저자는이 연구에서의 귀중한 도움을 씨 스벤 자 씨 스티븐 콘리 감사드립니다. 이 작품은 히스 [부여 번호 R00CA134920]의 국립 연구소에 의해 부분적으로 기금과 미국 폐 협회 [부여 번호 RG-194681-N].되었습니다 NinePoint 의료 주식회사는 원고와 관련된 출판 비용을 후원했습니다.

1. 이미징 시스템 OFDI의 기술적 세부 사항은 이전에 4-6 설명되어 있습니다. 원주 OFDI는 초당와 원형 단면 이미지 당 512 및 2,048 축 깊이 프로파일 사이의 25 및 100 프레임 사이의 영상 속도로 진행되었다. 본 연구에 사용 된 사용자 정의 2.4 금 (0.8 mm 직경) 헬리컬 스캐닝 카테터는 표준 bronchoscopes의 액세스 포트를 통해 작동하도록 설계되었습니다. 카테터는 기관지 벽과 단일 사용 외부 피복 위에 빛을 초점을 내부 광학 핵심으로 구성. 내부 코어가 25, 100 Hz에서와 1.25 사이 5mm / 초의 pullback 속도로 번역 사이의 속도로 회전하는 동안 카테 테르 몸은 이미징 동안 고정 남아 있었다. 시스템의 축 해상도가 조직에 6mm이고 7.3 mm 4-6의 이미지 이르기까지 깊이를 제공했습니다. 카테터 기반 OFDI는 생체 bronchoscopic OFDI (FI에서 복제 본 연구에서 수행 된gure 1). 그러나,이 프로토콜은 또한 벤치 탑 광학 시스템 (그림 3과 4)를 이미지에 적용 할 수 있습니다. 2. 설정 이미징 시스템 <ol><li> 이미징 시스템을 켜십시오 </li><li> 이미지 매개 변수 (회전 속도, pullback 속도, 이미지 수집 속도, 등) 설정 및 기록합니다. 본 연구에 사용 된 OFDI 이미징 시스템, 이미지는 10-50 프레임에서 얻었다. </li><li> 로터리 접합 및 pullback 장치에 카테터를 연결합니다. </li><li> 카테터를 돌려 및 이미지 품질을 확인합니다. 시스템 정렬을 조정하고 필요에 따라 오프셋. </li></ol> 3. 조직 준비 <ol><li> 패드에 benchtop 설정하고 폐 표본에서 테이블 일회용 흡수 패드를 놓습니다. </li><li> 이미징 환자에서 수술 전의 생체 시료 경우, 모든 절제 마진은 (기관지 혈관, 그리고 parenchymal 마진) patho에 의해 평가 문서 및 / 또는 제거되었는지 확인하기 위해 병리 부서에 문의하시기 바랍니다logist. </li><li> hilum에서 절제의 표본을 입력 기관지기도를 식별합니다. 구멍 주사기를 사용하여기도 내에서 보이는 점액을 제거합니다. 필요한 경우,기도 내 깊은 흡입으로 낳은 주사기로 플라스틱 튜브의 긴 세그먼트를 첨부 할 수 있습니다. </li><li> 관심 병변을 식별 할 수 표본의 외부 표면을 만져보다. </li><li> 고급 금속 탐침을 사용하여 조심스럽게 관심의 병변 근처까지 기관지 나무를 탐색 할 수 있습니다. </li><li> 관심 병변이 표시 또는기도 점막 아래에 만져서 알 수있는 때까지 프로브를 따라기도를 엽니 다. </li><li> 조심스럽게면 - 날붙이 작은 주걱으로 병변 놓인기도 점막에서 피나 점액을 제거합니다. </li><li> 기도 점막 위의 OFDI 카테터를 삽입하여 병변이기도 점막의 기반이되어 확인하고 조직학 상관에 대한 관심이 높은 품질의 이미지 영역을 식별하기 위해 이미지를 얻습니다. </li></ol> 4. 마킹 조직 <ol> &lt;리&gt; 단계 3.8에서 이전 이미징 결과에 따라기도에 대한 관심의 영역을 선택합니다. </li><li> 이미지의 원하는 라인을 따라 조직에 두 개의 점을 선택합니다. 포인트는 원하는 결과에 따라기도의 길이 방향 (그림 2) 또는 원주 (그림 3) 측면을 하나에 병렬 할 수 있습니다. 우주 점은 더 이상 1.5 이상의 cm가 떨어져 있으므로 조직의 부분 처리에 대해 하나의 조직학 블록에 맞게 수있다. 