우리는 재정 지원을위한 Wellcome 신뢰와 ERC에 감사를드립니다. IMGG은 EMBO 연구원입니다. KLH는 BBSRC 투자 박사 과정 학생입니다. 우리는 현미경과 유지 보수 및 지원을위한 기술 및 세포 문화 지원과 박사 앤드류 도허티를 위해 필립 루빈과 패트 릭 Tidball 감사드립니다.

1. 세포 배양, 바이러스성 형질 도입 및 단백질 표현 <ol><li> 시험 관내 (DIV)의 14~25일위한 폴리-L-라이신-코팅 유리 coverslips에서 배아 일 18 일 (E18)의 쥐 새끼의 문화 고밀도 hippocampal 뉴런. </li><li> 6 - 24 시간 전에 살아있는 실험으로, 슈퍼 황도 pHluorin (9월) 태그에 관심있는 막 단백질을 포함하는 감쇠 Sindbis 바이러스와 transduce 세포. </li><li> 에어컨 미디어 1mL를 포함 coverslip에 직접 pseudovirion 함유 매체를 추가하고 문화 인큐베이터으로 돌아왔습니다. 바이러스성 형질 도입에 따라 단백질 발현을위한 titer와 시간은 바이러스 배치에 따라 다를 수 있으며, 사전 라이브 셀 실험을 시작으로 각 일괄 처리에 대한 결정되어야합니다. </li></ol> 2. FRAP-플립 라이브 세포 이미징 <ol><li> 장비 설정 <ol><li> 자이스 혈구 Axiovert LSM 510 메타 공촛점 현미경 이미징 챔버로 coverslip을 전송합니다.이미징 동안 전력 변동을 최소화하기 위해 현미경은 이미징 이전 최소 20 분 동안 100 % 레이저 출력으로 켜져되었습니다 보장합니다. </li><li> 즉시, 미리 예열과 문화 매체를 교체 (37 ° C) 140 밀리미터 NaCl, 5 밀리미터 KCl, 15 MM 포도당, 1.5 MM CaCl 2, 1.5 밀리미터 MgCl 2, 20-25 MM HEPES을 (산도가 조절이 포함된 세포외 녹음 솔루션 NaOH와 7.4)와이 자이스 혈구 Axiovert의 예비 가열 단계 (37 ℃)에서 챔버에 배치. 세포외 녹음 솔루션의 osmolarity가 배지 10 mOsM 이내로 조정됩니다 확인하십시오. 더 중요한 증발이 실험 timecourse 동안 발생하지 않습니다 제공,이 CO 2 독립적인 솔루션은 짧은 실험 (&lt;10 시간)에 적합합니다. 1-2 밀리미터 나트륨 중탄산염으로 보완하는 것이 좋습니다. </li></ol></li><li> 영상 캡처 매개 변수를 정의 <ol><li> 첫째, 재조합 프로를 표현하는 신경 세포를 식별관심 tein과 집중시키다. </li><li> 63X 기름 반대로, 낮은 레이저 파워에서 488nm 레이저 조명 여기를 사용하여 전체 세포의 이미지를 획득. photobleaching 최소화하기 위해 전체 스캔 속도에게 &lt;1 초 유지하는 빠른 공칭 속도 (7-9)과 낮은 픽셀 해상도 (512-512)을 사용합니다. </li><li> 투자 수익 (~ 1.5-2.5 X 광학 줌) 포함하는 프레임을 캡처하는 이미지와 확대에 dendrite의 일부를 선택합니다. 가능하다면, 불특정 인해 인수가 발생에 photobleaching 있는지 확인하기 위해, 참고 dendrites에서 측정을 얻을 수 있도록보기의 필드가 여러 프로세스를 포함하고 보장합니다. </li><li> 필터, 핀홀, 스캔 속도와 최소한의 레이저 여기에서 그러나 한정된 채도와 최대한의 형광을 활성화 탐지기 게인을 조정합니다. 대형 핀홀 직경은 (2μm는 쪽이 및 3 원 dendrites에 적합) 광자 컬렉션을 극대화하기 위해 권장합니다. 검출기 이득은 작은 형광 단위를 감지할 수있을만큼 강해 져야한다photobleaching 전에 처음 이미지, 포화 픽셀의 10 %를 극복하지 않는 것이 그러한. </li><li> 사전 / 사후 표백제와 실험의 복구 단계에 사용하도록이 구성을 저장합니다. </li><li> 다음 photobleach 영역을 정의하며 이후 반복적인 photobleaching 단계의 초기 photobleach 및 측면 지역에 대한 투자 수익 (ROI)을 선택합니다. 측면 지역은 스캔 (일반적으로 5 μm의, 그림을 참조하십시오. 2) 사이에 확산하여 복구를 방지할 수있을만큼 넓은 확인하십시오. </li><li> photobleach의 ROIs 모두 표백 매개 변수를 조정하십시오. 초기 photobleach는 광학 줌 및 투자 수익 (ROI)의 볼륨에 따라 1-5 반복 사이에 필요로 급속한 (0.1-0.5 초)이어야합니다. 