이 연구는 국립 신경 장애 연구소 및 행정, 건강의 국립 연구소 (VVD)로부터 신경 장애 및 뇌졸중, 국민 ARRA를 통해 보건 연구소 (VVD)과 R21의 국립 연구소에서 R21 NS064403 부여하여 부여 R01NS062842에 의해 지원되었다 바이오 메디컬 이미징 및 생물의 EB006301 국립 연구소, 건강 (VVD)의 국립 연구소.

자신의 준비는 분자 장치의 조립보다 더 많은 시간을 소요하기 때문에 분자 기계 기반의 탐지에 대한 부분 먼저 준비되어야합니다. 구조는 paraformaldehyde - 고정, 파라핀 - 임베디드 조직 블록에서 컷 5 6μm 두께 부분과 잘 작동합니다. 이러한 ProbeOn 플러스 충전 및 precleaned 슬라이드 (피셔 과학) 또는 유사한뿐만 아니라 섹션을 유지 슬라이드 브랜드를 사용합니다. 우리는 최초의 dexamethasone - apoptotic 취급 쥐 thymus 13,14으로 DNase I -와 DNase II 타입 휴식을 모두 포함하고 DNA 손상의 잘 알려진 패턴을 가진 조직을 이용하여하는 것이 좋습니다. 1. 섹션의 준비 <ol><li> 15 분 크실렌의 슬라이드 랙 및 dewax의 섹션을 장소, 추가 5 분 신선한 크실렌 욕조에 전송할 수 있습니다. </li><li> 등급 에탄올 농도 통과하여 Rehydrate : 96% 에탄올 2x5min, 80 % 에탄올 - 5 분​​, 물 - 2x5 분. </li><li> Proteinas과 다이제스트 섹션전자 K. 섹션 당 50μg/mL 솔루션의 100μL를 사용하십시오. humidified 챔버의 실내 온도 (23 ° C)에서 품어 15. 시간은 조직 유형에 따라 조정해야 할 수도 있습니다. 하드 조직은 더 이상 소화가 필요 할 수도 있습니다. 15-25 분 시간은 일반적으로 사용됩니다. 부족 소화가 약한 신호가 발생할 수 있습니다. 신호 실종 및 섹션 파괴에 반대 결과에 Overdigestion. </li><li> 2x10 분 증류수로 씻어. </li><li> preblocking에 대한 2 % BSA 100 μL 당 섹션을 적용합니다. 상온에서 15 분 (23 ° C)를 품어. 이 시간 동안 분자 기계를 조립. </li></ol> 2. 분자 기계 조립 모든 시약은 평균 크기의 조직과 (10x10mm)에서 하나의 검출에 충분한 25 μL 총 볼륨에 대한 결정됩니다. 필요에 따라 볼륨이 최대 크기를 조정하실 수 있습니다. <ol><li> 이 순서에서 작은 플라스틱 튜브의 통합 : </li></ol><table border="1"><tbody> &lt;TR&gt; <td><ol><li> Bidistilled 물; </li><li> 15 % 폴리에틸렌 글리콜 - 8000; </li><li> 66 솔루션 MM - 트리스 HCL, pH를 7.5, 5 밀리미터 MgCl 2, 0.1 MM dithioerythritol, 1 ㎜ ATP (즉, 정기적으로 T4 DNA ligase의 버퍼); </li><li> Oligonucleotide 일 70 pmoles, </li><li> 215 pmoles (1.76-7.1 μg) VACC TOPO </li><li> 10 대 T4 DNA ligase (500 U / ML) </li></ol></td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> pipetting으로 조심스럽게 섞는다. 