조직학 쌍 :&gt; 1.5 cm의 조직의 길이가 필요한 경우, 긴 여러 일치하는 이미지를 만들 관심 지역을 체결 여러 1.5 cm로 조직 길이를 분할. </li><li> 벌금을 수영이 염료를 (삼각형 생명 과학, 더럼, NC) 마킹 조직에 열려있는 구멍 바늘 (즉, 25 게이지 팔분의 칠 &quot;오랫동안) 팁. </li><li> 조심스럽게 만 낳은 바늘 내에서 조직 마킹 잉크를 남겨두고 거즈로 바늘의 외부에서 초과 잉크를 닦아냅니다. </li><li> 에서기도 점막에 찔린 조직 수직을이미지의 라인을 따라 포인트를 선택. </li><li> 기도 점막의 두 번째 포인트 3.5 단계 3.3를 반복합니다. </li><li> 잉크가 떨어져 구멍 사이트에서 점막 표면에 실행되면, 신중하게 초과 잉크를 제거하는 작은 주걱 팁을면을 사용합니다. </li><li> 만약 존재한다면면과기도 점막의 표면에 점액이나 피를 제거는 작은 주걱 팁을. </li><li> 잉크 점은기도 내에 원주 배치하는 경우, 그것은 이미지 필드 (그림 3A)에 조직을 평평하게하는기도의 두면을 개방 고정하는 데 유용합니다. </li></ol> 5. 이미징 조직 <ol><li> 각 잉크 마크와 상표는 OFDI에 표시되는 수 있도록 이미지를 통해 OFDI 카테터를 놓습니다. 마크는 매우 산란 입자를 놓인하고 주사 사이트 (그림 3B,도 4a, 그림 4g 내에서 잉크 입자에 해당하는 빠른 신호 감쇠를 근간으로 조직 구조 내에서 초점 중단으로 표시합니다 </strong&gt;). </li><li> 잉크 표시 (들) OFDI 단계를 반복 보이지 않는 흔적을 찾아 4.3-4.7에 표시하지 않은 경우. 잉크 표시가 OFDI로 볼 수있는 경우 5.3 단계로 진행합니다. </li><li> 카테 테르 광학가 첫 번째 잉크 표시 (그림 2B) 이상으로 조직을 ... 위에 가로 눕다 있도록기도 점막 표면에있는 두 개의 잉크 마크에 카테 테르를 평행를 놓습니다. 가벼운 개체가있는 카테터의 근위 끝을 고정하고 말단부를 보호하는 것은 모션 유물을 줄일 수 있습니다. </li><li> OFDI의 pullback를 수집을 진행합니다. </li><li> 두 잉크 자국이 영상에서 볼 수 있습니다 보장하고 모션 아티팩트 (그림 3과 그림 4)를 확인 OFDI pullback 이미지를 볼 수 있습니다. 마르크가 표시되지 않으면 5.4에 단계 5.1를 반복합니다. </li></ol> 6. 조직을 수집 및 처리 <ol><li> 이미지 스캔의 시작, 0.3 cm 떨어진 일에서 방향으로기도 점막 조직에 녹색 잉크 점 (트라이앵글 생명 과학, 더럼, NC)를 배치영상 pullback (그림 2C)에 처음 등장한 전자 잉크 표시. </li><li> 두 개의 검은 색 잉크 마크 및 녹색 잉크 마크를 포함한 조직을 제거합니다. 표준 조직학 처리 카세트에 맞게 조직을 잘라. 신선한 조직을 절단 것이 어려운 경우, 다음 조직은 조직 학적 소견에 대한 조직을 제거하기 전에 고정 할 수 있습니다. </li><li> 최소 48 시간을위한 포르말린 10 % 조직학 처리 카세트 및 수정에서 개최 조직. </li><li> 모든 조직학 부서를 통해 제공되는 조직 프로세서에서 프로세스 조직. </li><li> 컷 섹션기도 표면에있는 두 개의 검은 색 잉크 자국에 평행하게 될 것이라고에는 파라핀에 조직을 삽입 할 수 있습니다. </li><li> 두 잉크 표시가 표시됩니다 또는 전체 조직 섹션 중 빠른 날짜, 보일 때까지 파라핀 블록에 직면하는 조직 마이크로톰을 사용합니다. </li><li> 일단 모두 검은 색 잉크 자국이 볼 수있는 하나 5 μm 두께의 섹션을 잘라 유리 슬라이드에 장착합니다. </li><li> 매 5 μm 두께의 섹션을 잘라 마운트 계속검은 색 잉크 자국까지 50 μm이 표시 또는 조직 끝에 더 이상 있으며, 이때 둘 중 빠른 날짜가 적용됩니다. </li><li> 표준 hematoxylin 및 eosin (H &amp; E)가 얼룩 할 수 프로토콜과 coverslip 슬라이드 얼룩하십시오. </li></ol> 7. 이미지 처리 이미지가 두 잉크 표시가 하나의 단면 이미지에서 볼 수 있었다 benchtop 스캐너 또는 기타 검사 기법으로 구입 한 경우, 이미지가 직접적으로 대응하는 조직 학적 소견과 상관 될 수 있습니다. 용적 데이터 세트는 헬리컬 스캐닝 카테 테르를 구입 한 경우, 이미지 재 보정하므로 하나의 2D 이미지가 조직학과 상관 관계에 대한 두 잉크 자국을 양분하는 것이 될해야합니다. 이것은 ImageJ 또는 다른 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 어떤 경우에는 잉크가 인접 섹션 / 슬라이드가 검사해야하는 경우에는 즉시 표시되지 않을 수 있습니다.

