분아 따위에 의해 중식 및 체외 1 EBS를 형성하고 있습니다. 추가 조건을 최적화하려면 culturing 미디어 및 RI의 효과는 Y-27632는 조사되었다. 그림 2와 3에 표시된대로 데이터는 RI의 prevente을 증명D 분리 - 유도 apoptosis와 세포 생존 및 홍보 클러스터 형성 1,6을 유지. 또한, hFF-CM + RI에서 배양해 캡슐 hESC의 생존 능력은 RI의 보완없이 다른 그룹보다 훨씬 높은이었다 있으나 이것은 SR + RI에서 배양해 캡슐 hESC에 크게 다르지 않아했습니다. 마찬가지로, BrdU 분석을 사용하여 세포 증식은 클러스터 (그림 3)로 발전 단일 셀은 25 %에서 75 % 증가했다. TUNEL에 의한 Apoptosis 분석은 hFF-CM에서 검색할 클러스터 TUNEL에 대해 대부분 부정했다 반면 SR 매체에서 배양해 microcapsules에서 단일 세포 (데이터가 표시되지 않음) apoptotic라고 밝혔다. 어느 정도, bFGF와 보충 hFF-CM은 또한 Y-27632의 부재에서 생존과 캡슐 hESCs의 확산을 촉진. 그러나 Y-27632과 치료를 캡슐화하기 전에 (2 시간)과 이후 (추가 4 일간) 띄게 향상된 생존, 증식 및 캡슐의 hESC의 클러스터 형성1.1 %의 칼슘 알지네이트요의 microcapsules 인치 이전에 우리는 캡슐 hESC이 성공적으로 확정 endoderm 1로 차별 수있다 보여주었다. 여기서는 검찰 뉴런으로 캡슐 hESC를 차별화하기 위해 3D 플랫폼으로 세포 캡슐의 응용 프로그램을 조사했다. 캡슐에 embryoid 기관 (EB)를 형성 hESC는 차별화된 직접 있었는데 설명한 조건 하에서 decapsulation에 90 % 이상의 생존 능력과 문화로부터 2-3 일 후에 (그림 4) 프로 그레시브의 연결 형태를 보여주었다. neuroprogenitor 표시, PAX6과 검사의 연결 마커, TH는 차별화 7 일 (그림 5A) 이후 최대 - 규제 동안 유전자 발현 분석 pluripotent 표식의 아래쪽 규정, OCT4을 보여주었다. Immunofluorescent 염색법은 차별 hESC 하루 7 시에 PAX6 양성 (&gt; 80 %)하지만 OCT4 음수가 있다고 밝혔다. 또한 차별화된 hESC 21 일 후에 TH - 양성 (&gt; 90 %) 뉴런을 (그림 5B) 보여주었다. 서양 얼룩 분석도 보여주었다PAX6 표현 동안 일 14 일부터 번째 표현의 상향 조절 (그림 5C)는 21 일 이후에 아래쪽 규제. 비교에서는 전지 (사전 차별화에 대한 예 : RI 3 일간 2 시간 RI 사후 처리를위한 사전 치료) (&gt; 80 PAX6-긍정 세포의 높은 비율을 유지 유사한 조건 하에서 (2D) 2 차원 환경에서 배양해 %) 분화 기간에 걸쳐 및 캡슐화 (그림 5A 및 C)에서 제공하는 3D 환경에서와 같이 TH 양성 세포 (&lt;60 %)으로 차별화에서와 같이 효율이 아니었다.

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우리는 공개 할게 없다.

