我々は、財政支援のためにWellcome TrustとERCに感謝しています。 IMGGはEMBOフェローです。 KLHは、BBSRCの資金博士課程の学生です。我々は、顕微鏡による保守と支援のための技術的および細胞培養支持体と博士アンドリュー·ドハーティのためにフィリップ·ルービンとパトリックTidballに感謝します。

1。細胞培養、ウイルス伝達、およびタンパク質発現<ol><li> in vitroで 14から25日（DIV）のポリ-L-リジンコートしたカバーガラス上に胎生18日（E18）仔ラットからの培養高密度海馬ニューロン。 </li><li>前の超黄道pHluorin（SEP）でタグライブの実験は、目的の膜タンパク質を含む弱毒シンドビスウイルスによる形質導入細胞の6-24。 </li><li>培地1mLのを含んでいるカバースリップに直接偽ウイルス含有培地を追加し、培養インキュベーターに戻されます。ウイルスの伝達以下のタンパク質発現のための力価と時間は、ウイルスのバッチによって異なりますし、前の生細胞の実験を開始するにバッチごとに決定されるべきである。 </li></ol> 2。 FRAP-FLIP生細胞イメージング<ol><li> 機器のセットアップ <ol><li>ツァイスAxiovert LSM 510 META共焦点顕微鏡の撮像室にカバースリップを転送します。撮影時に電力の変動を最小限に抑えるために、顕微鏡イメージングの前に少なくとも20分間、100％のレーザー出力で、オンされていることを確認。 </li><li>すぐに、140 mM NaClを含む予め温めておいた（37°C）細胞外記録液、5mMのKClを、15 mMグルコース、1.5mMのCaCl 2を 、1.5mMのMgCl 2、20〜25 mMのHEPES（pHに調整して培養液を交換するNaOHで7.4）とツァイスAxiovertの予熱段階（37℃）に室を配置します。 細胞外記録液の浸透圧があなたの培地の10浸透圧範囲内に調整されていることを確認してください。有意な蒸発実験の経時中に発生しない限り、このCO 2の独立したソリューションは、短期実験（&lt;10時間）に適しています。 1から2 mMの炭酸水素ナトリウムで補完することをお勧めします。 </li></ol></li><li> 画像のキャプチャパラメータを定義する <ol><li>まず、組換えプロを表現するニューロンを同定興味のあるテインとフォーカスにそれをもたらす。 </li><li> 63X油は反対に、低レーザパワーで488nmのレーザー光の励起を使用してセル全体のイメージを取得します。退色最小限に抑えるために、（512から512）総走査速度&lt;1秒維持速い公称速度（7-9）と低画素の解像度を使用します。 </li><li> ROIを（〜1.5から2.5倍光学ズーム）を含むフレームをキャプチャした画像とズームの樹状突起の部分を選択します。可能であれば、リファレンス·樹状突起からの測定値を得ることができるように、視野が発生している非特異的買収による退色かどうかを判断するために、いくつかのプロセスが含まれていることを確認してください。 </li><li>フィルター、ピンホール、スキャン速度と最小のレーザー励起からではなく、限られた彩度の最大の蛍光を有効にするには、検出器のゲインを調整します。大きなピンホール径（2μmのは、棘と三元樹状突起に適しています）光子コレクションを最大化するために、推奨されます。検出器のゲインは、小さな蛍光増分を検出するのに十分な強さでなければなりません退色する前に、非常に最初のイメージは、飽和ピクセルの10％を克服しないような。 </li><li>実験のプリ/ポスト·漂白剤と回復の段階に使用するこの設定を保存します。 </li><li>次の退色領域を定義し、後続の反復的な退色相の初期退色と隣接領域のROIを選択します。フランキング領域（通常は5μm以下、図を参照してください。2）スキャンの間に拡散して、リカバリを防止するために十分な幅であることを確認します。 </li><li>退色のROIの両方の漂白パラメータを調整します。初期の光退色は、光学ズームとROIのボリュームに応じて、1-5回の反復の間に必要な迅速な（0.1〜0.5秒）でなければなりません。隣接する地域では、レーザー励起は光毒性が損傷することなく、隣接領域の連続光退色を確保するために調整する必要があります。 </li><li>ガイドラインとして、我々は最初の光退色に100％のレーザー励起を使用して、反復的な退色のpHは10％ASE。 </li></ol></li><li> 画像収集 <ol><li>すべてのパラメータが設定されていたら、以下の4ブロックで説明されている変数タイムラプスイメージシーケンスとしてFRAP-FLIPの実験を、実行します。 ブロック1：3-10プレ漂白剤のベースラインイメージ、低レーザパワーで、時間がないの遅延 ブロック2：光退色完全なレーザーパワーで中心的なROI、1-5回の反復 ブロック3：3-10ポスト漂白リカバリイメージ ブロック4：1の典型的な時間間隔で画像キャプチャを持つ媒体のレーザーパワーで隣接領域の繰り返し退色 - 5秒、調査中のタンパク質の回収率に応じて。 </li><li>最後に、140mMのNaCl、5 mMの塩化カリウム、15mMのグルコース、1.5mMのCaCl 2を 、1.5mMのMgCl 2、20〜25 mMのMES（蛍光クエンチするために）または50 mMの補完を含むpH6ででバッファ記録液で細胞外記録のソリューションを置き換える90 mM塩化ナトリウム、5 mMの塩化カリウム、15mMのグルコース、1.8 mMのCaCl 2を 、0.8mMの塩化アンモニウムを含むのMgCl 2、20から25 mMのHEPES、pH7.4の（低pH細胞内貯蔵中のタンパク質を明らかにする）、（図2参照）。 </li><li>統計分析を有効にするには、それぞれの組換えタンパク質に対して少なくとも10から20のデータセットを収集します。バイアスの結果を避けるために、撮像条件は、複製され一貫した維持されていることを確認してください。任意のデータを破棄する不完全な漂白、重要な焦点面のドリフトや光毒性細胞の損傷が観察されている場所を設定します。 </li></ol></li></ol> 3。データ解析<ol><li> ImageJのソフトウェアで画像を開きます。 </li><li> Stackregプラグイン（プラグイン→stackreg→変換を用いた時系列全体で発生した可能性があり、xy平面の小さな変動を考慮するためにスタックを整列：剛体→ <ok> 。） </ok></li><li>ツァイス焦点で撮影した画像は、テキストフ​​ァイルとして、時刻の値を報告するLSM Toolboxのプラグインを使用する（プラグイン→LSMツール]→[LSMツール→ <apply stamps=""> → <apply t-stamp=""> ）および分析のスプレッドシートにこれらの値をインポートします。 </apply></apply></li><li> FRAP-FLIP実験中の蛍光の変動を測定するために、個々の画素領域（〜20pixels）に退色セグメントを分割し、各時点（F）でこれらのROIの平均蛍光を測定します。すぐにこれらの値を取得するには、ImageJの &quot;ROIマネージャ&quot;分析ツール（→ツール→ROI Managerを分析する）を使用して複数のROIを選択し、 &quot;プロットZ軸プロファイルのコマンドを実行します（使用して、ピクセルあたりの平均蛍光を報告画像→スタック→プロットZ軸のプロファイル）。 </li><li>背景は、非蛍光の領域の蛍光強度を測定するには、この手順を繰り返します。 </li><li>実験的なノイズを除去し、平均プリ漂白ベースラインの測定ですべての値を分割してバックグラウンド値を差し引くことにより、各時点で蛍光強度を正規化します。 </li><li>非特定のレベルを評価するために隣接する非退色樹状突起の蛍光強度を測定する取得中に退色。非特定の退色の補正は &quot;FRAP-FLIPのデータの解釈のために推奨され、可能な限り避けるべきである。 </li><li>大幅な回復はROIで行われた場合に計算するには、最初の5〜10の対策（ΔF）の平均値から、シーケンスの最後の5から10までの対策の平均値を減算し、統計的有意性を決定します。エキソサイトーシスのパターン（すなわち、エキソサイトーシスのホットスポットや背骨対シャフトの回復）を評価するための回復と非回復ROIを分類します。 </li></ol> 4。代表的な結果典型的なFRAP-FLIP実験の結果は、図に示されています。 2。ここでは、9月でタグ付けのAMPA型グルタミン酸受容体のサブユニットGluA2を表現するニューロンが選択的に樹状突起の領域に沿って退色しています。図2.Aは、イメージングと（ホワイトボックス領域）退色のために選択されているROIを示していますされている樹状突起の領域を示しています。番目の電子大きな白いボックス領域が二重に向かっ青矢印で強調表示された隣接するボックス領域の漂白繰り返し、続いて一回漂白されました。赤い矢印が下のパネルで高倍率に示すように、測定されたROIを示しています。 図2.Bは、実験の時間経過とともに測定したROI内の蛍光強度を示しています。この例では、1分間の回復期間は無漂白の受容体は横方向の拡散によってROIを入力できるようにするための最初の光退色後に記録した。フランキング領域を退色されている場合、受容体のこの非常に運動性の画分からの蛍光シグナルは、中央領域から遮蔽されており、地域内のものは外で希釈されています。 &quot;FLIP&quot;シーケンスにわたって観察蛍光（ΔF）の増加は、したがって、樹状シャフトのSEP-GluA2の挿入に起因することができます。低pHの洗浄とpH 7.4 +塩化アンモニウムに加え、それぞれ測定した蛍光は、表面から導出されていることを確認タンパク質や測定ROI内の細胞、隔離タンパク質の割合を明らかにした。 FRAPとは対照的に、この方法論は退色領域の蛍光の回復を大幅に低減レベル、その結果、エキソサイトーシスによる回復を分離します。ない信頼性の数学的モデルを常にないようにすると、この選択的な漂白技術を使用して記録された回復トレースを適合し、分析するために開発されました。それはモノ指数回復で回復のトレースに合うように、しかし可能です： F（T）= S 0 - E（-t /τ）の F（t）は時刻tでの蛍光である場合には、sは 、定常状態の値である0は時間0でのオフセットで、τは時定数である。回復の伸びは、挿入と拡散の間で定常状態に対応する平衡に到達するために与えられたレートで固定されています。重要なのは、時定数は、このから抽出されたnalysisはエキソサイトーシスの時定数を反映していないだけで個々のタンパク質の比較処理に使用することができます。 また、蛍光回復の予想パ​​ターンは、退色領域に沿ってサブドメインで観察される可能性がある。退色セグメント内の小さなROIの分析は、エキソサイトーシス &quot;ホットスポット&quot;を明らかにするために不可欠である可能性があり、それは計算速度に影響を与える樹状突起の間でこれらのスポットの密度のばらつきと同程度の長さの領域を解析することをお勧めします。 