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초기 폐 malignancies의 평가는 매우 증상의 부족과 radiologically 또는 bronchoscopically 초기 neoplastic 변경 사항을 시각화 할 수 없다는으로 인해 도전 할 수 있습니다. OFDI는 histologic 해상도, 넓은 지역에 실시간으로 2-6의 조직 미세의 3 차원 전망 근처에 있습니다. Endobronchial OFDI은 폐기도 11-13 (애니메이션)의 긴기도 세그먼트를 통해 고해상도 입체 데이터 세트를 얻을하는 데 사용할 수있는 안전 기술로 환자 증명되었습니다. 그러나, 작은 biopsies는 폐 병리에 대한 이미지 기준의 개발을 OFDI에 적절한 상관 관계를 제공하지 않는 생체 설정에서의 histopathological 대응으로 얻을 수 있습니다. 정확하게 폐 영상에서 볼 수 OFDI 기능을 평가하기 위해서는, 조직학의 상관 관계에 정확하게 일치하는 이미지를 얻기 위해 필수적입니다. 우리는 O를, 정밀에 대한 하나를 간단하고 효과적인 방법을 제시OFDI 및 조직학 사이 NE의 상관 관계는 거의 모든 예 생체 조직 유형에 적용 할 수 있습니다 예 생체 폐 절제술의 표본의기도 이미징에 적용. 이미징 기준이 일치 하나 하나 조직학과 예 생체를 설립 한 후,이 기준은 다음 생체 이미징에 적용 할 수 있습니다. 관심 이미징 영역을 표시하는 데 사용 조직 염료는 OFDI과 조직학 모두에서 명확하게 볼 수 있습니다. 방향에 직접적인 기술을 사용하여 조직은, 잉크 마크는 OFDI 기능 및 조직학의 연구 결과의 1-1 비교는 조직 병리학의 식별 이미징 특성을 결정 할 수 있도록 영상과 조직 학적 소견 모두에서 상관이 될 수 있습니다. 기술은 따라서 많은 광학 이미징 응용 프로그램에 유용하고, 저렴하고 실용적인 것입니다. 생체 설정에서, 이러한 레이저 마킹 등의 방법은 조직의 방향 25 사용할 수 있습니다. 그러나, t그는 기관지 생검의 작은 크기는 여전히 폐 병리에 대한 구체적인 이미징 기준을 개발하기 위해 생체 연구에 사용에 제한 요소입니다. 예 생체 연구는 생체 이미징에에 적절한 다른 역할을하지만, 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 예 생체의 폐 표본이 uninflated 종종 정상적인 폐포 구조의 모양을 변경 수술 유발 무기폐를 표시합니다. 대부분의 수술 폐 표본이되는 동안 흉막 표면이 표본 인플레이션을 방해, 중단되어 병리 냉동 섹션 평가 한 후 수신으로 조직학 상관에 대한 마킹 조직을 수술로 resected 폐 조직을 팽창하는 것은 도전이다. 비 pathologic 무기폐는 생체 설정에서에서 볼 수 보물이 아니야, 따라서 이러한 제한은 생체 폐 영상에서에 관련되지 않습니다. 또한, 예 생체 표본의 혈관 내에서 혈액의 부족 distingu에 어렵게 만들 수다른 신호 공극 구조의 혈관 구조를 다우. 에서 생체 설정에 구조 10월 / OFDI에 도플러 10월 / OFDI 26-28의 추가는 선박의 식별에 도움이 것입니다. 그들은 현재 전의 생체없는 곳 모션 유물은 생체에서 볼 수 있습니다. 이 느린 수집 속도로 표준 10월 시스템에 잠재적으로 문제가 될 수 있습니다. 그러나, OFDI 시스템의 빠른 프레임 속도는 현재&gt; 200 프레임 29-31아르. 따라서,이 운동의 유물이 중요한 문제가 될 것이라고 기대하지 않습니다. 생체 10월 및 OFDI 이미징 연구에서 이전 괜찮 이미징 기능 14,15,18,19의 성공적인 시각화를 증명하고있다. 이 연구에서 우리는 폐 병리를 평가하기위한 조직 기반의 진단에 정확한 상관 관계와 판매량 OFDI를 증명하고있다. 설명 절차는 금 standa로 사용할 수 정확하게 일치하는 조직학를 제공하기위한 것입니다OFDI 이미지 해석을위한 RD. 폐 병리에 대한 일단 특정 이미징 기준을 개발하고 일치 일대일 조직학과 예 생체을 검증되었으며, 기준은 다음 이미지의 금 표준 평가로 기관지 생검의 사용과 생체 이미징 연구에 이후에 적용 할 수 있습니다 기능이었다. 이 기술은 폐 절제술의 표본에 대한 응용 프로그램으로 제시되어 있지만, 정상과 병적 인 두 조직의 훌륭한 이미징 기능을 결정하기 위해 필요한 조직학 상관에 정확한 이미지를 제공하기 위해 거의 모든 조직 유형에 적용 할 수 있습니다.

