우리의 방법은 단백질 복합 체 형성의 운동학을 연구하는 데 도움이됩니다. 그것은 단백질 복합체가 얼마나 단단한지, 그리고 단백질 복합체 형성이 그밖 단백질에 의해 방해되는 경우에 기술합니다. 이 기술은 리포터로서 형광을 사용하여 정량적 방법으로 단백질 상호 작용을 연구할 수 있게 해주며, 우리의 분석법은 실시간으로 단백질 복합체의 연관성과 분리를 모니터링할 수 있습니다.
먼저 단백질 데이터베이스에서 COL1 CAND1 복합체에 대한 데이터부터 시작하는 FRET 분석방법을 설계합니다. PyMOL에서 구조를 로드한 다음 마법사 메뉴로 이동하여 측정 기능을 사용하여 CAND1의 첫 번째 아미노산과 COL1의 마지막 아미노산 사이의 거리를 추정합니다. 그런 다음 온라인 스펙트럼 뷰어를 로드하고 7-아미노-4-메틸쿠마린과 FlASH의 흥분 및 방출 스펙트럼을 동시에 볼 수 있습니다.
AMC는 FRET 기증자이며 FlASH는 FRET 수락자입니다. 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 따라 다음하여 FRET 기증자 단백질로 세포를 준비합니다. 이어서, COL1 sortase RBX1 복합체를 발현하는 E.Coli 세포의 펠릿에 50밀리리터의 리시스 버퍼를 먼저 추가하여 COL1 sortase RBX1 복합체를 정화한다.
50%의 진폭으로 초음파 처리로 얼음에 세포를 얼음으로 얼음. 3분 동안 전원을 번갈아 가며 1초 가시면 시료의 과열을 방지합니다. 생성된 셀 리세이트를 50밀리리터 원심분리 튜브로 옮기고 45분 동안 25, 000배 g에서 원심분리로 세포 이물질을 제거합니다.
그런 다음, 글루타티온 구슬의 5 밀리리터에 상체를 추가하고 세포 용해를 취소섭씨 4도에서 배양. 인큐베이션에 따라 비드 용액 혼합물을 섭씨 4도에서 2분 동안 1, 500회 g에서 원심분리합니다. 그런 다음 상체를 제거합니다.
다음으로, 비드를 프로테아제 억제제가 없는 용해 완충제 5밀리리터로 씻는다. 솔루션을 원심분리한 후 상체를 제거합니다. 이제 세척된 비드에 3밀리리터의 리시스 버퍼를 추가하고 비드 슬러리를 빈 열로 옮겨 넣습니다.
새 컬럼에 5밀리리터의 용출 버퍼를 추가한 다음 컬럼을 10분 동안 배양한 다음 용출액을 수집합니다. 다음으로, 글루타티온 구슬에서 용액에 밀리리터 당 5 밀리그램에 200 마이크로리터의 혈소판을 추가합니다. 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양한 후 단백질 샘플을 완충 A.Load로 3배 희석하여 단백질 샘플을 완충A로 로드하여 분당 5밀리리터제로 양화환 교환 크로마토그래피 컬럼을 평형화한다.
그런 다음 완충 A에 버퍼 B의 0~50%의 그라데이션을 추가하여 분당 1밀리리터의 유량으로 단백질을 엘로우게 한다. 다음으로, FRET 기증자 단백질을 함유하는 용출 분획을 풀링하고 30킬로달톤 차단을 가진 초여골 막을 사용하여 2점 5 밀리리터로 농축합니다. 지금, 7-amino-4-메틸루마린을 탈염 컬럼을 사용하여 오테아제 버퍼로 FRET 기증자 단백질 샘플의 버퍼를 먼저 변경하여 분류 매개 트랜스펩티션을 통해 COL1의 c-terminus에 추가한다.
이를 위해 먼저 25밀리리터의 분류 버퍼로 탈염 열을 평형화합니다. 그런 다음 FRET 기증자 단백질 용액의 2점 5밀리리터를 컬럼에 적재하고 흐름을 버립니다. 다음으로, 시료를 3점 5밀리리터의 분류 버퍼로 엘테우하고 흐름을 수집한다.
용루액의 900 마이크로리터에서 600 마이크로몰라 정제 소분류 A 용액의 100 마이크로리터와 25 밀리머 GGGG-AMC 펩타이드의 10 마이크로리터를 추가합니다. 밤새 어둠 속에서 30°C의 반응 혼합물을 배양하여 COL1-AMC-RBX1을 생성합니다. 이제 모든 샘플을 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 로드하고 버퍼의 열 볼륨의 5배의 1포인트로 엘ute합니다.
결국, COL1-AMC-RBX1을 포함하는 용출 분획을 풀링합니다. FRET 수락단백질을 준비하기 위해 텍스트 프로토콜을 따라가십시오. 많은 단계는 FRET 기증자 단백질 제제와 유사합니다.
완료되면 FlASH CAND1 솔루션을 준비하십시오. 먼저 새로 준비된 테트라-시스-CAND1 솔루션의 50마이크로리터에 FlASH 용액의 마이크로리터 1개를 추가합니다. 결합된 용액을 잘 혼합하고 FlASH CAND1 용액을 형성하기 위해 1~2시간 동안 어둠 속에서 실온에서 혼합물을 배양합니다.