분자는이 솔루션에서 즉시 자기 조립 구조 실내 온도 (23 ° C)에서 즉시 사용할 수 있습니다. 37 온도를 증가 ° C 블록 라벨의 T4 DNA ligase 기반 구성 요소입니다. </li></ol> 3. 이중 레이블 5&#39;OH 및 5&#39;PO4 DNA의 휴식 시간에 조직 섹션에서 분자 기계를 사용하여 <ol><li> preblocking 솔루션을 기음과 Oligonucleotide 일 70 pmoles, 53 포함 전체 반응 믹스의 25μL 적용 - 215 pmoles (1.76-7.1 μg) VACC를66 MM - 트리스 HCL, 산도 7.5, 5mM MgCl 2, 0.1 MM dithioerythritol, 1 ㎜ ATP, 그리고 15 % 폴리에틸렌 글리콜 - 8000의 솔루션 TOPO 10 대 T4 DNA ligase (500 U / ML). 단일 FITC 라벨 Oligonucleotide 2 나르는 동일한 시퀀스 oligonucleotide는 DNA 나누기의 단일 유형의 탐지를 위해 대신 사용할 수 있습니다. 이러한 경우에는 상표 반응에서 ligase를 생략하면됩니다. 또한 이런 상황에서 50mM 트리스 - HCL, 산도 7.4의 솔루션 15 % PEG - 8000는 T4 DNA ligase의 버퍼 대신 사용할 수 있습니다. </li><li> 플라스틱 coverslip와 humidified 챔버의 실내 온도 (23 ° C)에서 1 시간을위한 품어. 빛과 보호합니다. 16의 온도를 낮추는 ° C의 ligase 기반의 신호를 감소, 37의 온도 증가 ° C 완전히 ligase 기반의 신호를 제거합니다. ligase의 부분 억제 때로는 topoisomerase의 준비를 도입 오염 물질로 인해 가능, 반응 혼합물에 발생합니다. 따라서, 더 이상 부화 (2~4시간)이 필요 수도 있습니다 특히의ligase - 라벨 쉬는 ignificant 번호는 존재한다. ligase 및 topo 신호 모두 많은 경우,이 단계에서 관찰 될 수 있지만 ligase 신호 VACC TOPO 및 듀얼 표시된 Oligonucleotide없이 반응 믹스의 다시 응용 프로그램에 의해 더욱 강화된 수 있지만 머리핀 모양의 oligonucleotide (Oligonucleotide 3)이 포함된 수 (35 MG / ML)와 T4 DNA ligase (250 U / ML). 향상시키기 위해 신호는 5 단계로 이동하십시오 개선하지 않고 반응을 보려면, 3 단계로 진행합니다. </li><li> 부드럽게 실온에서 물을 포함하는 Coplin 항아리에 세로 슬라이드를 immersing하여 coverslips를 제거합니다. 초과 물을 기음. </li><li> VACC TOPO와 Oligonucleotide 일없이 반응 믹스 25 μL을 적용하지만, Oligonucleotide 세를 포함하여 ligase 신호를 강화 : 66 MM - 트리스 HCL, pH를 7.5, 5 밀리미터 MgCl 2, 0.1 MM dithioerythritol, 1 ㎜ ATP, 그리고 15 % 폴리에틸렌 글리콜 - 8000, 5 대 T4 DNA ligase 35 MG / ML Oligonucleotide 3 (무딘 머리 핀의 자형으로 종료). 