optical frequency domain imaging of ex vivo pulmonary resection specimens: obtaining one to one image to histopathology correlation

폐암은 암 관련 사망자 1의 주요 원인입니다. adenocarcinomas는 일반적으로 위치에 더 많은 말초 반면 편평 세포와 작은 세포 암은 일반적으로 수행기도와 관련하여 발생합니다. 방사능 해상도,기도 점막의 기반이 조직을 평가하고 초기 pathologic 변경 사항을 식별하는 bronchoscopic 제한, 작은 샘플 크기 및 / 조직학의 biopsies 또는 불완전 샘플링 : 질병 초기 ​​단계에 폐 종 감지 인해 여러 가지 제한하기 어려울 수 있습니다. 이러한 광학 주파수 영역 영상 (OFDI)와 같은 고해상도 이미징 modalities는 실시간 (그림 1) 2-6에서 2mm에 접근 깊이에 조직 미세의 비 파괴, 넓은 지역에 3 차원 전망을 제공합니다. OFDI는 관상 동맥 죽상 경화증 6,7 및 식도 장 metaplasia과 형성 이상 평가를 포함하여 응용 프로그램의 다양한 활용되었습니다 <sup&gt; 6,8-10. Bronchoscopic 10월 / OFDI은 폐기도 할 11-23 (애니메이션)을 평가하기위한 생체 이미징 도구에 안전한 것으로 입증되었습니다. 10월는 동물 모델의 폐기도 16,23과 실질 17,22과 생체 인간의기도 14,15의 평가되었습니다. 일반기도 10월 영상은기도 레이어링과 폐포 첨부 파일의 시각화을 입증하고 있으며, dysplastic 병변의 평가는 기관지 점막 11,12,20,21에서 형성 이상의 성적을 구별에 도움이 발견되었습니다. 기관지 점막의 OFDI 영상은 짧은 기관지 세그먼트 (0.8 cm) 18 입증되었습니다. 또한, 생체 내 돼지와 인간의 폐 항공에서 여러기도 세대에 걸쳐 체적 OFDI는 19 설명하고 있습니다. Endobronchial 10월 / OFDI는 일반적으로 표준 bronchos와 호환되는 얇은 유연한 카테터를 사용하여 수행됩니다copic 액세스 포트. 또한, 10 월 및 OFDI 바늘 기반 프로브는 최근기도 벽이나 흉막 표면에 17 이외의 폐의 이미지 지역에 사용될 수있는, 개발되었습니다. 10월 / OFDI은 생체 폐 이미지에 활용하고위한 가능한으로 입증 된 반면,와 아무런 연구 정확하게 일대일 OFDI 결과가 없습니다 : 조직학이 수행되었습니다. 따라서, 다양한 폐 pathologies에 대한 구체적인 이미징 기준은 개발하지 못하고있다. 생체에서 얻은 Histopathological 대응은 대형 OFDI 데이터 세트와 연관시키는 것은 쉽지 만 작은 생검 조각,로 구성되어 있습니다. 또한, 그들은 큰 볼륨 OFDI로 등록에 필요한 포괄적 인 조직학을 제공하지 않습니다. 그 결과, 폐 병리학의 특정 이미징 기능은 생체 환경에서 개발 할 수 없습니다. 정확히 일치하는, 일대일 OFDI 및 조직학 상관 정확하게 O에서 본 기능을 평가하는 중요위해 금 표준으로 조직학에 대한 FDI는 폐 neoplasms 및 기타 폐 pathologies에 대한 특정 이미지 해석 기준을 도출합니다. 일단 특정 이미징 기준을 개발하고 일치 일대일 조직학과 예 생체을 검증되었으며, 기준은 다음 생체 이미징 연구에 적용 할 수 있습니다. 여기, 우리는 높은 해상도 광학 이미징 및 예 생체의 폐 절제술의 표본에서 조직학 사이의 정확한 1-1 상관 관계에 대한 방법을 제시한다. 이 원고를 통해, 우리는 조직학에 OFDI 이미지를 일치시키는 데 사용 기술을 설명합니다. 그러나,이 방법은 OFDI에 해당하지 않습니다 및 광학 이미징 기술에 대한 조직 학적 소견에 등록 된 이미지를 얻기 위해 사용할 수 있습니다. 우리는 bronchoscopic 2.4 프랑스어를 건설 전문 사용자와기도 중심의 OFDI (0.8 mm 직경) 카테터를 수행. 조직 샘플은 OFDI과 조직학 모두에서 볼 수 조직 염색과 표시했습니다. 조심스럽게 방향 절차는 정확하게 IMA를 상관하는 데 사용 된ging 및 조직 학적 샘플링 위치. 이 원고에서 설명한 기술은 폐 병리학 24 평가에 대한 조직 기반 진단에 정확한 상관 관계와 판매량 OFDI의 첫 시연을 수행하는 데 사용되었습니다. 이 간단하고 효과적인 기술은 정상과 병에 걸린 두 조직의 훌륭한 이미징 기능을 결정하기 위해 필요한 조직학 상관에 정확한 영상을 제공하기 위해 다른 조직 유형에 연장 할 수 있습니다.

