이 작품에 대한 재정 지원은 SIUC의 국립 과학 재단 (National Science Foundation), 건강의 국립 연구소 (NIH), 재료 기술 센터 (MTC)와 ORDA 통해 제공되었다. 우리는 FE-SEM의 구입에 대한 보조금 (CHE-0959568)에 대한 NSF 감사드립니다. 우리는 도움이 토론에 대한 교수 매튜 McCarroll 감사드립니다. 줄리아 Reyes는 그녀의 장학금 및 재정 지원을 COLCIENCIAS, 콜롬비아 기관 및 Universidad Pedagogica Y Tecnologica 드 콜롬비아를 감사합니다.

PDA Liposomes 4,5,6의 A. 합성 및 특성 주 1 : 모든 실험 단계에 걸쳐 모든 컨테이너에 알루미늄 호일 포장을 사용하여 빛의 PDA 솔루션을 보호 할 수 있습니다. 주 2 : 리포좀 솔루션의 두 가지 세트 (B와 C)은 다음 절차를 준비했다 A (PDA liposomes의 합성 및 특성). 1. N-hydroxysuccinimide Diacteylene의 합성 (NHS-PCDA) <ol><li> liposomes를 준비하려면 필수 요소 PCDA-NHS가 필요합니다. 우리는 다음 절차를 사용하여 PCDA-NHS를 합성했습니다 </li><li> (3 - - (디메틸 아미노) propyl)-3-ethylcarbodiimide 하이드로 클로라이드 (0.144 g, 0.713 mmol 10,12 - pentacosadiynoic 산 (PCDA) (0.267 g, 0.713 mmol), N-hydroxysuccinimide (0.0914 g, 0.786 mmol)과 1을 추가 ) 건조 CH ​​2 망할 CIA 2 (20 ML). </li><li> 2 시간 동안 실온에서 솔루션을 저어. </li><li> 조심스럽게 연구를 사용하여 용매를 제거otary 증발기는 건조 박막를 얻을 수 있습니다. </li><li> 디 에틸 에테르 (25 ML)와 물 (25 ML) 3 번과 잔여 물을 추출 분리 유입 경로를 사용합니다. </li><li> 30 분 동안 MgSO 4 (1.0 g)와 유기 층을 말린다. 필터 및 흰색 고체 분말을 (0.24 g,&gt; 90 %) 얻기 위해 회전 증발하여 용매를 제거합니다. </li><li> 핵 자기 공명 (NMR)에서 최종 화합물을 분석합니다. </li><li> 1 H NMR (300 MHz의, DMSO), δ (ppm으로) : 0.893 (t, 3H), 1.268 (m, 26H), 1.512 (m, 4H), 1.754 (m, 2H), 2.252 (t, 4H), 2.365 (m, 1H), 2.610 (m, 1H), 2.842 (S, 2H). </li></ol> 2. 리포좀 준비 5,6,7 <ol><li> PCDA-NHS : 1,2 - dimyristoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (DMPC) :: 8 : 1 : dichloromethane 1 20 년 ML PCDA를 해산. </li><li> 응집체를 제거하는 필터 종이 솔루션을 필터링 할 수 있습니다. </li><li> 단량체의 박막을 얻을 수 있도록 완전히 용매를 증발. </li><li> VAC 아래 박막은 하루 아침에 건조uum. </li><li> 원하는 농도의 리포좀 솔루션 (0.65-1 MM)를하기 위해 탈 이온수 (50 ML)와 영화 수화물. </li><li> 76 프로브 sonicator로 결과 정지 Sonicate ° C ~ 18 분에. </li><li> 조심스럽게 지방질 집계를 제거하는 종이 필터를 통해 솔루션을 통과 </li><li> 4 단량체의 자기 조립을 홍보 할 ° C 하룻밤에 솔루션을 냉각. 최종 솔루션은 광학 명확해야합니다. </li><li> 공기 펜 레이 UV 소스를 (4.5 MW / cm 2)를 사용 ~ 2 분을위한 UV 방사선의 254 nm의와 조사에 의해 자기 조립 diacetylene의 단량체를 (리포좀) 중합. </li><li> 리포좀 솔루션은 최소 2 주 동안 실온에서 안정. 때 냉장 솔루션은보다 안정적이었다. </li></ol> Rhodamine 태그 소 혈청 알부민 (BSA-RH) 수정 PCDA의 liposomes의 B. 준비 1. 