図3は、ビューのフィールドに複数の樹状突起を持つ大規模なセクションのROIに光退色を適用し、このプロトコルの拡張を示しています、1つだけの樹状突起の漂白選択の繰り返しが続く。このアプローチは、従来の &quot;FRAP&quot;と並行して取得するための &quot;FRAP-FLIPのデータを有効にします。この例では、海馬ニューロンは、カイニン酸クラスのグルタミン酸受容体サブユニットに感染している。GluK2 SEP-タグが付けられます。 PRIOrは、イメージング、これらのニューロンは、されたタンパク質合成をブロックするために、cylcohexamide（200μg/mlで約2時間）で処理した。それぞれの測定されたROI（図3.B）のような、蛍光回復としては、 &quot;FRAP-FLIP &#39;プロトコルに受ける樹状突起に単独でリサイクル対標準FRAPの樹状突起の側方拡散やリサイクルによる回収の割合を明らかにする。 FRAP対&quot;FRAP-FLIP&quot;の回復曲線からΔF値を比較し、リサイクル（ΔFREC = 11.05パーセント）対側方拡散（ΔF のdiff = 9.35パーセント）の相対的な寄与を推測することができます。図2とは異なり、回復はタンパク質合成の阻害に起因するではなく、定常状態のレベルを維持していませんが、観察可能な受容体プールの枯渇（に相当する約20％減少し、信号の一時的増加、ドロップオフ、後続を示しています。記録期間）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig1.jpg" /></P&gt; 図1。FRAP FRAP VS-FLIPプロトコルのプリンシパルの模式図この図は、SEP-タグ付き受容体を使用して、 &quot;FRAP-FLIP &#39;プロトコルに対する定期的なFRAPの成果を示しています。従来のFRAPの蛍光回復が左側に表示されます。中央のROIの測定蛍光回復は、リサイクルおよび/ ​​または樹状シャフトにde novoのエキソサイトーシスを介して退色ROIと受容体の挿入、外部からの側方拡散fは非退色SEP-タグ付き受容体の組み合わせに起因しています。対照的に、右側に示す隣接するROIの反復的な退色は、横方向に拡散するためにどのようにこの更新 &quot;FRAP-FLIP &#39;プロトコル無音の回復を示しています。このように、任意の測定した蛍光の回復がROIの直接挿入に起因することができます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig2.jpg" /> 図2。樹状突起軸に細胞膜にSEP-GluA2の挿入 A）SEP-GluA2を発現している海馬のニューロンは、選択的に樹状突起の領域に沿って退色。回路図は、左上のパネルには、退色のために選択されているROIを浮き彫りにしながら、撮像された樹状突起の領域を示しています。大きな白いボックス領域が二重に向かっ青い矢印で強調表示され、隣接するボックス領域の漂白繰り返し、続いて一回漂白されました。このパネルには、退色する前に樹状突起を示しています。赤い矢印が下のパネルで高倍率に示すように、測定されたROIを示しています。 B）実験の時間経過とともに測定したROI内の蛍光強度、ROI内のグレーレベル（正規化されていない）としてプロットを示しています。黒い矢印のハイライトは、初期の光退色と緑色の矢印のタイムポイントは、繰り返し退色の開始を示します。 ΔFは、THを示します。樹状シャフトにSEP-GluA2の挿入による回復期間中に観察され蛍光のe増加しました。その後の低pHとpH 7.4 + NH 4 Clの洗浄、回収蛍光が発現して受容体を表面に関連していることを確認します。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig3.jpg" /> 図3シクロヘキ治療後の樹状突起軸にリサイクル＆SEP-GluK2の横方向の拡散対のリサイクル A）海馬ニューロンは並列FRAPと独立した樹状ROIをに沿って実行&quot;FRAP-FLIPの回復プロトコルと選択的に退色SEP-GluK2を発現する。このニューロンは（200μg/ mlの2時間）タンパク質合成をブロックするために、シクロヘキサミドによる前処理の対象となった。回路図は、左側のパネルには、退色のために選択されているROIを強調しながら、撮像された樹状突起の領域を示しています。番目の電子大きな白いボックス領域が二重に向かっ青矢印で強調表示された唯一の低樹状突起の隣接ボックスの領域、の漂白繰り返し、続いて一回漂白されました。このパネルは、前の退色への樹状突起を示しています。赤い矢印は&quot;FRAP-FLIP &#39;プロトコルと従来のFRAPの蛍光回復を示す）Bで高倍率に示すように、ROIを強調表示します。回復の後期（第三パネル）における蛍光強度のレベルの比較だけではリサイクル対側方拡散やリサイクルの寄与を示しています。C）は、実験の時間経過とともに測定したROI内の蛍光強度を示し、正規化強度としてプロット値を示します。黒い矢印のハイライトは、初期の光退色と緑色の矢印のタイムポイントは、繰り返し退色の開始を示します。 ΔFRECは FRAP / FLIP樹状突起から決定受容体のリサイクルのために一時的な回復を示し、一方、ΔFdiff &#39;はFRAPのみ&quot;に樹状軸にROIをSEP-GluK2の側方拡散の寄与を測定します。一時的な増加は、シクロヘキ治療の結果として利用できる受容体のダウンの実行に対応する信号が徐々に減少し、続いています。その後の低pHとpH 7.4 + NH 4 Clの洗浄、回収蛍光が発現して受容体を表面に関連していることを確認します。