측면 지역의 경우, 레이저 여기는 측면 영역의 지속적인 photobleaching을 보장하도록 조정하지만, phototoxic 손상없이해야한다. </li><li> 지침으로서, 우리는 반복 photobleaching 산도를 위해 100 % 레이저 초기 photobleach 위해 여기, 그리고 10 % 만 사용ASE. </li></ol></li><li> 이미지 획득 <ol><li> 모든 매개 변수가 설정되고 나면, 아래의 4 블록에서 설명한 변수 촬영된 이미지 시퀀스와 같은 FRAP-플립 실험을 수행 : BLOCK 1 : 3-10 미리 표백제를 기준 이미지, 낮은 레이저 파워에서, 시간 지연 BLOCK 2 : Photobleach 전체 레이저 파워에서 중앙 투자 수익 (ROI), 1-5 반복 BLOCK 3 : 3-10 후 표백제를 복구 이미지 4 BLOCK : 1의 전형적인 시간 간격으로 이미지 캡쳐와 함께 미디엄 레이저 파워에서 영역을 측면의 반복 photobleach - 5 초, 조사중인 단백질의 회복 속도에 따라. </li><li> 마지막으로, 140 MM NaCl, 5 밀리미터 KCl, 15mM 포도당, 1.5 MM CaCl 2, 1.5 밀리미터 MgCl 2, 20-25 MM MES (형광 끄지 위하여) 또는 50 MM을 구비를 포함 pH6에서 버퍼 녹음 솔루션 세포외 녹화 솔루션을 대체 NH4Cl 90 MM NaCl, 5 KCl MM 15 MM 포도당, 1.8 MM CaCl 2, 0.8 MM를 포함하는MgCl 2, 20-25 밀리미터 HEPES, pH7.4 (낮은 pH의 세포 내 상점에서 단백질을 표시하는 방법), (그림을 참조하십시오. 2). </li><li> 통계 분석을 사용하려면, 각각의 재조합 단백질을 위해 최소한 10-20 데이터 집합을 수집합니다. 바이어스 결과를 피하려면되도록 이미징 조건은 복제 일관성 유지됩니다. 모든 데이터 불완전한 표백, 중요한 초점 평면 드리프트 또는 phototoxic 세포 손상이 관찰되는 위치 설정 폐기하십시오. </li></ol></li></ol> 3. 데이터 분석 <ol><li> ImageJ 소프트웨어와 함께 이미지를 엽니다. </li><li> Stackreg 플러그인 (플러그인 → stackreg → 변환을 사용하여 시계열에 걸쳐 발생했을 수 XY 평면의 작은 변화에 대해 계정에 스택을 정렬 : 딱딱한 몸을 → <ok> ). </ok></li><li> 자이스 혈구 공촛점에 찍힌 사진을 보려면 텍스트 파일과 같은 시간 값 (플러그인 → 도구 모음 → LSM보기 LSM 도구 상자를보고 LSM 도구 모음 플러그인을 사용 → <apply stamps=""> → <apply t-stamp=""> )및 분석 스프레드 시트에 이러한 값을 가져옵니다. </apply></apply></li><li> FRAP-플립 실험 중 형광 변화를 측정하기 위해서 각각의 픽셀 영역 (~ 20pixels)로 photobleached 세그먼트를 분할하고 각 시점 (F)에서 이러한 ROIs의 평균 형광을 측정합니다. 신속하게 이러한 값을 얻으려면 ImageJ &#39;투자 수익 (ROI) 관리자&#39;분석 도구 (→ 도구 → 투자 수익 (ROI) 관리자를 분석)를 사용하여 여러 ROIs를 선택하고 &#39;플롯 Z 축 프로파일&#39;명령 (사용하는 픽셀 당 평균 형광을보고 이미지 → 스택 → 플롯 Z 축 프로파일). </li><li> 배경이 아닌 형광 영역의 형광 강도를 측정하기 위해이 단계를 반복합니다. </li><li> 실험적인 노이즈를 제거하고 평균 미리 표백 기준 척도에 의해 모든 가치를 나눌 배경 값을 빼서하여 각 시점에서 형광 강도를 정상화. </li><li> 불특정의 수준을 평가하기 위해 인접하지 않은 photobleached dendrites의 형광 강도를 측정수집하는 동안 photobleaching. 불특정 photobleaching에 대한 정정은 &#39;FRAP-뒤집기&#39;데이터의 해석에 대해 낙심하고 가능한 한 피해야한다. </li><li> 중요한 복구가 투자 수익 (ROI)에 자리를 차지하게되지 않으면 계산하려면 첫 번째 5-10 조치 (ΔF)의 평균에서 시퀀스의 마지막 5-10 조치의 평균을 빼야하고 통계적 의미를 결정한다. exocytosis의 패턴 (예 : exocytosis의 핫스팟이나 척추 대 샤프트 복구)을 평가하기 위해 복구 및 비 회복 ROIs를 분류합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 전형 FRAP-플립 실험의 결과는 그림에 표시됩니다. 