라벨 솔루션 CA의 총 부피N은 큰 섹션을 수용까지 확장할 수 있습니다. 플라스틱 coverslip와 humidified 챔버의 실내 온도 (23 ° C) 18 HR (야간)를 품어. </li><li> 부드럽게 실온에서 물을 포함 Coplin 항아리에 세로 슬라이드를 immersing하여 coverslips를 제거합니다. 다음 증류수 섹션 3x10 분 씻으십시오. </li><li> 나트륨 중탄산염 버퍼와 린스. 알카라인 솔루션은 산도 민감하고 상당히 산도 7 아래의 감소 FITC 형광을 향상 린스. </li><li> antifading 솔루션 (DAPI로 Vectashield), coverslip와 부분을 커버하고 형광 현미경을 사용하여 신호를 분석할 수 있습니다. 5&#39;OH로 두 번 스트랜드의 DNA 휴식 시간은 녹색, 5&#39;PO 4 나누기를 형광 빛이 나겠 - 레드 (그림 2) 형광합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 <img alt="그림 2." src="/files/ftp_upload/3628/3628fig2.jpg" /> 그림 1. 세미 인공 분자 기계는 다음 두 가지 유형의를 감지현장에서 DNA 손상. VACC TOPO는 이중 머리핀 32 메르에 바인딩하면 형광 기계 자체 - 조립. 기계를 통해 두 검출기 단위로 분할 자체로 작업을 시작 topoisomerase 만들어진 인식 순서의 3 &#39;끝에 했네요. FITC - 레이블이 붙은 장치가 지속적으로 분리와 rhodamine - 레이블 단위로 religates 순환 과정에서이 결과를. 감지 DNA 브레이크가 발생되기 전까지이 지속. 이러한 대안 수용체 (5&#39;OH 뭉툭한 끝 DNA 휴식) 조직 섹션에있는 경우, FITC 부분은 그것을 ligate 것입니다. 나머지 rhodamine 부분은 T4 DNA ligase의의 도움으로 5 &#39;PO 4 DNA 뭉툭한 끝 휴식에 연결합니다. 따라서 DNA 나누기 두 가지 유형의 동시에 감지됩니다. <img alt="그림 1." src="/files/ftp_upload/3628/3628fig1.jpg" /> 그림 2. 분자 기계 이중 라벨 DNA 나누기 두 종류의dexamethasone - 처리 thymus의 조직 섹션 인치 DNase의 무딘 엔드 DNA의 휴식 시간은 I -와 DNase II - 타입은 apoptosis를 겪고 thymic 피질 영역에서 감지됩니다. 녹색 형광 세포질 (5&#39;OH DNA 나누기)은 apoptotic thymocytes의 핵 물질을 소화 외피 macrophages을 표시합니다. 이 신호는 VACC TOPO에 의해 생산, 그리고 5&#39;OH 더블 스트랜드 휴식 11,12를 포함하는 DNA와 phagolysosomes에 localizes 있습니다. 적색 형광 (5&#39;PO 4 나누기) macrophages에 의해 빨아들이는하지 apoptotic thymocytes의 레이블 핵. thymocytes의 거대한 숫자가 동시에, 5&#39;PO 4 번 스트랜드 나누기의 생성과 함께 apoptosis를 받아야 ligase 기반의 라벨로 시각. 이러한 휴식은 고리 모양의 패턴을 형성, 핵 주변에 위치하고 있습니다. 모든 세포의 핵은 DAPI (파란색 형광)과 counterstaining에 의해 시각입니다.