<ol>
	<li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity.">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li><li>Ashby, M. C., Ibaraki, K., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=It's+green+outside:+tracking+cell+surface+proteins+with+pH-sensitive+GFP.">It's green outside: tracking cell surface proteins with pH-sensitive GFP.</a> Trends Neurosci. 27, 257-261 (2004).</li><li>Swaminathan, R., Hoang, C. P., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+recovery+and+anisotropy+decay+of+green+fluorescent+protein+GFP-S65T+in+solution+and+cells:+cytoplasmic+viscosity+probed+by+green+fluorescent+protein+translational+and+rotational+diffusion.">Photobleaching recovery and anisotropy decay of green fluorescent protein GFP-S65T in solution and cells: cytoplasmic viscosity probed by green fluorescent protein translational and rotational diffusion.</a> Biophys. J. 72, 1900-1907 (1997).</li><li>Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+green+fluorescent+protein+and+its+mutants+in+quantitative+fluorescence+microscopy.">Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2782-2790 (1997).</li><li>Wiedenmann, J., Oswald, F., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging:+opportunities,+limitations,+and+challenges.">Fluorescent proteins for live cell imaging: opportunities, limitations, and challenges.</a> IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).</li><li>Ashby, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+AMPA+receptors+(AMPARs)+from+synapses+is+preceded+by+transient+endocytosis+of+extrasynaptic+AMPARs.">Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs.</a> J. Neurosci. 24, 5172-5176 (2004).</li><li>Bouschet, T., Martin, S., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-activity-modifying+proteins+are+required+for+forward+trafficking+of+the+calcium-sensing+receptor+to+the+plasma+membrane.">Receptor-activity-modifying proteins are required for forward trafficking of the calcium-sensing receptor to the plasma membrane.</a> J. Cell. Sci. 118, 4709-4720 (2005).</li><li>Ashby, M. C., Maier, S. R., Nishimune, A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+drives+constitutive+exchange+of+AMPA+receptors+at+dendritic+spines+and+is+regulated+by+spine+morphology.">Lateral diffusion drives constitutive exchange of AMPA receptors at dendritic spines and is regulated by spine morphology.</a> J. Neurosci. 26, 7046-7055 (2006).</li><li>Martin, S., Bouschet, T., Jenkins, E. L., Nishimune, A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+regulation+of+kainate+receptor+surface+expression+in+hippocampal+neurons.">Bidirectional regulation of kainate receptor surface expression in hippocampal neurons.</a> J. Biol. Chem. 283, 36435-36440 (2008).</li><li>Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-dependent+membrane+drift+recruits+AMPA+receptors+to+dendritic+spines.">Dynamin-dependent membrane drift recruits AMPA receptors to dendritic spines.</a> J. Biol. Chem. 284, 12491-12503 (2009).</li></ol>