2. 여기에서, 9 월 태그에 AMPA 타입 글루 탐 산염 수용체의 GluA2 subunit을 표현 신경 세포가 선택적으로 dendrite의 지역에 따라 photobleached되었습니다. 그림 2.A는 몇 군데와 (화이트 박스 영역) photobleaching로 선정되었습니다 ROIs를 나타냅니다되었습니다 dendrite의 영역을 보여줍니다. 일전자 커다란 흰 박스 영역을 두 번 가고 파란색 화살표로 강조 측면 박스 지역의 표백 반복이어서, 일단 표백되었다. 빨간색 화살표는 낮은 패널 높은 배율로 표시 측정된 투자 수익 (ROI)을 나타냅니다. 그림 2.B는 실험 시간이 코스를 통해 측정된 투자 수익 (ROI)의 형광 강도를 보여줍니다. 이 예제에서는 1 분 복구 기간은 표백하지 않은 수용체는 측면 확산하여 투자 수익 (ROI)를 입력할 수 있도록 초기 photobleach 후에 기록되었다. 측면 영역이 photobleached 때, 수용체의이 고도의 운동성이있는 분수에서 형광 신호는 중앙 지역에서 occluded하고 있으며, 지역 내에 이러한 밖을 희석된다. &#39;뒤집기&#39;순서를 통해 관찰 형광 (ΔF)의 증가 따라서 돌기 축의 월 GluA2의 삽입에 의한 것이 있습니다. 낮은 산도 세척 및 산도 7.4은 + NH4Cl 또한 각각 측정된 형광이 표면에서 파생되었는지 확인측정된 투자 수익 (ROI) 내에서 세포, 분리된 단백질의 비율을 단백질과를 공개. FRAP와 달리,이 방법론은 photobleached 지역의 형광 회복 크게 감소 수준의 결과로 인해 exocytosis에 복구를 분리합니다. 전혀 신뢰할 수있는 수학적 모델과 데이트도하는 것은 맞지와 회복이 선택적 표백 기술을 이용하여 기록된 흔적은 무었 분석하기 위해 개발되었습니다. 그것은 모노 지수 회복과 복구 추적에 맞게, 그러나 가능하다 : F (t) = S - 영 전자 (-T / τ) F (t)는 시간 t에 형광 어디있어, s는, 정상 상태 값은 0 시간 0 번 오프셋이며, τ는 일정한 시간입니다. 복구 성장 삽입 및 확산 사이의 안정된 상태로 대응하는, 평형에 도달하기 위해 주어진 속도로 고정됩니다. 중요한 것은, 시간 상수이에서 추출nalysis는 exocytosis의 지속 시간을 반영하지 않으며 오직 개인의 단백질에 대한 비교 치료에 사용될 수 있습니다. 또한, 형광 회복 예상 패턴 photobleached 지역에 따라 하위 도메인에서 관찰 가능성이 높습니다. photobleached 세그먼트 내의 작은 투자 수익 (ROI) 분석은 exocytosis &quot;핫스팟&quot;을 공개하는 것이 필수적이 될 수 있고 그것은 계산 속도에 영향을줍니다 dendrite 사이에 이러한 장소의 밀도 변화 같은 비교 길이의 영역을 분석하는 것이 좋습니다. 그림 3은보기의 분야에서 여러 dendrites 대형 섹션 투자 수익 (ROI)에 photobleach를 적용,이 프로토콜의 확장을 보여주는 단 하나의 dendrite의 표백 선택적 반복하여 따라갔다. 이 접근법은 전통적인 &#39;FRAP&#39;와 병렬로 취득되는 &#39;FRAP-뒤집기&#39;데이터 수 있습니다. 이 예제에서는 hippocampal 뉴런은 kainate 클래스의 글루 탐 산염 수용체 subunit에 감염되었습니다; GluK2을 월 태그를 지정했습니다. Prio이미징에 대한 R은 이러한 뉴런은-되었다 단백질 합성을 차단하는 cylcohexamide (200μg/ml에서 2 시간)로 치료. 각각의 측정 ROIs (그림 3.B)에서 같은 형광 복구 &#39;FRAP-뒤집기&#39;프로토콜 들어서는 dendrite에서 혼자 표준 FRAP의 dendrite 대 재활용의 측면 확산과 재활용으로 인해 회복의 비율을 밝히지 있습니다. FRAP 대 &#39;FRAP-뒤집기&#39;회복 곡선, 재활용의 상대적 기여도 (ΔF 레크 리에 = 11.05 %) 대 (ΔF 비교 = 9.35 %) 확산 측면에서 ΔF 값을 비교하는 것은 유추 할 수 있습니다. 그림 2와 달리 회복 단백질 합성의 억제로 인해 정상 상태 수준보다는을 유지하지 않습니다 보여줍 가능한 수용체 수영장 (휴일 약 20 % 감소의 고갈에 대한 일시적 증가와 대응, 신호의 드롭 오프 이후 촬영 기간 동안). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig1.jpg" /></P&gt; 그림 1.