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin-labeled+hairpin+oligonucleotides.+Probes+to+detect+double-strand+breaks+in+DNA+in+apoptotic+cells.">Biotin-labeled hairpin oligonucleotides. Probes to detect double-strand breaks in DNA in apoptotic cells.</a> Am. J. Pathol. 152, 897-902 (1998).</li><li>Jones, R. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Soft Machines: Nanotechnology and life. , (2007).</li><li>Samejima, K., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trashing+the+genome:+Role+of+nucleases+during+apoptosis.">Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 677-688 (2005).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 비디오에서는, 우리는 이중 라벨의 DNA 손상 센서를 조립하고 사용하는 방법을 보여줍니다. 센서는 생체 분자 엔진, 인공 구성 요소와 연결된 바이러스 인코딩된 단백질 VACC의 TOPO에 의한 분자 기계입니다. 표시 개발 무독성 분자 규모의 장치 12,15의 디자인에 생물 학적 구조, 아키텍쳐 및 세포의 실제 부품과 구성 요소를 채택 옹호 생체 활성화된 접근 방식을 exemplifies. 1 :이 방법은 ?...

<ol><li> 크실렌 </li><li> 80 96 % 에탄올. </li><li> 증류수에 (BSA) 소 혈청 알부민의 2 % 솔루션입니다. </li><li> Oligonucleotide 1 : 이중 머리핀, 이중이 플루오레신 및 tetramethylrhodamine으로 표시 : </li></ol> GCG AT 5&#39; - AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT는 R TT - 3 &#39;; F - FITC - DT, R - Tetramethylrhodamine - DT. 이러한 BODIPY TR, rhodamine 또는 TAMRA 같은 다른 빨간 이동 fluorophores은 R 대신 tetramethylrhodamine에 사용할 수 있습니다. 또는 당신은 Oligonucleotide 2 사용할 수 있습니다 -. 플루오레신으로 표시 더블 머리 핀의 자형으로 단일 (DNA 나누기의 하나의 유형 (DNase II 타입 전용)의 검출을위한 단일 형광단 운반 탐사선이 상당히 저렴하고 편리한 때마다 단일 DNA 나누기의 유형은 표시되어야하는 것입니다 : 5&#39; - AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT ATG CGT T - 3 &#39;; F - FITC - DT </p&gt; <ol start="5"><li> Oligonucleotide 3. Tetramethylrhodamine - DT - R, 5&#39; - GCG CTA GAC C R G GTC TAG CGC - 3 &#39;T4 DNA ligase와 함께 현장의 결합 신호에의 향상을 위해 무딘 엔드 rhodamine - 라벨이 머리핀 </li><li> 우두 DNA topoisomerase L (VACC TOPO) - 3,000 U / μL (생생한 기술). 초기 실험에서 우리는 반응 믹스의 모든 25 μL 당 VACC TOPO의 215 pmoles (7.1 μg)를 사용합니다. 그러나, topoisomerase 농도는 상당히 감성의 손실없이 줄일 수 있습니다. 우리는 나중에 유사한 결과를 섹션당 VACC TOPO (섹션당 반응 믹스 25 μL의 1.76 μg)의 4 배 낮은 금액을 사용합니다. 880 NG (반응 믹스 25 μL)로 효소의 양을 줄이는 것은 약한 신호와 VACC TOPO의 8.8 NG 결과는 감지 신호를 생산하지 않습니다. </li><li> T4 DNA ligase 5 U / μL (Roche는). 이 고도로 집중 ligase 준비 우리가 실험 조건에서 최고의 신호를 제공합니다. </lI&gt; <li> T4 DNA ligase 10 X 반응 버퍼 : 660 MM 트리스 - HCL, 50 MM MgCl 2, 10 MM의 dithioerythritol, 10 MM ATP, 산도 7.5 (20 ° C) (Roche는). 반응 버퍼 ATP는 쉽게 해동 - 냉동의 반복 사이클에서 파괴됩니다. 나누어지는는 다음 위치에서 작은 15-20 μL 부분과 저장소에있는 버퍼 - 20 ° C. 한번 사용합니다. </li><li> bidistilled 물에 PEG - 8000 (시그마)의 30 % (W / V)이 솔루션입니다. 15% 반응 믹스에서 PEG - 8000 강력하게 볼륨 제외하여 성분의 효과적인 농도를 증가, 검색을 자극. </li><li> 증류수의 Proteinase K (Roche는) 20 밀리그램 / ML 재고 솔루션입니다. 에 저장 - 주식에서 준비 PBS의 반응을 사용 50mg/mL 솔루션, 20 ° C.. 재사용하지 마십시오. </li><li> DAPI (벡터 연구소)와 Vectashield. </li><li> 나트륨 중탄산염 버퍼 : 50m M NaHCO 3, 15m M NaCl, pH를 8.2. </li><li> 22x22mm 또는 22x40mm 유리 또는 플라스틱 coverslips. 플라스틱 coverslips들은 같은 반응 동안 좋습니다 아르섹션에서 제거할 쉽게 다시. </li></ol>