FRET 버퍼의 300 마이크로리터에서 COL1-AMC-RBX1을 최종 농도 70 나노몰러에 추가하고 용액을 큐벳으로 옮킨다. 플루오리오미터의 샘플 홀더에 큐벳을 놓습니다. 350 나노미터 흥분 광으로 샘플을 흥분시키고 한 나노 미터 단위로 400 ~ 600 나노미터의 방출 신호를 스캔합니다.
그런 다음 FRET 버퍼의 300 마이크로 리터에서 COL1-AMC-RBX1및 FlASH-CAND1을 70 나노몰러의 최종 농도에 모두 추가합니다. 350 나노미터 흥분 광으로 샘플을 흥분시키고 한 나노 미터 단위로 400-600 나노미터에서 방출 신호를 스캔합니다. 350 나노미터에서 발산 광을 설정하고 450 나노미터 방출 광이 통과하고 500 ~ 650 나노 미터 방출 광을 차단 할 수있는 밴드 패스 필터를 사용합니다.
충전 위치에 샘플 밸브를 사용하면 물로 채워진 3 밀리리터 주사기를 연결합니다. 그런 다음 시료 주사기를 여러 번 위아래로 움직여 물로 두 개의 시료 주사기를 세척하여 완료되면 물을 버립니다. 다음으로 FRET 버퍼로 채워진 3밀리리터 주사기를 연결합니다.
샘플 주사기를 여러 번 위아래로 움직여 완료되면 물을 버리면 FRET 버퍼로 두 개의 샘플 주사기를 세척합니다. 이제 3 밀리리터 주사기를 연결하고 첫 번째 샘플 주사기 인 주사기 A를 FRET 버퍼에 100 나노 몰러 COL1-AMC-RBX1로 로드합니다. 그런 다음 시료 밸브를 드라이브 위치로 돌리고, 3 밀리리터 주사기를 주사기 B에 연결하고 FRET 버퍼에서 FlASH CAND1의 100 나노 몰러로 주사기 B를 적재하고 밸브를 드라이브 위치로 돌립니다.
소프트웨어에서 획득하는 제어판을 열고 60초 동안 COL1-AMC의 방출을 기록합니다. 그런 다음 한 번의 촬영을 합니다. 각 샷에서 시간 동안 측정된 형광 신호의 감소와 단일 지수 곡선에 맞게 조정합니다.
이전에 표시된 대로 시스템을 세척한 다음 FRET 버퍼에 100 나노몰러 COL1-AMC-RBX1 및 100 나노몰러 FlASH CAND1의 용액을 주사기 A.Connect로 설정하여 충전 위치에 있는 동안 시스템에 연결한 다음 시료 밸브를 드라이브 위치로 돌립니다. 그런 다음 Skp1-Skp2의 솔루션을 주사기 B.Connect에 로드하여 채우기 위치에 있는 동안 시스템에 연결합니다. 주사기 B를 로드한 다음 샘플을 드라이브 위치로 돌립니다.
소프트웨어에서 제어판을 획득하고 엽니다. 30초 동안 COL1-AMC의 방출을 기록하는 프로그램을 설정합니다. 그런 다음 한 번의 촬영을 합니다.
형광 신호는 주사기 A 및 주사기 B.70 나노몰러각각의 COL1-AMC 및 FlASH CAND1이 FRET를 생성하기 위해 혼합되었을 때, 배출 스펙트럼에 2개의 방출 피크가 존재했을 때 시간이 지남에 따라 증가합니다. 그리고 COL1-AMC의 피크가 낮아졌고 FlASH CAND1의 피크가 높아졌습니다. 전체 길이 CAND1이 FRET에 사용되었을 때 기증자 피크는 강도가 10% 감소하는 것으로 나타났습니다.
그러나, CAND1이 첫 번째 나선을 잘린 후 기증자 피크 강도의 감소가 증가하여 더 높은 FRET 효율을 시사하여 신호 변화가 COL1-AMC와 FlASH CAND1 사이의 FRET로부터 발생했음을 확인하기 위해, 기증자 FRET는 수용자에서 체이스로 알려진 과도한 라벨이 없는 CAND1과 혼합되었다. 그 결과 기증자 피크가 완전히 복원되고 수용자 피크가 감소했습니다. 여기에 도시된 선형 회귀 분석에 따른 CAND1 농도를 가진 평균 관찰된 K값의 플롯이 있다.
복합체의 상수를 측정하기 위해, 50 나노몰러 COL1-AMC는 일련의 관찰된 해리율 상수를 플로라시 CAND1의 농도 증가와 50 나노몰러 COL1-AMC를 혼합하여 측정되었다. 상수의 측정과 유사하게, COL1 및 CAND1의 관찰된 해리 상수는 정지된 유동 형광계에 시간이 지남에 따라 기증자 신호의 복원을 모니터링함으로써 발견되었다. 여기서 기증자 신호는 빠르게 증가하고 초당 4점의 관찰된 K 값을 드러냈다.
대조적으로, 사전 조립된 복합체에 버퍼를 첨가했을 때, Skp1 Skp2에 의해 유발된 COL1 CAND1의 빠른 해리를 암시하는 신호 증가가 관찰되지 않았다. 가능한 한 어둠 속에서 형광을 유지하려고합니다.