이 도식은 월 태그를 수용체를 사용하여 &#39;FRAP-뒤집기&#39;프로토콜 대 정기 FRAP의 결과를 보여줍니다 FRAP VS FRAP-플립 프로토콜의 원칙의 도식. 전통 FRAP의 형광 복구는 왼쪽에 표시됩니다. 중앙 투자 수익 (ROI)로 측정 형광 복구 재활용 및 / 또는 돌기 축에 드 노보 exocytosis를 통해 photobleached 투자 수익 (ROI)와 수용체의 삽입 외부에서 측방 확산 F 비 photobleached 월 태그를 수용체의 조합에 따라 결정됩니다. 반대로 오른쪽에 그림 측면 ROIs의 반복 photobleached가 보여주는 방법을 수평 확산으로 인해 수정된 &#39;FRAP-뒤집기&#39;프로토콜 침묵 복구. 따라서 모든 측정된 형광 복구는 투자 수익 (ROI)에 직접 삽입에 의한 것이 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig2.jpg" /> 그림 2.돌기 축의 플라즈마 막에 월 GluA2의 삽입 ) 월 GluA2을 표현 hippocampal 신경 세포가 선택적으로 dendrite의 지역에 따라 photobleached. 상단 왼쪽 패널 photobleaching 위해 선택되었습니다 ROIs을 강조하면서 도식은 몇 군데되었습니다 dendrite의 영역을 보여줍니다. 대형 흰 박스 영역을 두 번 가고 파란색 화살표로 강조 측면 박스 지역의 표백 반복이어서, 일단 표백되었다. 이 패널은 photobleaching 이전 dendrite를 보여줍니다. 빨간색 화살표는 낮은 패널 높은 배율로 표시 측정된 투자 수익 (ROI)을 나타냅니다. 나) 실험 시간이 코스를 통해 측정된 투자 수익 (ROI)의 형광 강도, 투자 수익 (ROI)의 회색 레벨 (정규화되지 않음)으로 꾸몄다를 보여줍니다. 검은색 화살표는 초기 photobleach 녹색 화살표 timepoint을 강조하는 것은 반복적인 photobleaching의 시작을 나타냅니다. ΔF는 일을 나타냅니다돌기 축에 월 GluA2의 삽입으로 인해 복구 기간 동안 관찰 형광의 전자 증가. 후속 낮은 산도와 pH는 7.4 + NH 4 망할 CIA의 세차장는 회수 형광이 표현 수용체를 표면에 관한 있는지 확인합니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig3.jpg" /> 그림 3. cyclohexamide 치료를 따라 돌기 축의 재활용 및 월 GluK2의 측면 확산 대 재활용 ) hippocampal 신경 세포가 평행 FRAP 및 별도의 돌기 ROIs 함께 수행한 &#39;FRAP-뒤집기&#39;복구 프로토콜로 선택 photobleached 월 GluK2을 표현. 이 신경 세포는 단백질 합성을 (200 μg / ML에서 2 시간) 차단, cyclohexamide으로 전처리의 대상이었다. 개략도 왼쪽 패널 photobleaching 위해 선택되었습니다 ROIs을 강조하면서 몇 군데되었습니다 dendrite의 영역을 보여줍니다. 일전자 커다란 흰 박스 영역을 두 번 가고 파란색 화살표로 강조 낮은 dendrite 유일의 측면 박스 지역의 표백 반복이어서, 일단 표백되었다. 이 패널은 이전 photobleaching에 dendrites를 보여줍니다. 빨간색 화살표는 &#39;FRAP-뒤집기&#39;프로토콜에 비해 전통적인 FRAP의 형광 회복을 보여주는 B의 높은 배율에 표시된 ROIs)를 강조 표시합니다. 회복의 늦은 단계 (제 3 패널)의 형광 강도의 수준을 비교 혼자 재활용 대 수평 확산과 재활용의 기여를 보여줍니다. C가) 실험 시간이 코스를 통해 측정된 ROIs의 형광 강도가 표준 강도로 꾸몄다 보여줍니다 값. 검은색 화살표는 초기 photobleach 녹색 화살표 timepoint을 강조하는 것은 반복적인 photobleaching의 시작을 나타냅니다. ΔF 우물은 FRAP / 플립 dendrite에서 결정된 수용체 재활용으로 인해 과도 회복을 나타내며 ΔF비교는 &#39;FRAP 전용&#39;투자 수익 (ROI)에 돌기 축으로 월 GluK2의 측면 확산의 공헌을 평가합니다. 일시적 증가 cyclohexamide 치료의 결과로 가능한 수용체의 실행 아래에 해당하는 신호의 점진적 감소, 뒤에있다. 이후 낮은 산도와 pH는 7.4 + NH 4 망할 CIA의 세차장는 회수 형광이 표현 수용체를 표면에 관한 있는지 확인합니다.