in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage

자연스럽게 발생하는 생체 분자 기계는 모든 살아있는 세포에서 작업과 디자인 1-6 다양한 표시됩니다. 그러나 방향 운동, 즉 분자 모터 수있는 장치에 대한, 그들의 스케일 다운 기계 부품 (바퀴, axels, 펜던트 등) 7-9에서 인공 분자 기계 센터의 개발. 이것은 관성과 운동량 보존 이러한 장치에 대한 필수적인 물리적 속성, nanoworld 환경 10 사용할 수없는 경우에도 매크로 시스템을 imitates. 기계 macromachines 계획에 따라 생물 학적 분자의 진화에 개발한 메커니즘을 사용하지 않는 대체 디자인, nanoworld의 특정 조건을 활용할 수 있습니다. 게다가, 나노 디자인의 목적을 위해 실제 생물 학적 분자를 채택하면 나노 제품 포즈 수있는 잠재적인 위험을 줄여줍니다. 여기는, 하나의 바이오 기반 구조의 조립 및 애플 리케이션을 설명인공 구성 요소와 자연 - 발생 분자 기계를 결합하여 EMI - 인공 분자 장치. 보기의 enzymology 지점에서, 우리의 구조는 디자이너 형광 효소 - 기질 복합 특정 유용한 기능을 수행하기 위해 함께 들어가게된다. 그 하나의 12가 들어 있으므로이 어셈블리는 정의에 의해 분자 기계입니다. 그러나, 설계 부분와의 통합 - 형광 듀얼 머리 핀의 자형 - DNA 손상 12 라벨링의 새로운 작업에 다시 번 지휘하고 있습니다. 우리의 구조는 32 메르 DNA와 효소 우두 topoisomerase I (VACC TOPO)의 밖으로 조립. 기계 후 두 찬란 표시 검출기 단위 (그림 1)를 조작하기 위해 자신의 소재를 사용합니다. 단위 중 하나는 (녹색 형광) covalently의 3&#39;end와 다른 장치 (적색 형광)에 연결된 VACC TOPO가 터미널 3&#39;OH와 함께 무료로 머리핀입니다시킵니다. 단위도 잊혀하고 신속 이후 recleaves 원래 구조로 다시 재조 립.DNA의 부재에서는 순환 방식으로 연속적으로 분리하여 religate이 두 단위 나옵니다. DNA 손상, topoisomerase 운반 검출기 단위 선택 찬란를 라벨, 5&#39;OH (DNase II 타입 나누기) 11,12과 무딘 엔드의 DNA 휴식에 부착과 조직 섹션에. T4 DNA ligase에이 솔루션 13,14에있는 경우 oligonucleotide 절단 후 형성 둘째, 효소 - 무료 머리핀은 5&#39;PO 4 무딘 엔드 휴식 (DNase I - 타입 휴식) 11,12에 ligate 것입니다. T4 DNA ligase의가 조직의 섹션 또는 5&#39;PO 4 무딘 엔드 휴식과 DNA를 포함하는 솔루션에 추가되면, ligase 준 안정 효소 - DNA의 단지를 형성, 5&#39;PO 네 DNA 종료와 함께 반응. 무딘 종료된 헤어핀 따라서 5&#39;PO 4 무딘 엔드의 DNA 나누기를 라벨, DNA에 ligase와 covalently 연결 헤어핀를 방출이 단지와 상호 작용합니다. 이 개발 일에 새로운 실용적인 접근 방식을 exemplifies전자 분자 기계의 설계 및 고정 세포 및 조직에서 apoptosis와 DNA 손상의 검출에 유용한 센서를 제공합니다.

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In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

우리는 topoisomerase 단백질에 의해 구동되는 분자 규모의 장치의 조립 및 응용 프로그램을 보여줍니다. 구조는 끝이 두 가지 다른 fluorophores을 첨부하여 조직 섹션에서 DNA 나누기의 두 가지 주요 유형의 레이블 생체 분자 센서이다.

DNA 손상 감지를위한 세미 인공 분자 기계 및 이용 체외 조립에

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

11.5K 조회수.  Baylor College of Medicine. 우리는 topoisomerase 단백질에 의해 구동되는 분자 규모의 장치의 조립 및 응용 프로그램을 보여줍니다. 구조는 끝이 두 가지 다른 fluorophores을 첨부하여 조직 섹션에서 DNA 나누기의 두 가지 주요 유형의 레이블 생체 분자 센서이다.

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Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

핵산, 단백질과 작은 분자의 Reagentless 감지를위한 전기 -의 DNA Biosensors의 제작

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

연구

생체공학

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

We describe here a platform that allows comet assay detection of DNA damage with unprecedented throughput. The device patterns mammalian cells into a microarray and enables parallel processing of 96 samples. The approach facilitates analysis of base level DNA damage, exposure-induced DNA damage and DNA repair kinetics.

CometChip : Microarrayed 인간의 세포에서 DNA 손상을 측정하기위한 높은 처리량 96 글쎄 플랫폼

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

복원 된 인간의 각막 모양의 상피 (RHCE) 조직 모델을 사용하여 눈에 자극성 화학 물질의 위험 식별을위한 눈 자극 시험 (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

미세화 및 3D 미세 혈관의 조립

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

모듈형 DNA 장치 조립 로봇 액체 처리 자동화

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs). Achieving sufficient cellular uptake of SPIONs is a challenge that has traditionally been met by exposing cells to elevated concentrations of SPIONs or by prolonging exposure times (up to 72 hr). However, these strategies are likely to mediate toxicity. Here, we present the synthesis of the protein-based SPION magnetoferritin as well as a facile surface functionalization protocol that enables rapid cell magnetization using low exposure concentrations. The SPION core of magnetoferritin consists of cobalt-doped iron oxide with an average particle diameter of 8.2 nm mineralized inside the cavity of horse spleen apo-ferritin. Chemical cationization of magnetoferritin produced a novel, highly membrane-active SPION that magnetized human mesenchymal stem cells (hMSCs) using incubation times as short as one minute and iron concentrations as lows as 0.2 mM.