마우스 배아의 줄기 세포와 hESC를 사용하여 여러 연구 biomaterials 및 조직 공학 2,3에서 3D 문화 시스템의 이점을 증명하고있다. 우리는 바륨 알지네이트요보다 칼슘 알지네이트요에서 캡슐 때 hESC는 상당한 높은 생존 능력을 보여주 이후 바륨 알지네이트요에 비해 hESC 전파와 차별을 공부하기 적합한 3D 플랫폼으로 칼슘 알지네이트요의 microcapsules를 사용했습니다. 이 문화 시스템은 또한 고?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 노트 </td></tr><tr><td> 알긴산 (MVG UP Pronova) </td><td> NovoMatrix </td><td> 4,200,101 </td><td> 높은 글루쿠론산 함량 ≥ 60 %, 점도&gt; 200 MPA의 및 내독소 &lt;100 EU / G </td></tr><tr><td> 젤라틴 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G1890-100G </td><td></td></tr><tr><td> 0.9 % NaCl </td><td> 박스터 헬스케어 </td><td> AHF7123 </td><td></td></tr><tr><td> 타입 J1 비드 발생기 </td><td> Nisco 엔지니어링 INC </td><td> SPA-0447 </td><td></td></tr><tr><td> 멀티 페이저 주사기 펌프 </td><td> 새로운 시대 펌프 시스템 INC </td><td> 모델 NE-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Ezi-흐름 의료 유량계 </td><td> 개스콘 시스템</td><td> G0149 </td><td></td></tr><tr><td> Y-27632 </td><td> 머크 </td><td> 688,000 </td><td></td></tr><tr><td> 알부민 혈청 인간 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A4327-1G </td><td></td></tr><tr><td> Accutase </td><td> Millipore </td><td> SCR005 </td><td></td></tr><tr><td> 14G X 2 &quot;IV 카테터 </td><td> Terumo </td><td> SR-OX1451C </td><td></td></tr><tr><td> 마네 - DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 10829-018 </td><td> SR 매체 (기저)의 경우 </td></tr><tr><td> GlutaMAX-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> SR 매체 (2 ㎜)에 대한 </td></tr><tr><td> 마네 세럼 교체 </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> SR 매체 (20 %)에 대한 </td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td><td> SR 매체 (2.5 U / ml) 쇼핑을 위해 </td&gt; </tr><tr><td> 인슐린 - 트랜스페린 - 셀레늄 (ITS) </td><td> Invitrogen </td><td> 41400045 </td><td> SR 매체 (1X)의 경우 </td></tr><tr><td> β-메르 캅 토 에탄올 </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td> SR 매체 (0.1 ㎜)에 대한 </td></tr><tr><td> MEM NEAA 솔루션 </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> SR 매체 (5 ㎜)에 대한 </td></tr><tr><td> 글래스고 최소 필수 매체 </td><td> Invitrogen </td><td> 11710035 </td><td> DA 신경 분화 매체 (기저)의 경우 </td></tr><tr><td> 마네 세럼 교체 </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> DA 신경 분화 매체 (10 %)에 대한 </td></tr><tr><td> 나트륨 pyruvate </td><td> Invitrogen </td><td> 11360070 </td><td> DA 신경 분화 매체 (1 ㎜)의 경우 </td></tr><tr><td> MEM NEAA 솔루션 </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> DA N의 경우eural 차별 매체 (0.1 ㎜) </td></tr><tr><td> β-메르 캅 토 에탄올 </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td> DA 신경 분화 매체 (0.1 ㎜)에 대한 </td></tr><tr><td> 소닉 고슴도치 (쉬이잇) </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 1314-SH-025/CF </td><td> DA 신경 분화 (100 NG / ML)의 경우 </td></tr><tr><td> Fibroblast 성장 인자 8A (FGF8a) </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 4745-F8-050 </td><td> DA 신경 분화 (100 NG / ML)의 경우 </td></tr></tbody></table>

alginate microcapsule as a 3d platform for propagation and differentiation of human embryonic stem cells (hesc) to different lineages