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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

우리는 플라즈마 막 단백질 인신 매매의 구성 요소를 시각화하기위한 혁신적인 전략을 설명합니다. 월 태그가 포함된 단백질과 기술을 photobleaching의 조합 방식은 플라즈마 막 삽입 이벤트가 평가하는 선별 수 있습니다. 지속적으로 복구하는 동안 지역 측면에서 막 단백질 photobleaching으로 &#39;FRAP-뒤집기&#39;방식은 형광 회복에 소낭성의 인신 매매의 공헌을 평가합니다. 이 소설의 접근법은 결정되는 일정한 상태에서 회복이 관찰되는 하위 구획의 개수 및 복구 (ΔF)의 진폭을 모두 활성화, 단백질 막 삽입 직접 녹음이 가능합니다. 또한, 플립와의없이 FRAP 비교가 계산되는 측면 확산에 대한 회복의 비율 귀책 수 있습니다. 또한, 동일한 실험에서, 측면 photobleached 지역에 인접하지 않은 photobleached dendrite의 지역이 될 수질적으로 복구하는 동안 평가,이 지역에서 관찰 형광 손실 dendrite 이러한 비 photobleached 세그먼트로 photobleached 수용체의 가로 확산으로 인한 것입니다. 이 선택적 photobleaching 프로토콜은 같은 (예를 들어, dendrites 또는 쪽이) 또는 병렬 FRAP를 실시하여 측방 확산 VS 삽입의 공헌을 평가하고 &#39;FRAP 정의된 subareas의 혈장 막에 excocytosis을 특성화와 같은 세포 인신 프로세스의 다양한 조사를 활용할 수 인접한 dendrites 함께 - 플립 &#39;프로토콜 (그림 3). 구체적인 지침이 제시되어있는 동안 확실히, 각 연구실에서 특정 표본과 장비에 따라 이미지 매개 변수를 최적화해야합니다. 중요한 것은 투자 수익 (ROI)의 모든 표면 수용체는 photobleached Z 축 초점 평면 독립하지만, 상당한 phototoxic 손상 또는 불특정 photobleaching없이 있어야합니다. 우리세포 소마에서이 프로토콜을하려 할 때 ERS는 상대적으로 낮은 산도 세포내 일반적으로 구획이 지역의 높은 배경 형광 결과의 높은 비율로,주의해야합니다. 또한, 이전에 선택적 photobleaching 실험을 시작으로, 방법을 다양 우리가이 기술을에 적용할 수있는 방법을 보여주면서 새로운 월 태그를 구축, 우리는 태그를 수용체의 초기 특성이 가장 먼저 애쉬 외 의해 설명된, 실시되는 조언 2. 전반적으로,이 방법은 근처에 실시간으로 평가될 수 있도록 혈장 막에 삽입 이벤트를 활성화, 표준 FRAP 프로토콜의 강력하고 다양한 적응이다.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong시약의&gt; 이름</strong</td&gt;<td<strong&gt; 회사 소개</strong</td&gt;<td<strong&gt; 카탈로그 번호</strong</td&gt;<td<strong&gt; 댓글 (옵션)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 24mm 유리 coverslips</td&gt;<td&gt; VWR 인터내셔널</td&gt;<td&gt; 631-0161</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 폴리-L-라이신</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; P2636</td&gt;<td코트 coverslips에 borate 버퍼에&gt; 1mg/ml</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Neurobasal 중간</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 21,103</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; B27</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 17504-044</td&gt;<td&gt; 2의 연결을 도금의 %와 매체를 먹이</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 페니실린의 스트렙토 마이신</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; P0781</td&gt;<td&gt; 1의 연결을 도금의 %와 먹이 매체</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; L-글루타민</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 25,030</td&gt;<td매체 도금 / 먹이에&gt; 2mM / 0.8mM</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 말 혈청</td&gt;<td&gt; Biosera</td&gt;<td&gt; DH-291H</td&gt;<td의 연결을 도금 미디어&gt; 10% 전용</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; pSIN ReP5 클로닝 벡터</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; K75001</td&gt;<td&gt; Sindbis 바이러스 생산을위한</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; LSM510 메타 공촛점 시스템</td&gt;<td&gt; 자이스 혈구</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 이미지 J 소프트웨어</td&gt;<td&gt; NIH</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; 오픈 액세스 소프트웨어. 여기에 설명된 모든 플러그인에서 구할 수 있습니다<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/"&gt; http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/</a</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching

<p class="jove_content"이러한 수용체 및 이온 채널 등&gt; 멤브레인 단백질이 높은 편광과 morphologically 복잡 뉴런에 적극적인 인신 매매를 겪다. 이 감독 인신 매매는 전달 유지하거나 시냅스 단백질을 제거하는 근본적인 중요하다.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; 슈퍼 황도 pHluorin (9월)는 광범위 플라즈마 막 단백질의 라이브 세포 이미징에 사용되고 있습니다 eGFP의 산도에 민감한 유도체이다<sup&gt; 1-2</sup&gt;. 낮은 산도에서, 9 월 중 protonation은 광자 흡수를 감소하고 형광 방출을 제거합니다. 대부분의 세포 내 인신 매매 사건이 9월 형광을 가릴되어 낮은 산도, 월 태그를 단백질의 형광 신호 구획에서 발생하는 것처럼 9월는 중성 pH의 세포외 환경에 노출되는 플라즈마 막에서 주로이다. 고강도 9월에서 조명하면, 모든 형광 염료와 같은 (photobleached) 레스터 photodamaged입니다<sup&gt; 3-5</sup&gt;. 중요한 것은, 낮은 산도는 광자 흡수에 꺼버리는 때문에, 오직 표면은 세포 내 9월는 고휘도 조명에 의해 영향을받지 반면 9월가 photobleached 수있는 표현<sup&gt; 6-10</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"월 태그가 단백질&gt; FRAP (photobleaching 후 형광 복구)이 플라즈마 막에 단백질 역학을 평가하기위한 편리하고 강력한 기술입니다. fluorescently 태그가 포함된 단백질이 관심있는 영역에 photobleached하는 경우 (ROI) 형광의 회복은 표백 지역에 표백하지 않은 월 태그를 단백질의 움직임으로 인해 발생합니다. 이것에 의해 중 제공되지 않은 photobleached 수용체의 exocytosis에서 수평 확산 및 / 또는를 통해 발생할 수 있습니다<em&gt; 드 노보</em&gt; 합성이나 재활용 (그림을 참조하십시오. 1). 움직이기 힘드는과 모바일 단백질의 분율을 알아낼 수 있으며 diffusible 분수의 이동성과 속도론 같은 작용제 응용 프로그램 또는 같은 NMDA 또는 KCl 응용 프로그램으로의 연결을 활성화 자극 등의 기저 및 자극 상황에서 심문을하실 수 있습니다<sup&gt; 8,10</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; 우리는 선택적으로 exocytosis의 귀책 형광 반응의 회복을 시각화하기위한 photobleaching 기법을 설명합니다. 간단히, 투자 수익 (ROI)가 측면 지역의 표백 반복하여 짧은 회복 후, 다음, 표준 FRAP 프로토콜과 마찬가지로 한번 photobleached있다. 우리가 실험실에서 개발된이 &#39;FRAP-뒤집기&#39;프로토콜은, 돌기 쪽이에서 AMPA 수용체 인신 매매를 특성화하기 위해 사용되었습니다<sup&gt; 10</sup&gt;, 그리고 세포 내 인신 매매 및 exocytosis를 평가하기위한 인신 매매 연구의 광범위한 적용이다.</p