利害の衝突が宣言されません。

我々は、原形質膜タンパク質輸送のコンポーネントを可視化する革新的な戦略について説明します。 SEP-tagタンパク質の退色技術のコンビナトリアルアプローチは、細胞膜の挿入イベントを評価することを選択できます。継続的に回復中にフランキング領域で膜タンパク質を退色することにより、 &quot;FRAP-FLIP &#39;メソッドは蛍光回復への小胞輸送の寄与を評価しています。この新しいアプローチは、決定される定常状態での回復が観察されたサブコンパートメントの数と回復（ΔF）の振幅の両方を有効にすると、タンパク質の膜挿入の直接録音することができます。さらに、FLIPの有無にかかわらずFRAPの比較が計算される横方向の拡散への回復の割合が起因することができます。 また、同じ実験では、隣接退色領域に隣接する非退色樹状突起の領域は、することができます質的に回復中に評価、これらの地域で観察された蛍光損失が樹状突起のこれらの非退色セグメントに退色受容体の側方拡散に起因します。 この選択退色プロトコルはそのような（例えば、樹状突起または棘）またはパラレルFRAPを行うことにより、横方向の拡散対挿入の寄与を評価し、 &quot;FRAP定義されているサブ領域で細胞膜にexcocytosisを特徴づけるように細胞輸送過程の様々な調査をするために利用することができます。隣接した樹状突起に沿って、FLIP &quot;プロトコル（図3）。 具体的なガイドラインが提示されてきたが、明らかに、各ラボでは、特定の標本や機器に係る撮像パラメータを最適化する必要があります。重要なのは、ROI内のすべての表面受容体は、退色z軸焦点面の独立したが、かなり光毒性損傷または非特定の退色せずにしておく必要があります。私達細胞体では、このプロトコルをしようとすると、ERSは、これらの地域では比較的低pH細胞内区画高いバックグラウンド蛍光の典型的結果の割合が高いので、注意が必要です。また、事前に選択的光退色実験を開始する、方法を変える我々はこの技術がどのように適用できるかを実証した一方で新しいSEP-タグ付きの構築、我々は、タグ付き受容体の初期特性は、最初アシュビーらによって前述のように、行われることをお勧めし2。 全体的に、このメソッドは、ほぼリアルタイムで評価される細胞膜に挿入イベントを有効にすると、標準FRAPプロトコルの強力かつ汎用性の高い適応したものです。

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong試薬の&gt;名前</strong</td&gt;<td<strong&gt;会社概要</strong</td&gt;<td<strong&gt;カタログ番号</strong</td&gt;<td<strong&gt;コメント（オプション）</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 24ミリメートルカバーガラス</td&gt;<td&gt; VWRインターナショナル</td&gt;<td&gt; 631-0161</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;ポリ-L-リジン</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; P2636</td&gt;<tdコー​​トカバーガラスにホウ酸緩衝液で&gt; 1mg/ml</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Neurobasal中</td&gt;<td&gt;インビトロジェン</td&gt;<td&gt; 21103</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; B27</td&gt;<td&gt;インビトロジェン</td&gt;<td&gt; 17504-044</td&gt;<tdニューロンのメッキと摂食媒体で&gt; 2％</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;ペニシリンストレプトマイシン</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; P0781</td&gt;<tdニューロンのメッキと摂食媒体中の&gt; 1％</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; L-グルタミン</td&gt;<td&gt;インビトロジェン</td&gt;<td&gt; 25030</td&gt;<td培地をメッキ/摂食で&gt; 2mMの/ 0.8mmの</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;ウマ血清</td&gt;<td&gt; Biosera</td&gt;<td&gt; DH-291H</td&gt;<td神経メッキメディアで&gt; 10％のみ</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; pSIN ReP5クローニングベクター</td&gt;<td&gt;インビトロジェン</td&gt;<td&gt; K75001</td&gt;<td&gt;シンドビスウイルス産生のために</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; LSM510 META共焦点システム</td&gt;<td&gt;ツァイス</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;画像Jソフトウェア</td&gt;<td&gt; NIH</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;オープンアクセスソフトウェアです。本明細書に記載のすべてのプラグインがご利用いただけます<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/"&gt; http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/</a</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching

<p class="jove_content"受容体やイオンチャネルなどの&gt;膜タンパク質は、非常に偏光と形態的に複雑であるニューロンでアクティブ人身を受けています。この監督の人身売買は、提供の維持やシナプスのタンパク質を除去するために基本的に重要である。</p&gt;<p class="jove_content"&gt;スーパー黄道pHluorin（SEP）は、広く細胞膜タンパク質の生細胞イメージングのために使用されているeGFPのpH感受性誘導体である<sup&gt; 1月2日</sup&gt;。低pHで、9月のプロトンは、光子吸収を減少させ、蛍光発光が不要になります。ほとんどの細胞内輸送のイベントは9月蛍光が隠蔽された低pH、SEP-タグ融合タンパク質からの蛍光信号とコンパートメントで発生した9月は、中性pH細胞外環境にさらされる原形質膜から主です。高強度9月に照らされたときに、すべての蛍光色素と同様に、（退色）不可逆的に光損傷です。<sup&gt; 3月5日</sup&gt;。重要なのは、低いpHが光子吸収を消光するため、表面だけは、細胞内のSEPが高輝度の照明による影響を受けないのに対し、9月は退色することができ表明<sup&gt; 6月10日</sup&gt;。</p&gt;<p class="jove_content"SEP-タグ融合タンパク質の&gt; FRAP（光退色後蛍光回復）は細胞膜でのタンパク質の動態を評価するための便利で強力な手法です。蛍光標識タンパク質は関心の領域に退色されている場合（ROI）の蛍光の回復が漂白された領域に漂白SEP-タグタンパク質の運動が原因で発生します。これは、横方向拡散を介して、および/またはのいずれかによって供給され、非退色受容体のエキソサイトーシスから発生する可能性があります<em&gt; de novoの</em&gt;合成やリサイクル（図1参照）。不動とモバイルタンパク質の割合を決定することができ、拡散性画分のモビリティと速度論をそのようなアゴニストのアプリケーションや、NMDAまたはKClアプリケーションなどの神経細胞活性化刺激として基礎と刺激された条件の下で問い合わせることができます。<sup&gt; 8,10</sup&gt;。</p&gt;<p class="jove_content"&gt;我々は選択的にエキソサイトーシスに起因する蛍光の回復を可視化するために設計された光退色技術を説明します。簡単に言えば、ROIは隣接領域の漂白反復することによって、簡単に回復した後、続いて、標準FRAPのプロトコルと同様に一度退色しています。私たちの研究室で開発されたこの &quot;FRAP-FLIP &#39;プロトコルは、樹状突起棘でのAMPA受容体の輸送を特徴づけるために使用されている<sup&gt; 10</sup&gt;、および細胞内輸送とエキソサイトーシスを評価するための人身売買の研究の広い範囲に適用可能である。</p

Watch this Scientific Journal Video about Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching at JoVE.co

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

このレポートでは、ニューロンの細胞膜に発現する外因性、pH感受性GFPタグ融合タンパク質の表面発現、輸送経路や人身売買の速度を決定するための生細胞イメージングと光退色技術の使用について説明します。

培養神経細胞における膜タンパク質の側方拡散とエキソサイトーシスは、蛍光回復と蛍光損失光退色を用いて評価

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

lateral-diffusion-exocytosis-membrane-proteins-cultured-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

83.0K ビュー.  University of Bristol. このレポートでは、ニューロンの細胞膜に発現する外因性、pH感受性GFPタグ融合タンパク質の表面発現、輸送経路や人身売買の速度を決定するための生細胞イメージングと光退色技術の使用について説明します。

ビデオ: Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

培養海馬ニューロンの樹状突起棘の蛍光タグ融合タンパク質の光退色後蛍光回復（FRAP）

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

神経科学

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP. A significant loss of &Delta;&Psi;m renders cells depleted of energy with subsequent death. Reactive oxygen species (ROS) are important signaling molecules, but their accumulation in pathological conditions leads to oxidative stress. The two major sources of ROS in cells are environmental toxins and the process of oxidative phosphorylation. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress have been implicated in the pathophysiology of many diseases; therefore, the ability to determine &Delta;&Psi;m and ROS can provide important clues about the physiological status of the cell and the function of the mitochondria. 
Several fluorescent probes (Rhodamine 123, TMRM, TMRE, JC-1) can be used to determine &Delta;&psi;m in a variety of cell types, and many fluorescence indicators (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H2DCF-DA) can be used to determine ROS. Nearly all of the available fluorescence probes used to assess &Delta;&Psi;m or ROS are single-wavelength indicators, which increase or decrease their fluorescence intensity proportional to a stimulus that increases or decreases the levels of &Delta;&Psi;m or ROS. Thus, it is imperative to measure the fluorescence intensity of these probes at the baseline level and after the application of a specific stimulus. This allows one to determine the percentage of change in fluorescence intensity between the baseline level and a stimulus. This change in fluorescence intensity reflects the change in relative levels of &Delta;&Psi;m or ROS. In this video, we demonstrate how to apply the fluorescence indicator, TMRM, in rat cortical neurons to determine the percentage change in TMRM fluorescence intensity between the baseline level and after applying FCCP, a mitochondrial uncoupler. The lower levels of TMRM fluorescence resulting from FCCP treatment reflect the depolarization of mitochondrial membrane potential. We also show how to apply the fluorescence probe H2DCF-DA to assess the level of ROS in cortical neurons, first at baseline and then after application of H2O2. This protocol (with minor modifications) can be also used to determine changes in &#x2206;&#x03A8;m and ROS in different cell types and in neurons isolated from other brain regions.