리포좀 표면에 BSA-RH의 바인딩 <ol><li> PBS 부에 BSA-RH를 해산ffer은 (이온 농도가 pH를 7.2, 0.01M이었다) BSA-Rhodamine 솔루션의 1.2 μm의 최종 농도를 확인합니다. </li><li> 실온에서 단계 A.2. (위 참조)에서 준비 리포좀 솔루션의 10 ML에 BSA-Rhodamine 2 ML (1.2 μM)를 추가합니다. </li><li> 단백질의 라이신 잔기의 NHS 그룹에 의해 활성화 카르 복실 산에 아민 그룹의 바인딩을위한 고전 반응은 (그림 2의 반응 방식) 다음되었습니다. NHS-PCDA은 NHS-아민 반응을 (그림 2, 2 단계)를 사용하여 liposomes와 covalently 구속력이 단백질 분자에 대해 (그림 2 단계 중 1 단계) 설계되었습니다. NHS는 전진 방향에있는 아민 - 카르 복실 산 반응을 유도하는 훌륭한 출발 요원입니다. 적절한 조건에서이 반응의 수율은 양적해야합니다. </li><li> 무료 BSA-RH의 제거 : deionized w에서 : 스펙트럼 / 포 바이오 셀룰로오스 에스터 (CE) 멤브레인을 (100,000 MW C O) 만끽15 분에 ater. 이 멤브레인은의 투석에 사용되는 탈 이온수에 BSA-Rhodamine (분자량 66,000 ~ 다) unreacted. </li><li> 투석 막에 솔루션을 자세히 전송합니다. </li><li> 투석하는 동안 2 시간의 물, 8 시간, 14 시간, 24 시간 그리고 36 시간을 변경합니다. </li><li> 알루미늄 호일로 덮여 병에 최종 솔루션을 수집합니다. </li></ol> 의 C. 준비 SR은 - 디아민 및 Liposomes에게 비오틴 태그 1. 대신 단계 2.1에서 DMPC를 사용, 우리는 비오틴 태그 - (을 사용합니다 1,2 - dioleoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (비오틴 - 마약을). <ol><li> 2.9에 2.2을 통해 모든 단계를 따르십시오. </li><li> 대신 BSA-RH의 단계 B에서 (SR-디아민) 태그 Sulphorhodamine을 디아민 사용합니다. </li><li> B. 모든 추가 단계를 수행 </li><li> 이 준비 liposomes가 비오틴을 포함하고 표면에 SR은 - 디아민. 이후 단계는 한 가지 예외가있는 A와 B (위 참조)과 유사했다 : streptavidin이 soluti에 추가되었습니다의 변화를 통해 비오틴 - streptavidin 상호 작용을 조사하기에하는 것은 효율성을 초조해. </li></ol> D. 대표 결과 <img alt="제목 그림" src="/files/ftp_upload/3805/3805figtitle.jpg" /> 제목 그림.의 반응을 설명하는 만화와는 리포좀 표면에서 발생하는 프로세스를 (단계 B에 따라 작성) 초조해. 사용 liposomes에 단백질 첨부 파일의 A. 모니터링은 1 안달 의 모니터링은 Rhodamine과 단계 B.에 준비 PDA liposomes 사이에 안달 BSA-RH의 흥분과 방출 스펙트럼과 PDA의 흡수 스펙트럼은 (그림 3A) 이동됩니다. 우리는 명확하게 볼 수 PDA의 흡수 스펙트럼과 BSA-RH 중복의 방출 스펙트럼. 이 안달 메커니즘 공명 요구 사항을 충족시킵니다. 중합 전후 BSA-Rhodamine 태그 liposomes는 UV-V로 분석 하였다하고 형광 분광법. 고립 된 기증자와 수용체를 들어, 효율성은 기증자 - 수용체 거리 (R) 및 J 1 (J-값)에 크게 의존 초조해. 방출의 담금질로 인해 photopolymerization 후 블루 PDA의 전자 흡수 스펙트럼의 모양으로 인해 rhodamine 및 PDA 사이에 초조해의 (그림 3B) 관찰된다. 우리의 경우에는 효율성이 unpolymerized liposomes 및 Rhodamine를위한 0 ~ 걱정 때문에 J 보이는 지역 unpolymerized liposomes = 0. 우리는 자신의 표면에 NHS를 포함하지 않은 유일한 PDA liposomes와 유사한 실험을 수행했습니다. 이러한 경우에는 BSA-RH는 liposomes의 표면에 태그되지 않았습니다. 이 경우 rhodamine 및 PDA (R 평균) 사이의 평균 거리가 포스터 반경 (R 0 = 2.8 nm의)보다 훨씬 큽니다. 따라서, 우리는 형광 강도에 큰 감소를 관찰 없습니다. 