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Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

이 보고서 표면 표현, 운송 경로 및 exogenously 표현, 산도에 민감한 GFP-태그를 뉴런의 플라즈마 막에 단백질의 인신 매매 속도론을 결정하는 라이브 세포 이미징 및 photobleach 기법의 사용을 설명합니다.

교양 뉴런의 막 단백질의 측면 보급과 Exocytosis은 형광 복구 및 형광 손실 Photobleaching를 사용하여 평가

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

lateral-diffusion-exocytosis-membrane-proteins-cultured-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

82.9K 조회수.  University of Bristol. 이 보고서 표면 표현, 운송 경로 및 exogenously 표현, 산도에 민감한 GFP-태그를 뉴런의 플라즈마 막에 단백질의 인신 매매 속도론을 결정하는 라이브 세포 이미징 및 photobleach 기법의 사용을 설명합니다.

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Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

교양 Hippocampal 뉴런의 돌기 쪽이에서 형광 단백질의 태그 Photobleaching 후 형광 복구 (FRAP)

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

연구

신경과학

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP. A significant loss of &Delta;&Psi;m renders cells depleted of energy with subsequent death. Reactive oxygen species (ROS) are important signaling molecules, but their accumulation in pathological conditions leads to oxidative stress. The two major sources of ROS in cells are environmental toxins and the process of oxidative phosphorylation. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress have been implicated in the pathophysiology of many diseases; therefore, the ability to determine &Delta;&Psi;m and ROS can provide important clues about the physiological status of the cell and the function of the mitochondria. 
Several fluorescent probes (Rhodamine 123, TMRM, TMRE, JC-1) can be used to determine &Delta;&psi;m in a variety of cell types, and many fluorescence indicators (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H2DCF-DA) can be used to determine ROS. Nearly all of the available fluorescence probes used to assess &Delta;&Psi;m or ROS are single-wavelength indicators, which increase or decrease their fluorescence intensity proportional to a stimulus that increases or decreases the levels of &Delta;&Psi;m or ROS. Thus, it is imperative to measure the fluorescence intensity of these probes at the baseline level and after the application of a specific stimulus. This allows one to determine the percentage of change in fluorescence intensity between the baseline level and a stimulus. This change in fluorescence intensity reflects the change in relative levels of &Delta;&Psi;m or ROS. In this video, we demonstrate how to apply the fluorescence indicator, TMRM, in rat cortical neurons to determine the percentage change in TMRM fluorescence intensity between the baseline level and after applying FCCP, a mitochondrial uncoupler. The lower levels of TMRM fluorescence resulting from FCCP treatment reflect the depolarization of mitochondrial membrane potential. We also show how to apply the fluorescence probe H2DCF-DA to assess the level of ROS in cortical neurons, first at baseline and then after application of H2O2. This protocol (with minor modifications) can be also used to determine changes in &#x2206;&#x03A8;m and ROS in different cell types and in neurons isolated from other brain regions.

We demonstrate application of the fluorescence indicator, TMRM, in cortical neurons to determine the relative changes in TMRM fluorescence intensity before and after application of a specific stimulus. We also show application of the fluorescence probe H2DCF-DA to assess the relative level of reactive oxygen species in cortical neurons.

라이브 랫 두피 뉴런에서 Mitochondrial 분리막 잠재력과 반응 산소 종의 결정

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

교양 CNS의 뉴런의 돌기 스파인 형태론 분석

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

FM 염료를 사용하여 양식 소뇌 과립 뉴런에서 시냅틱 소포 풀 보충의 정량 분석

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs 4-6. Altered patterns of dendritic growth and plasticity are associated with impaired neurobehavioral function in experimental models 7, and are thought to contribute to clinical symptoms observed in both neurodevelopmental disorders 8-10 and neurodegenerative diseases 11-13. Such observations underscore the functional importance of precisely regulating dendritic morphology, and suggest that identifying mechanisms that control dendritic growth will not only advance understanding of how neuronal connectivity is regulated during normal development, but may also provide insight on novel therapeutic strategies for diverse neurological diseases.
Mechanistic studies of dendritic growth would be greatly facilitated by the availability of a model system that allows neurons to be experimentally switched from a state in which they do not extend dendrites to one in which they elaborate a dendritic arbor comparable to that of their in vivo counterparts. Primary cultures of sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rodents provide such a model. When cultured in defined medium in the absence of serum and ganglionic glial cells, sympathetic neurons extend a single process which is axonal, and this unipolar state persists for weeks to months in culture 14,15. However, the addition of either bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) 16,17 or Matrigel 18 to the culture medium triggers these neurons to extend multiple processes that meet the morphologic, biochemical and functional criteria for dendrites. Sympathetic neurons dissociated from the SCG of perinatal rodents and grown under defined conditions are a homogenous population of neurons 19 that respond uniformly to the dendrite-promoting activity of Matrigel, BMP-7 and other BMPs of the decapentaplegic (dpp) and 60A subfamilies 17,18,20,21. Importantly, Matrigel- and BMP-induced dendrite formation occurs in the absence of changes in cell survival or axonal growth 17,18.
Here, we describe how to set up dissociated cultures of sympathetic neurons derived from the SCG of perinatal rats so that they are responsive to the selective dendrite-promoting activity of Matrigel or BMPs.