We demonstrate application of the fluorescence indicator, TMRM, in cortical neurons to determine the relative changes in TMRM fluorescence intensity before and after application of a specific stimulus. We also show application of the fluorescence probe H2DCF-DA to assess the relative level of reactive oxygen species in cortical neurons.

ライブラット皮質ニューロンのミトコンドリア膜電位と活性酸素種の定量

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

培養中枢神経系ニューロンの樹状突起スパイン形態の解析

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

FM染料を用いて培養小脳顆粒神経細胞のシナプス小胞プールの補充の定量分析

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs 4-6. Altered patterns of dendritic growth and plasticity are associated with impaired neurobehavioral function in experimental models 7, and are thought to contribute to clinical symptoms observed in both neurodevelopmental disorders 8-10 and neurodegenerative diseases 11-13. Such observations underscore the functional importance of precisely regulating dendritic morphology, and suggest that identifying mechanisms that control dendritic growth will not only advance understanding of how neuronal connectivity is regulated during normal development, but may also provide insight on novel therapeutic strategies for diverse neurological diseases.
Mechanistic studies of dendritic growth would be greatly facilitated by the availability of a model system that allows neurons to be experimentally switched from a state in which they do not extend dendrites to one in which they elaborate a dendritic arbor comparable to that of their in vivo counterparts. Primary cultures of sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rodents provide such a model. When cultured in defined medium in the absence of serum and ganglionic glial cells, sympathetic neurons extend a single process which is axonal, and this unipolar state persists for weeks to months in culture 14,15. However, the addition of either bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) 16,17 or Matrigel 18 to the culture medium triggers these neurons to extend multiple processes that meet the morphologic, biochemical and functional criteria for dendrites. Sympathetic neurons dissociated from the SCG of perinatal rodents and grown under defined conditions are a homogenous population of neurons 19 that respond uniformly to the dendrite-promoting activity of Matrigel, BMP-7 and other BMPs of the decapentaplegic (dpp) and 60A subfamilies 17,18,20,21. Importantly, Matrigel- and BMP-induced dendrite formation occurs in the absence of changes in cell survival or axonal growth 17,18.
Here, we describe how to set up dissociated cultures of sympathetic neurons derived from the SCG of perinatal rats so that they are responsive to the selective dendrite-promoting activity of Matrigel or BMPs.

We describe a protocol for using bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) or Matrigel to selectively induce dendritic growth in primary sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rats.

培養交感神経ニューロンの樹状成長を誘導する

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Co-analysis of Brain Structure and Function using fMRI and Diffusion-weighted Imaging

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when studying the brain, as the functional role that a brain area fulfills may be largely defined by its connections to other brain areas. In this report, we describe a novel, non-invasive approach for relating brain structure and function using magnetic resonance imaging (MRI). This approach, a combination of structural imaging of long-range fiber connections and functional imaging data, is illustrated in two distinct cognitive domains, visual attention and face perception. Structural imaging is performed with diffusion-weighted imaging (DWI) and fiber tractography, which track the diffusion of water molecules along white-matter fiber tracts in the brain (Figure 1). By visualizing these fiber tracts, we are able to investigate the long-range connective architecture of the brain. The results compare favorably with one of the most widely-used techniques in DWI, diffusion tensor imaging (DTI). DTI is unable to resolve complex configurations of fiber tracts, limiting its utility for constructing detailed, anatomically-informed models of brain function. In contrast, our analyses reproduce known neuroanatomy with precision and accuracy. This advantage is partly due to data acquisition procedures: while many DTI protocols measure diffusion in a small number of directions (e.g., 6 or 12), we employ a diffusion spectrum imaging (DSI)1, 2 protocol which assesses diffusion in 257 directions and at a range of magnetic gradient strengths. Moreover, DSI data allow us to use more sophisticated methods for reconstructing acquired data. In two experiments (visual attention and face perception), tractography reveals that co-active areas of the human brain are anatomically connected, supporting extant hypotheses that they form functional networks. DWI allows us to create a "circuit diagram" and reproduce it on an individual-subject basis, for the purpose of monitoring task-relevant brain activity in networks of interest.