이 관찰런던 심포니 오케스트라 때 R은 &lt;2.8 nm의 형광 담금질을 지배입니다하는 것이 좋습니다. J와 R 0 값은 다음 수식을 사용하여 계산되었습니다 [1] J (λ) = ∫ F D (λ) ε A (λ) λ 4 dλ R 0 = 0.211 [K 2 N -4 Q D J (λ)] 육분의 일 푸른 PDA의 흡광 계수 (ε)은 -1 이전 streptavidin의 추가에 ~ 2000-10000 M -1 cm의 범위에 있습니다. 푸른 PDA의 흡광 계수는 사진 중합 조건에 따라 달라집니다. [2] 예를 들어, ε 값은 더 이상 시간을 polymerized 된 솔루션에 대한 더 큰 것입니다. 또한, diacetylene의 단량체의 자기 조립도 ε 값에 영향을 미칠 수 있습니다. J calculations이 변경 고려, 그들은 비오틴 - streptavidin 분자 상호 작용으로 인해 PDA 흡광 계수의 변화를 반영합니다. J 값이 실험 PDA 흡수와 SR-101 방출 데이터를 사용하여 계산됩니다. J 값의 변화는이 솔루션 (그림 4C)에 streptavidin의 추가에 따라 PDA의 전자 흡수 스펙트럼의 변화로 인해 수 있습니다. J 값의 단위는 M -1 cm -1 nm의 4입니다. 의 B. 모니터링은 비오틴 태그 리포좀 솔루션에 streptavidin의 추가와 함께 안달 주 1 : Rhodamine 이상 단계 C에서 준비 PDA liposomes 사이에 초조해의 모니터링. Sulphorhodamine 태그의 흥분과 방출 스펙트럼은 디아민 (SR-디아민) 및 PDA의 흡수 스펙트럼 (그림 4A) 이동합니다. Unpolymerized 및 polymerized 비오틴 태그 liposomes는 UV-VIS 사용 분석 하였다및 형광 분광법. rhodamine (SR-101)의 방출은 걱정 인해 방출 담금질을 제안 중합 (그림 4B) 이후 약 45 % 감소. 리포좀 솔루션 2 ML에 streptavidin 용액 40 μl aliquots (1 μM)를 추가합니다. 솔루션 streptavidin의 추가와 함께, J 값의 변화 (그림 4C) 관찰된다. 비오틴은 streptavidin, PDA 리포좀 (그림 1 ~ 645 nm의 중심)의 푸른 피크 강도에 바인딩으로 (F igure 1S) 관찰 540 나노 미터에서 흡수 피크의 증가 반면, 감소되었습니다. 그림 4D는 걱정의 변화를 보여줍니다 효율. streptavidin 농도의 증가와 함께 감소 걱정 효율성 또한 예측과 일치합니다. streptavidin의 매 40 μl 나누어지는 첨가 한 후 SR 방출을 녹화합니다. 우리는 strept을 추가 한 후 rhodamine 방출의 꾸준한 증가를 관찰아비딘 (그림 5). rhodamine 방출이 증가 비오틴 - streptavidin 상호 작용에 따라 sulphorhodamine 방출 스펙트럼과 PDA 흡광도 스펙트럼의 J 값의 감소로 인한 것입니다. 분자 수준에서 비오틴 - streptavidin 상호 작용은 더 thermodynamically 안정 붉은 PDA 양식 2 블루 PDA 형태의 감소에 결과 PDA의 효과적인 활용 길이의 미묘한 변화로 이어집니다. 이 J 값의 변화의 기초이다. 흥미롭게도, PDA 리포좀에 covalently 또는 비 covalently 보세 비오틴에 대한 분자 상호 작용의 미묘한 차이는 우리의 감지 검정 4를 사용 탐색 할 수 있습니다. 우리는 또한 제어 실험을 수행하고 streptavidin-비오틴 시스템에 대한 그와 같은 실험 조건 하에서 제어 샘플의 방출을 감시하고 있습니다. 제어 실험으로 구성되어, 자신의 (1)에 포함 된 리포좀 솔루션은 비오틴표면은 동일한 볼륨과 집중의 버퍼 솔루션을 추가 된 및 (2)의 표면에 비오틴 수용체가없는 리포좀 솔루션은 동일한 볼륨과 집중의 streptavidin을 추가했다. streptavidin을 추가 후 비오틴 태그 리포좀 솔루션의 강도가 향상된 강도를 보여 주었다하지만 제어 실험 리포좀 솔루션의 강도가 (예를 들어, 그림 2S를 참조하십시오), 반면에,이 방출 강도에 감소 전시. 이것은 솔루션의 희석에 따라 결정됩니다. 이 실험은 명확 솔루션의 향상된 방출 특정 분자 상호 작용에 의한 있다고 지적했다. rhodamine 및 PDA 쌍에 대한 포스터의 반경이 (R 0) (eq.2가) ~ 2.80 나노 미터로 계산됩니다. 이 연구는 2.80 nm의 경우 절연 PDA-rhodamine 쌍을 위해 흥분 상태 rhodamine 분자의 50 %가 PDA로 전송 자신의 에너지를 가지고 것을 의미합니다. 