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

세포의 초고속 자화에 대한 양이온 Magnetoferritin의 합성

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) has been demonstrated to increase MSC osteogenic differentiation in vitro and promote bone healing in clinical settings. Here we describe the construction of an EStim cell culture chamber and its use in treating rat bone-marrow-derived MSC to enhance osteogenic differentiation. We found that treating MSCs with EStim for 7 days results in a significant increase in the osteogenic differentiation, and importantly, this pro-osteogenic effect persists long after (7 days) EStim is discontinued. This approach of pretreating MSCs with EStim to enhance osteogenic differentiation could be used to optimize bone tissue engineering treatment outcomes and, thus, help them to achieve their full therapeutic potential. In addition to this application, this EStim cell culture chamber and protocol can also be used to investigate other EStim-sensitive cell behaviors, such as migration, proliferation, apoptosis, and scaffold attachment.

Here we present a protocol for the construction of a cell culture chamber designed to expose cells to various types of electrical stimulation, and its use in treating mesenchymal stem cells to enhance osteogenic differentiation.

건설 및 생체 외에서 중간 엽 줄기/Stromal 세포 Osteogenic 차별화를 강화 하기 위한 전기 자극 챔버의 사용

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically been studied in vivo in animal models showing characteristic patterns of cell migration. However, in vivo models have several limitations, including intercellular mediators that are difficult to access and analyze, as well as the inability to directly analyze human neutrophils. Because of these limitations, there is a need for an in vitro platform that studies swarming with human neutrophils and provides easy access to the molecular signals generated during swarming. Here, a multistep microstamping process is used to generate a bioparticle microarray that stimulates swarming by mimicking an in vivo infection. The bioparticle microarray induces neutrophils to swarm in a controlled and stable manner. On the microarray, neutrophils increase in speed and form stable swarms around bioparticle clusters. Additionally, supernatant generated by the neutrophils was analyzed and 16 proteins were discovered to have been differentially expressed over the course of swarming. This in vitro swarming platform facilitates direct analysis of neutrophil migration and protein release in a reproducible, spatially controlled manner.

This protocol generates bioparticle microarrays that provide spatially controlled neutrophil swarming. It provides easy access to the mediators that neutrophils release during migration and allows for quantitative imaging analysis.

생체 외에서 인간 호중구 떼의 화학 및 분자 분석을 위한 생체 입자 미세어레이

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

장기 나노 물질 노출 다음 체외 물질 독성 테스트를 위한 고급 3D 간 모델

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. Ultrasound-mediated sonoporation is an emerging technique for rapid intracellular delivery of biomolecules. Sonoporation occurs when cavitation of gas-filled microbubbles forms transient pores in nearby cell membranes, which enables rapid uptake of biomolecules from the surrounding fluid. Current techniques for in vitro sonoporation of cells in suspension are limited by slow throughput, variability in the ultrasound exposure conditions for each cell, and high cost. To address these limitations, a low-cost acoustofluidic device has been developed which integrates an ultrasound transducer in a PDMS-based fluidic device to induce consistent sonoporation of cells as they flow through the channels in combination with ultrasound contrast agents. The device is fabricated using standard photolithography techniques to produce the PDMS-based fluidic chip. An ultrasound piezo disk transducer is attached to the device and driven by a microcontroller. The assembly can be integrated inside a 3D-printed case for added protection. Cells and microbubbles are pushed through the device using a syringe pump or a peristaltic pump connected to PVC tubing. Enhanced delivery of biomolecules to human T cells and lung cancer cells is demonstrated with this acoustofluidic system. Compared to bulk treatment approaches, this acoustofluidic system increases throughput and reduces variability, which can improve cell processing methods for biomedical research applications and manufacturing of cell-based therapeutics.

This protocol describes the assembly and operation of a low-cost acoustofluidic device for rapid molecular delivery to cells via sonoporation induced by ultrasound contrast agents.