그들이 무기한 문화 확대와 신체의 모든 세포 유형으로 구분되기 수 있기 때문에 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 세포 대체 요법에 대한 매력적인 대안 원본으로 떠오르고있다. biomaterials 다양한 형태의도 줄기 세포 틈새는 1-3 흉내낸 microenvironment를 제공하기 위해 줄기 세포 배양에 사용되었습니다. 후자는 캡슐과 같은 3 차원 (3D) 환경 4 제공하여 특정 lineages뿐만 아니라 조직의 조직으로 휴대 전화 상호 작용, 세포 증식 및 분화를 촉진하는 것이 중요합니다. 세포 캡슐의 원리는 3D 문화 2 반 투과 세포막의 굴레 안에서 살아있는 세포의 함정 수사가 포함됩니다. 항체와 캡슐 기공 크기보다 큰 호스트에서 면역 세포가 5를 제외하고 반면 이러한 세포막은 영양소, 산소와 세포막에 걸쳐 자극의 교환하실 수 있습니다. 여기서는 사전문화적인 접근을 유도하고 알지네이트요의 microcapsules을 사용하여 3D microenvironment에 hESC 검찰의 뉴런을 차별화. 우리는 캡슐 hESC의 생존을 향상시키기 위해 문화 조건 2를 수정했습니다. 우리는 이전에 보여준 그 크게 향상 3D 플랫폼 p160-Rho-연결된 코일 - 코일 키나제 (바위) 억제제, Y-27632과 인간 태아의 fibroblast 바른 혈청 대체 매체 (hFF-CM)의 추가 캡슐 hESC의 생존 있는 세포가 최종 endoderm의 마커 유전자에게 1 표명했다. 우리는 지금 검찰의 뉴런으로 hESC하고 효율적인 분화의 번식이 3D 플랫폼을 사용 해왔다. 단백질과 유전자 표현 분석은 검찰의 연결을 분화의 마지막 단계 후 티로신 hydroxylase의 증가 표현 (TH), DA 뉴런을위한 마커, 2 주 후에&gt; 100 폴드을 보여주었다. 우리는 알지네이트요의 microcapsules을 사용하여 Google 3D 플랫폼 확산을 공부 유용할 수있는 가상과 차별 감독각종 lineages에 hESC니다. 이 3D 시스템은 분화의 과정 중에 hESC에서 피더 세포의 분리를 허용하며 향후 이식시 면역 - 절연을위한 잠재력을 가지고 있습니다.

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Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

우리는 endoderm 및 dopaminergic (DA) 뉴런에 전파하고 배아 줄기 세포의 분화에 대한 효과적인 3D 플랫폼으로 microencapsulation 기술을 최적화했습니다. 또한 이식하는 동안 호스트에서 세포의 면역 - 절연을위한 기회를 제공합니다. 이 플랫폼은 다른 세포 유형에 적응하실 수 있습니다.

다른 Lineages로 인간 배아 줄기 세포 (hESC)의 전파 및 차별 화를위한 3D 플랫폼으로서 알긴산의 Microcapsule

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

16.2K 조회수.  The University of New South Wales. 우리는 endoderm 및 dopaminergic (DA) 뉴런에 전파하고 배아 줄기 세포의 분화에 대한 효과적인 3D 플랫폼으로 microencapsulation 기술을 최적화했습니다. 또한 이식하는 동안 호스트에서 세포의 면역 - 절연을위한 기회를 제공합니다. 이 플랫폼은 다른 세포 유형에 적응하실 수 있습니다.

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Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

인간 세포 배양을위한 회전 세포 배양 시스템 : 모델로 인간 Trophoblast 셀

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

연구

생체공학

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

개발, 확대,<em&gt; 생체 내</em&gt; 인간 배아 줄기 세포 (hESCs에)에서 인간 NK 세포의 모니터링 및 및 유도 된 pluripotent 줄기 세포 (유도 만능)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