우리 obs<html> 비오틴은 covalently PDA 백본에 부착 될 때 방출 증가 liposomes에 비 covalently 보세 비오틴보다 2 ~ 3 배 더 큰이라고 4.이 결과는 강력하게 제안 시스템이 상호 작용의 미묘한 차이를 구별에 민감하는 것이 좋습니다 erved 변환기에서 (비오틴과 리포좀 이중층 사이 링커) liposomes에 부착 covalently 및 비 covalently 보세 수용체 때문입니다. 단백질 상호 작용의 분광 광도계, 실시간 모니터링 (밀리 초에서 두 번째로 규모까지) (UV-VIS 분광의)의 스캔 및 데이터 수집 기능에 따라이 감지 시스템으로 가능합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig1.jpg" /> 파란색과 빨간색 PDA 솔루션의 그림 1. 흡수 스펙트럼. (삽​​입) 광학 micrographs은 디지털 카메라로 촬영. g &quot;/&gt; 그림 2. PCDA - NHS 합성 (1 단계)에 대한 반응 방식. 단백질의 아민 치환체 (2 단계)에 PCDA-NHS의 반응. 2 단계 PCDA 단량체의 카르 복실 산으로 단백질의 라이신 잔류의 구속의 기초이다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3805/3805fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 3A" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig3A.jpg" /> 그림 3A. 관찰에 변경이 효율성이 PDA의 흡수 스펙트럼의 변화로 인해 초조해. 중합 전에 BSA-RH 방출과 PDA 흡수 사이하지만 걱정에 대한 요구 사항입니다 BSA-RH 방출과 중합 PDA 흡수 중복 이후로 중복이 없습니다. Rhodamine 기증자가 (빨간색)이며, polymerized PDA liposomes는 수용체 (파란색) 역​​할을합니다. <img alt="그림 3B" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig3B.jpg" /> 그림3B. 전에 (파란색)과 PCDA 중합 (적색) 후 BSA-RH 태그 liposomes의 형광 스펙트럼. rhodamine 방출의 큰 감소는 rhodamine와 PDA 사이에 걱정 때문에 관찰되었다. <img alt="그림 4A" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4A.jpg" /> .. 그림 4A 스펙트럼 오버랩 (J) PDA (파란색 또는 빨간색) 흡수 스펙트럼과 Sulphorhodamine 방출 스펙트럼 (오렌지)에 대한 변경도 4a는 극한 조건의 대표적인 스펙트럼이다; streptavidin의 초과가 솔루션에 추가되었을 때 그입니다. 그림 4a는 streptavidin의 초과의 추가에 따라 거의 완전한 블루 - 투 - 붉은 PDA 변화를 보여줍니다. 그것은 명확 J (스펙트럼 오버랩)는 PDA 흡수 스펙트럼의 청색 변화와 증가하는 볼 수있다 <img alt="그림 4B" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4B.jpg" /> 그림 4B. 형광 스펙트럼 전 (파란색)과 이후 (RED) 리포좀 중합. <img alt="그림 4C" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4C.jpg" /> 그림 4C 안달을위한 조건 :. 기증자 (sulphorhodamine)와 리포좀 솔루션에 streptavidin 추가하면 수용체 (PDA) 사이 J 변경. <img alt="그림 4D" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4D.jpg" /> 그림 4D는. 기증자 (sulphorhodamine)와 리포좀 솔루션에 streptavidin 추가하면 수용체 (PDA) 사이의 효율 변화를 안달. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig5.jpg" /> 그림 5. PDA 리포좀 솔루션에 streptavidin의 aliquots를 추가 한 후 Rhodamine 방출 스펙트럼. 삽입은 SR-101 스펙트럼의 방출 변화 확대를 보여줍니다.