We describe a novel approach for simultaneous analysis of brain function and structure using magnetic resonance imaging (MRI). We assess brain structure with high-resolution diffusion-weighted imaging and white-matter fiber tractography. Unlike standard structural MRI, these techniques allow us to directly relate anatomical connectivity to functional properties of brain networks.

fMRIと拡散強調画像を用いた脳の構造と機能の同時分析

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

イメージング初代培養マウス神経細胞における形質膜に受容体の挿入をpHluorinタグ付き

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of live neurons with a specific primary antibody raised against an extracellular portion of the protein. Given that receptors are trafficked to and from the surface, if cells are permeabilized after fixation then both cell-surface and internal protein will be detected by the same labeled secondary antibody. Here, we adapted a method used to study protein trafficking (&#8220;antibody feeding&#8221;) to differentially label protein that had been internalized by endocytosis during the antibody incubation step and protein that either remained on the cell surface or was trafficked to the surface during this period. The ability to distinguish these two pools of protein was made possible through the incorporation of an overnight blocking step with highly-concentrated unlabeled secondary antibody after an initial incubation of unpermeabilized neurons with a fluorescently-labeled secondary antibody. After the blocking step, permeabilization of the neurons allowed detection of the internalized pool with a fluorescent secondary antibody labeled with a different fluorophore. Using this technique we were able to obtain important information about the subcellular location of this putative receptor, revealing that it was, indeed, trafficked to the cell-surface in neurons. This technique is broadly applicable to a range of cell types and cell-surface proteins, providing a suitable antibody to an extracellular epitope is available.

We describe a method to label protein on the surface of living neurons using a specific polyclonal antibody to extracellular epitopes. Protein bound by the antibody on the cell surface and subsequently internalized via endocytosis can be distinguished from protein remaining on, or trafficked to, the surface during the incubation.

ライブ培養神経細胞の抗体供給した後細胞表面および内在化タンパク質の異なる標識化

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in the late 1960&#8217;s, proteins associated with the synaptic plasma membrane can be isolated by ultracentrifugation on a sucrose density gradient. Once synaptic membranes are isolated, the macromolecular complex known as the post-synaptic density can be subsequently isolated due to its detergent insolubility. The techniques used to isolate synaptic plasma membranes and post-synaptic density proteins remain essentially the same after 40 years, and are widely used in current neuroscience research. This article details the fractionation of proteins associated with the synaptic plasma membrane and post-synaptic density using a discontinuous sucrose gradient. Resulting protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

This article details the enrichment of proteins associated with the synaptic plasma membrane by ultracentrifugation on a discontinuous sucrose gradient. The subsequent preparation of post-synaptic density proteins is also described. Protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

不連続ショ糖勾配を用いてシナプス形質膜とシナプス後肥厚タンパク質の調製

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible are badly known. Excitotoxicity, a process believed to contribute to neuron damage induced by both insults, is mediated by activation of glutamate receptors that promotes Ca2+ influx and mitochondrial Ca2+ overload. A substantial change in intracellular Ca2+ homeostasis or remodeling of intracellular Ca2+ homeostasis may favor neuron damage in old neurons. For investigating Ca2+ remodeling in aging we have used live cell imaging in long-term cultures of rat hippocampal neurons that resemble in some aspects aged neurons in vivo. For this end, hippocampal cells are, in first place, freshly dispersed from new born rat hippocampi and plated on poli-D-lysine coated, glass coverslips. Then cultures are kept in controlled media for several days or several weeks for investigating young and old neurons, respectively. Second, cultured neurons are loaded with fura2 and subjected to measurements of cytosolic Ca2+ concentration using digital fluorescence ratio imaging. Third, cultured neurons are transfected with plasmids expressing a tandem of low-affinity aequorin and GFP targeted to mitochondria. After 24 hr, aequorin inside cells is reconstituted with coelenterazine and neurons are subjected to bioluminescence imaging for monitoring of mitochondrial Ca2+ concentration. This three-step procedure allows the monitoring of cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to relevant stimuli as for example the glutamate receptor agonist NMDA and compare whether these and other responses are influenced by aging. This procedure may yield new insights as to how aging influence cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to selected stimuli as well as the testing of selected drugs aimed at preventing neuron cell death in age-related diseases.

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

細胞内のCaの蛍光と生物発光イメージング<sup&gt; 2+</sup&gt;高齢者における海馬ニューロン

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...