We describe a protocol for using bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) or Matrigel to selectively induce dendritic growth in primary sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rats.

교양 공감 뉴런의 돌기 성장을 유도

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

이미징은 기본 양식 마우스 뉴런의 플라즈마 막에 수용체 삽입을 pHluorin 태그

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of live neurons with a specific primary antibody raised against an extracellular portion of the protein. Given that receptors are trafficked to and from the surface, if cells are permeabilized after fixation then both cell-surface and internal protein will be detected by the same labeled secondary antibody. Here, we adapted a method used to study protein trafficking (&#8220;antibody feeding&#8221;) to differentially label protein that had been internalized by endocytosis during the antibody incubation step and protein that either remained on the cell surface or was trafficked to the surface during this period. The ability to distinguish these two pools of protein was made possible through the incorporation of an overnight blocking step with highly-concentrated unlabeled secondary antibody after an initial incubation of unpermeabilized neurons with a fluorescently-labeled secondary antibody. After the blocking step, permeabilization of the neurons allowed detection of the internalized pool with a fluorescent secondary antibody labeled with a different fluorophore. Using this technique we were able to obtain important information about the subcellular location of this putative receptor, revealing that it was, indeed, trafficked to the cell-surface in neurons. This technique is broadly applicable to a range of cell types and cell-surface proteins, providing a suitable antibody to an extracellular epitope is available.

We describe a method to label protein on the surface of living neurons using a specific polyclonal antibody to extracellular epitopes. Protein bound by the antibody on the cell surface and subsequently internalized via endocytosis can be distinguished from protein remaining on, or trafficked to, the surface during the incubation.

라이브 배양 된 신경 세포의 항체 수유 후 세포 표면과 내면 단백질의 차등 라벨링

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in the late 1960&#8217;s, proteins associated with the synaptic plasma membrane can be isolated by ultracentrifugation on a sucrose density gradient. Once synaptic membranes are isolated, the macromolecular complex known as the post-synaptic density can be subsequently isolated due to its detergent insolubility. The techniques used to isolate synaptic plasma membranes and post-synaptic density proteins remain essentially the same after 40 years, and are widely used in current neuroscience research. This article details the fractionation of proteins associated with the synaptic plasma membrane and post-synaptic density using a discontinuous sucrose gradient. Resulting protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

This article details the enrichment of proteins associated with the synaptic plasma membrane by ultracentrifugation on a discontinuous sucrose gradient. The subsequent preparation of post-synaptic density proteins is also described. Protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

불연속 자당 구배를 사용 시냅틱 세포막과 시냅스 밀도 단백질의 제조

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible are badly known. Excitotoxicity, a process believed to contribute to neuron damage induced by both insults, is mediated by activation of glutamate receptors that promotes Ca2+ influx and mitochondrial Ca2+ overload. A substantial change in intracellular Ca2+ homeostasis or remodeling of intracellular Ca2+ homeostasis may favor neuron damage in old neurons. For investigating Ca2+ remodeling in aging we have used live cell imaging in long-term cultures of rat hippocampal neurons that resemble in some aspects aged neurons in vivo. For this end, hippocampal cells are, in first place, freshly dispersed from new born rat hippocampi and plated on poli-D-lysine coated, glass coverslips. Then cultures are kept in controlled media for several days or several weeks for investigating young and old neurons, respectively. Second, cultured neurons are loaded with fura2 and subjected to measurements of cytosolic Ca2+ concentration using digital fluorescence ratio imaging. Third, cultured neurons are transfected with plasmids expressing a tandem of low-affinity aequorin and GFP targeted to mitochondria. After 24 hr, aequorin inside cells is reconstituted with coelenterazine and neurons are subjected to bioluminescence imaging for monitoring of mitochondrial Ca2+ concentration. This three-step procedure allows the monitoring of cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to relevant stimuli as for example the glutamate receptor agonist NMDA and compare whether these and other responses are influenced by aging. This procedure may yield new insights as to how aging influence cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to selected stimuli as well as the testing of selected drugs aimed at preventing neuron cell death in age-related diseases.

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

하는 세포 칼슘의 형광 및 생물 발광 영상<sup&gt; 2 +</sup&gt; 노인 해마 신경 세포에서

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

형광 프로브를 이용한 배양 된 뉴런의 엔도 좀과 리소좀 기능의 정량화

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...