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

우리는 NHS-아민 반응을 사용하여 리포좀 표면에 단백질의 라이신 잔기의 선택적 바인딩을 수행했습니다. 이 기반 방법은 리포좀 표면에 바인딩 비오틴 - streptavidin을 구속하며 단백질 (BSA)의 실시간 모니터링을하고 할 수 있습니다 초조해. 비슷한 절차는 자신의 선택 수용체와 다양한 단백질 상호 작용의 바인딩 역학을 공부하고 적용 할 수 있습니다. fluorophores의 스펙트럼 특성에 따라 J 값의</e...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 10,12 - pentacosadiynoic 산 (PCDA) </td><td> GFS 화학 물질 </td><td> 3261 </td><td> 민감한 빛 </td></tr><tr><td> N-hydroxysuccinimide (NHS) </td><td> Acros의 유기물 </td><td> 157270250 </td><td> 민감한 수분 </td></tr><tr><td> 1 - (3 - (디메틸 아미노) propyl)-3-ethylcarbodiimide 히드로 클로라이드 (EDC) </td><td> 화학 - impex 국제 </td><td> 00,050 </td><td></td></tr><tr><td> 1,2 - dimyristoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (DMPC) </td><td> 벤티 폴라 지질 </td><td> 850345P </td><td></td></tr><tr><td> Rhodamine 태그 소 경음 ... 알부민 (BSA-RH) </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> A4537 </td><td></td></tr><tr><td> (1,2 - dioleoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (비오틴 - 마약) </td><td> 벤티 폴라 지질 </td><td> 870282 </td><td></td></tr></tbody></table>

real-time monitoring of ligand-receptor interactions with fluorescence resonance energy transfer

걱정은 장거리 쌍극자 - 쌍극자 상호 작용 1 일까지 지상 상태 수용체 분자에 흥분 기증자 분자에서 에너지의 변환이 아닌 radiatively이된다 과정입니다. analyte는 PDA 2,3,4,7에 연결 수용체와 상호 작용 한 후 PDA의 UV-VIS 전자 흡수 스펙트럼 (그림 1)에서 블루 변화 : 현재 감지 분석에서 우리는 PDA의 흥미로운 속성을 사용합니다. PDA 흡수 스펙트럼에있는이 변화는 걱정 효율성의 변화로 연결 PDA (수용체)와 rhodamine (기증자) 사이의 스펙트럼 중첩의 변화 (J)를 제공합니다. 따라서, analyte (리간드)와 수용체 사이의 상호 작용은 기증자 fluorophores 및 PDA 사이에 안달을 통해 감지된다. 특히, 우리는 모델 단백질 분자 streptavidin의 감지를 보여줍니다. 우리는 또한이있는 소 혈청 알부민 (BSA)에 리포좀 표면의 공유 결합 - 바인딩 메커니즘을 초조해 보여줍니다. t 사이의 이러한 상호 작용그 이중층 liposomes과 단백질 분자는 실시간으로 감지 할 수 있습니다. 제안 된 방법은 작은 화학 및 대형 생화학 분자를 감​​지하는 일반적인 방법입니다. 형광은 비색법보다 본질적으로 더 민감하기 때문에, 분석의 검출 한계는 하위 nanomolar 범위 또는 8 이하인 수 있습니다. 또한, PDA는 걱정의 보편적 수용체의 역할을 할 수있는 여러 센서가 기증자와 PDA liposomes의 표면에 부착 다른 수용체와 기능화 PDA (수용체)로 개발 될 수 있다는 것을 의미합니다.

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Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

우리는 복합 폴리머 polydiacetylene (PDA)와 형광 분자의 감지 용 PDA liposomes의 표면에 부착 사이에 초조해 보여줍니다. PDA liposomes은 프로브로 사용되는 분자에 대한 자신의 표면에 수용체 분자가 포함되어 있습니다. 리간드 - 수용체 상호 작용이 감지 메커니즘의 기초 형광와 PDA 사이의 걱정 효율성의 변화에​​ 연결되어 있습니다.