강력한, 미세 유체 세포 내 전달 플랫폼으로 휴대 뒤쪽에서

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

단일 세포 및 3D 감금 단일 배아 주문 : 하이 콘텐츠 스크리닝을위한 새로운 장치

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

계층화 된 알긴산를 구축 : 이기종 세포 인구의 공동 문화를위한 플랫폼

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

미세화 및 3D 미세 혈관의 조립

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, unlike more differentiated progenitors, and enter the cell cycle rapidly after chemotherapy or irradiation to treat bone marrow injury or in vitro culture. By mimicking the bone marrow microenvironment in the presence of abundant fatty acids, cholesterol, low concentration of cytokines, and hypoxia, human HSCs maintain quiescence in vitro. Here, a detailed protocol for maintaining functional HSCs in the quiescent state in vitro is described. This method will enable studies of the behavior of human HSCs under physiological conditions.

This protocol enables the maintenance of quiescent human hematopoietic stem cells in vitro by mimicking the bone marrow microenvironment using abundant fatty acids, cholesterol, lower concentrations of cytokines, and hypoxia.

정지 인간 조혈 줄기 세포를 유지하는 배양 방법

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles has emerged as an effective method to transiently and locally increase the permeability of the BBB, facilitating para- and transcellular transport of drugs across the BBB. Imaging the vasculature during ultrasound-microbubble treatment will provide valuable and novel insights on the mechanisms and dynamics of ultrasound-microbubble treatments in the brain.
Here, we present an experimental procedure for intravital multiphoton microscopy using a cranial window aligned with a ring transducer and a 20x objective lens. This set-up enables high spatial and temporal resolution imaging of the brain during ultrasound-microbubble treatments. Optical access to the brain is obtained via an open-skull cranial window. Briefly, a 3-4 mm diameter piece of the skull is removed, and the exposed area of the brain is sealed with a glass coverslip. A 0.82 MHz ring transducer, which is attached to a second glass coverslip, is mounted on top. Agarose (1% w/v) is used between the coverslip of the transducer and the coverslip covering the cranial window to prevent air bubbles, which impede ultrasound propagation. When sterile surgery procedures and anti-inflammatory measures are taken, ultrasound-microbubble treatments and imaging sessions can be performed repeatedly over several weeks. Fluorescent dextran conjugates are injected intravenously to visualize the vasculature and quantify ultrasound-microbubble induced effects (e.g., leakage kinetics, vascular changes). This paper describes the cranial window placement, ring transducer placement, imaging procedure, common troubleshooting steps, as well as advantages and limitations of the method.

This protocol describes the surgical and technical procedures that enable real-time in vivo multiphoton fluorescence imaging of the rodent brain during focused ultrasound and microbubble treatments to increase blood-brain barrier permeability.

혈액-뇌 장벽 투과성을 높이기 위해 집중된 초음파 및 마이크로 버블 치료를 시각화하는 실시간 인트라바이탈 다광원 현미경 검사법

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. These include the limited number of cadaveric pancreas donors and the long-term use of immunosuppressants. Mesenchymal stem cells (MSCs) have been considered to be a potential candidate as an alternative source of islet-like cell generation. Our previous reports have successfully illustrated the establishment of induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) to insulin-producing cells (IPCs). However, the induction efficiency varied greatly. In this paper, we demonstrate the comparison of hDPSCs pancreatic induction efficiency via integrative (microenvironmental and genetic manipulation) and non-integrative (microenvironmental manipulation) induction protocols for delivering hDPSC-derived IPCs (hDPSC-IPCs). The results suggest distinct induction efficiency for both the induction approaches in terms of 3-dimensional colony structure, yield, pancreatic mRNA markers, and functional property upon multi-dosage glucose challenge. These findings will support the future establishment of a clinically applicable IPCs and pancreatic lineage production platform.

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

This protocol presents a comparison between two different induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) toward pancreatic lineages in vitro: the integrative protocol and the non-integrative protocol. The integrative protocol generates more insulin producing cells (IPCs).

시험관 내 췌장 혈통을 향한 인간 치과 펄프 줄기 세포의 유도

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...