검은 색 잉크 자국은 1 사이 여야합니다 - 1.5 cm 간격 관심 이미징 영역을 표시 할 수 있습니다. 녹색 잉크 마크 방향 시편 (그림 2, 그림 3A)에 첫 흑인 잉크 표시하기 전에 이미지 스캔의 시작 부분에 배치해야합니다. 조직 잉크 자국은 OFDI 이미징 및 조직학 (그림 3 및 4) 모두에 표시됩니다. 일반 돼지 (그림 3)과 인간의기도 (그림 4)에서 전형적인기도 레이어링이 표시됩니다. 상피 (E)는 얇은으로 볼 수 있습니다, 적당히기도의 luminal 측면에서 고밀도, 균일 한 층을 신호. 얇은 판의 propria은 엘라스틴과 콜라겐 (EL) 등의 신호를 강렬한 결합 조직으로 얇은 판 propria (LP)의 다양한 구성 요소에 해당하는 신호 가난한 조직, 및 신호 가난한 침 타입의 선의 조직 신호 강렬한 조직 (G으로 구성되어 있습니다 ). respi을 가로 지르는 가끔 보이는 신호 가난한 덕트 (D)가 있습니다ratory 상피는 기관지 내강에 연결합니다. 부드러운 근육이 불연속, 사이 사이 부드러운 근육 fascicles로 표시되므로 OFDI에서 식별되지 않습니다. H &amp; E와 trichrome 얼룩에서기도 레이어링은 표면 밀도 탄성과 collagenous 조직 깊은 파란색과 기본 평활근 표시에 trichrome 곳 (그림 3C, 3D, 3 층, 3G, 4B, 4C, 4E, 그리고 4 층) 시각화 할 수 있습니다 얼룩 빨간색 (SM). 연골 고리 (C)는 돼지기도에 중복 인간의기도에 중복되지 않는 잘 정의 된 경계와 신호​​ 가난한 초승달 모양의 구조로 표시됩니다. 연골 링을 둘러싼 perichondrium는 신호 가난한 연골 고리를 포함한 신호 강렬한 조직의 얇은 층으로 나타납니다. 에서 주변 사람의기도 (그림 4g과 4h), 폐포 첨부 파일 (A)는 신호 무효 폐포 공간이있는 얇은, 신호 강렬한 격자 모양의 폐포 벽으로 볼 수 있습니다. 얇은 판의 propria 내 혈관 공백이 V 아르가벼운 기본 미행 유물 (화살표)와 신호 무효 선형 또는 원형 구조로 isible. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3855/3855fig1.jpg" /> 1 그림. 돼지기도 OFDI. 기계적 환기 아래 돼지기도에서 얻은 생체 이미지를합니다. 근위기도 (A) ODFI의 크로스 섹션을 참조하십시오. 말초기도 (B) OFDI의 크로스 섹션을 참조하십시오. 근위기도 (C) ODFI 세로 섹션, 붉은 색 강조 지역의 패널 전자의 높은 배율 이미지입니다. 말초기도 (D) OFDI 세로 섹션, 녹색 강조 표시 영역에서 패널 전자의 높은 배율 이미지입니다. 말초로 근위에서기도 (마) ODFI 세로 섹션 (오른쪽 왼쪽). 카테 테르 직경은 0.8 mm이며, 체크 마크는 0.5 mm 단위를 나타냅니다. 기도 벽과 폐포 첨부 파일의 서로 다른 레이어가 OFDI 이미지를 알아볼 수 있지만, 그것은 정확하게 해부학 공동을 해석하기가 어렵습니다직접 등록 조직학없이 OFDI 신호의 rrelate. E : 상피, LP : 얇은 판 propria, SM : submucosa, C : 연골, : 폐포 첨부 파일. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3855/3855fig2.jpg" /> 그림 2. 