형광 공명 에너지 전송과 리간드 - 수용체 상호 작용의 실시간 모니터링

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

real-time-monitoring-ligand-receptor-interactions-with-fluorescence

Research

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Biology

14.3K 조회수.  Southern Illinois University. 우리는 복합 폴리머 polydiacetylene (PDA)와 형광 분자의 감지 용 PDA liposomes의 표면에 부착 사이에 초조해 보여줍니다. PDA liposomes은 프로브로 사용되는 분자에 대한 자신의 표면에 수용체 분자가 포함되어 있습니다. 리간드 - 수용체 상호 작용이 감지 메커니즘의 기초 형광와 PDA 사이의 걱정 효율성의 변화에​​ 연결되어 있습니다.

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Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

연구

생물학

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

갑각류와 장기 치명적인 독성 시험 Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

Unimolecular 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 현미경을 안달

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Mammalian cell-based in vitro assays have been widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but have been limited due to the high monetary and time costs of parallel sample preparation that are necessitated due to the destructive nature of firefly luciferase-based screening methods. This video describes the utilization of autonomously bioluminescent mammalian cells, which do not require the destructive addition of a luciferin substrate, as an inexpensive and facile method for monitoring the cytotoxic effects of a compound of interest. Mammalian cells stably expressing the full bacterial bioluminescence (luxCDABEfrp) gene cassette autonomously produce an optical signal that peaks at 490 nm without the addition of an expensive and possibly interfering luciferin substrate, excitation by an external energy source, or destruction of the sample that is traditionally performed during optical imaging procedures. This independence from external stimulation places the burden for maintaining the bioluminescent reaction solely on the cell, meaning that the resultant signal is only detected during active metabolism. This characteristic makes the lux-expressing cell line an excellent candidate for use as a biosentinel against cytotoxic effects because changes in bioluminescent production are indicative of adverse effects on cellular growth and metabolism. Similarly, the autonomous nature and lack of required sample destruction permits repeated imaging of the same sample in real-time throughout the period of toxicant exposure and can be performed across multiple samples using existing imaging equipment in an automated fashion.

Mammalian cells expressing the bacterial bioluminescence gene cassette (lux) produce light autonomously. The resulting bioluminescent dynamics upon chemical exposure have been demonstrated to reflect the treatment effects on cellular growth and metabolism, making these cells an inexpensive, continuous, real-time toxicity screening tool that can easily be adapted for high-throughput automation.

세포 독성의 지속적인 실시간 모니터링을위한 자율적으로 바이오 루미 네 센트 포유 동물 세포

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

생물 발광 공명 에너지 전달을 이용하여 살아있는 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

막 단백질의 실시간 측정 : 수용체 상호 작용은 표면 플라즈몬 공명 (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

프로브 기반의 실시간 PCR은 마이크로 RNA의 정량 측정을위한 접근 방법

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

형광 표지 된 나노 입자를 사용하여 쥐, 인간과 돼지 유래의 살아있는 세포에서 세포 내 유전자 발현의 검출

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

가변 각도 표면 형광 현미경으로 식물 세포 표면 역학의 실시간 영상

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon its autophosphorylation on Thr288. AURKA abundance peaks in mitosis, where it controls the stability and the fidelity of the mitotic spindle, and the overall efficiency of mitosis. Although well characterized at the structural level, a consistent monitoring of the activation of AURKA throughout the cell cycle is lacking. A possible solution consists in using genetically-encoded F&#246;rster&#8217;s Resonance Energy Transfer (FRET) biosensors to gain insight into the autophosphorylation of AURKA with sufficient spatiotemporal resolution. Here, we describe a protocol to engineer FRET biosensors detecting Thr288 autophosphorylation, and how to follow this modification during mitosis. First, we provide an overview of possible donor/acceptor FRET pairs, and we show possible cloning and insertion methods of AURKA FRET biosensors in mammalian cells. Then, we provide a step-by-step analysis for rapid FRET measurements by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) on a custom-built setup. However, this protocol is also applicable to alternative commercial solutions available. We conclude by considering the most appropriate FRET controls for an AURKA-based biosensor, and by highlighting potential future improvements to further increase the sensitivity of this tool.

The activation of the multifunctional Ser/Thr kinase AURKA is hallmarked by its autophosphorylation on Thr288. Fluorescent probes relying on FRET can discriminate between its inactive and activated states. Here, we illustrate some strategies for probe engineering, together with a rapid FRET protocol to follow the kinase activation throughout mitosis.

라이브 셀의 형성 FRET 바이오 센서를 사용하여 오로라 키나아제 활성화의 실시간 모니터링

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...