돼지기도 마킹 조직. () 1.5 cm 떨어져기도의 길이 방향 측면에 평행하게 배치 luminal 표면에 두 개의 검은 색 잉크 마크와기도를 개설. (B) 두 개의 검은 색 잉크 위에 위치 OFDI 카테터는 OFDI의 pullback에서 모두 표시를 포함하는 것으로 표시됩니다. 방향에 대한 추가 녹색 잉크 표시 시편의 영상 검사의 시작과 (주)기도. <img alt="그림 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/3855/3855fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/3855/3855fig3.jpg" /> 그림 3. 돼지기도 OFDI과 조직학 정확한 맛을 보여주는마킹 조직을 사용하는 관계. (A)기도의 원주 측면에 평행하게 배치 luminal 표면에 두 개의 검은 색 잉크 마크와기도를 개설. 핀은 더기도를 (화살표)을 여는 데 사용됩니다. 및 (d) 상관 trichrome이 얼룩 : (b)는 모두 잉크로 돼지의기도 OFDI는 H &amp; E와 (C) 정확하게 상호 조직학의 스테인드 (검은 색 잉크가 호흡기 상피에 표시 마르크 별표)와 (별표) 표시 표시합니다. 규모 바 : 2 음. (F) 해당 조직 학적 소견으로는 H &amp; E 물들과 (g) 상관 trichrome는 얼룩과 OFDI 이미지의 (E) 높은 배율 전망이 있습니다. E : 호흡기 상피, EL : 조밀 콜라겐과 탄력 조직, SM : 평활근, C : 연골 고리 (조직 학적 유물이 연골 링 인공 분리 인한), G : 침샘 조직, D : 침 덕트는 상피를 입력. 규모 바 : 250 μm. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3855/3855fig3large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 4" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/3855/3855fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/3855/3855fig4.jpg" /> 4 그림. 마킹 조직을 사용하여 정확한 상관 관계를 보여주는 인간의기도가 OFDI과 조직학은. () 모두 잉크로 인간의 근위기도 OFDI은 (별표) 표시 표시합니다. 검정 잉크로 H &amp; E와 (b)는 정확히 상관 조직학의 스테인드 호흡 상피 (별표)에 표시 마르크 및 (c) 상관 trichrome 얼룩. 규모 바 : 2 음. (D) OFDI 이미지의 높은 배율보기 및 (e)에서 해당 조직 학적 소견으로는 H &amp; E 및 (F) trichrome 물들. 규모 바 : 250 μm. E : 호흡기 상피, LP : 얇은 판 propria, G : 침샘 조직, C : 연골 링, PC : perichondrium. 인간의기도에 일반적인 레이어링이 표시됩니다. 느슨한 결합 조직 내에서 (SM, 패널 C와 F) 붉은 얼룩 평활근의 fascicles을이 사이 사이 아르, 연속 밴드를 형성하지 그래서 OFDI의 고유 한 레이어로 표시하지 않은된다. (g) 인간의 말초기도 및 호흡기 상피 (별표)에 표시 검정 잉크 표시가있는 (H) 정확하게 상관 H &amp; E 조직학의 OFDI. 규모 바 : 2 음. 폐포 첨부 파일 (A)는 신호 공극 폐포 공간이있는 신호 강렬한 격자 모양의 폐포 벽으로 볼 수 있습니다. 얇은 판의 propria 내 혈관 공간은 기본 약한 섀도 잉 (화살표)와 신호 무효 구조로 볼 수 있습니다.

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Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

이미지 방법<em&gt; 예 생체</em&gt; 폐 절제술의 광 주파수 영역 영상 (OFDI)와 표본과 조직학에 정확한 상관 관계를 얻기는 폐 병리에 대한 특정 OFDI 해석 기준을 개발하는 데에 매우 중요합니다있는 설명되어 있습니다. 이 방법은 정확한 이미지 해석 및 평가를위한 조직학 상관 관계에 정확한 영상을 얻을 다른 조직 유형 및 이미징 기술에 적용 할 수 있습니다. 이 기법으로 설립 이미징 기준은 다음 미래의 이미지 평가에 적용 될<em&gt; 생체 내</em&gt; 연구.

의 광 주파수 도메인 영상<em&gt; 예 생체</em&gt; 폐 절제술의 표본 : 조직 병리학 간 상관 관계에 하나에 하나의 이미지를 얻기

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting ...

optical-frequency-domain-imaging-ex-vivo-pulmonary-resection

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

14.0K 조회수.  Harvard Medical School. 이미지 방법 예 생체 폐 절제술의 광 주파수 영역 영상 (OFDI)와 표본과 조직학에 정확한 상관 관계를 얻기는 폐 병리에 대한 특정 OFDI 해석 기준을 개발하는 데에 매우 중요합니다있는 설명되어 있습니다. 이 방법은 정확한 이미지 해석 및 평가를위한 조직학 상관 관계에 정확한 영상을 얻을 다른 조직 유형 및 이미징 기술에 적용 할 수 있습니다. 이...

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High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

고해상도 3D 영상의 전 VIVO</em마이크로 중부 표준시로> 생물 학적 샘플

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

연구

생체공학

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

입체 광학 해상도 Photoacoustic 현미경

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO</em대동맥 심장 밸브> 학습

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Integrated Photoacoustic Ophthalmoscopy and Spectral-domain Optical Coherence Tomography

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging technologies. Existing retinal imaging modalities, such as fundus photography1, confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO)2, and optical coherence tomography (OCT)3, have significant contributions in monitoring disease onsets and progressions, and developing new therapeutic strategies. However, they predominantly rely on the back-reflected photons from the retina. As a consequence, the optical absorption properties of the retina, which are usually strongly associated with retinal pathophysiology status, are inaccessible by the traditional imaging technologies.
Photoacoustic ophthalmoscopy (PAOM) is an emerging retinal imaging modality that permits the detection of the optical absorption contrasts in the eye with a high sensitivity4-7 . In PAOM nanosecond laser pulses are delivered through the pupil and scanned across the posterior eye to induce photoacoustic (PA) signals, which are detected by an unfocused ultrasonic transducer attached to the eyelid. Because of the strong optical absorption of hemoglobin and melanin, PAOM is capable of non-invasively imaging the retinal and choroidal vasculatures, and the retinal pigment epithelium (RPE) melanin at high contrasts 6,7. More importantly, based on the well-developed spectroscopic photoacoustic imaging5,8 , PAOM has the potential to map the hemoglobin oxygen saturation in retinal vessels, which can be critical in studying the physiology and pathology of several blinding diseases 9 such as diabetic retinopathy and neovascular age-related macular degeneration.
Moreover, being the only existing optical-absorption-based ophthalmic imaging modality, PAOM can be integrated with well-established clinical ophthalmic imaging techniques to achieve more comprehensive anatomic and functional evaluations of the eye based on multiple optical contrasts6,10 . In this work, we integrate PAOM and spectral-domain OCT (SD-OCT) for simultaneously in vivo retinal imaging of rat, where both optical absorption and scattering properties of the retina are revealed. The system configuration, system alignment and imaging acquisition are presented.

Photoacoustic ophthalmology (PAOM), an optical-absorption-based imaging modality, provides the complementary evaluation of the retina to the currently available ophthalmic imaging technologies. We report the using of PAOM integrated with spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) for simultaneous multimodal retinal imaging in rats.

통합 Photoacoustic Ophthalmoscopy 및 스펙트럼 도메인 광 결맞음 단층 촬영 장치

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging ...

One Minute, Sub-One-Watt Photothermal Tumor Ablation Using Porphysomes, Intrinsic Multifunctional Nanovesicles

We recently developed porphysomes as intrinsically multifunctional nanovesicles. A photosensitizer, pyropheophorbide &alpha;, was conjugated to a phospholipid and then self-assembled to liposome-like spherical vesicles. Due to the extremely high density of porphyrin in the porphyrin-lipid bilayer, porphysomes generated large extinction coefficients, structure-dependent fluorescence self-quenching, and excellent photothermal efficacy. In our formulation, porphysomes were synthesized using high pressure extrusion, and displayed a mean particle size around 120 nm. Twenty-four hr post-intravenous injection of porphysomes, the local temperature of the tumor increased from 30 &deg;C to 62 &deg;C rapidly upon one minute exposure of 750 mW (1.18 W/cm2), 671 nm laser irradiation. Following the complete thermal ablation of the tumor, eschars formed and healed within 2 weeks, while in the control groups the tumors continued to grow and all reached the defined end point within 3 weeks. These data show how porphysomes can be used as potent photothermal therapy (PTT) agents.

We developed novel intrinsic multifunctional nanovesicles called porphysomes, which have structure-dependent fluorescence self-quenching and unique photothermal properties, thus functioning as potent photothermal therapy agents. We formulated porphysomes using high pressure extrusion and investigated their photothermal therapy efficacy in a xenograft tumor model.

한 분, Porphysomes를 사용하여 하위 한 와트 광열 종양 절제, 내장 다기능 Nanovesicles

We recently developed porphysomes as intrinsically multifunctional nanovesicles. A photosensitizer, pyropheophorbide &alpha;, was conjugated to a ...

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the subsequent attachment and activation of platelets, monocyte/macrophage adhesion, and inflammatory cell signaling events, leading to post-procedural complications. The Chandler Loop Apparatus is an experimental system that allows researchers to study the molecular and cellular interactions that occur when large volumes of blood are perfused over polymeric conduits. To that end, this apparatus has been used as an ex vivo model allowing the assessment of the anti-inflammatory properties of various polymer surface modifications. Our laboratory has shown that blood conduits, covalently modified via photoactivation chemistry with recombinant CD47, can confer biocompatibility to polymeric surfaces. Appending CD47 to polymeric surfaces could be an effective means to promote the efficacy of polymeric blood conduits. Herein is the methodology detailing the photoactivation chemistry used to append recombinant CD47 to clinically relevant polymeric blood conduits and the use of the Chandler Loop as an ex vivo experimental model to examine blood interactions with the CD47 modified and control conduits.

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits.

사용<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 챈들러 루프 장치 수정 된 고분자 혈액 도관의 생체 적합성을 평가하기 위해

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the ...

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that implantation of a bone autograft would induce greater bone regeneration by abundant blood vessel formation. To investigate the effect of the graft on neovascularization at the defect site, we developed a micro&#8211;computed tomography (&#181;CT) approach to characterize newly forming blood vessels, which involves systemic perfusion of the animal with a polymerizing contrast agent. This method enables detailed vascular analysis of an organ in its entirety. Additionally, blood perfusion was assessed using fluorescence imaging (FLI) of a blood-borne fluorescent agent. Bone formation was quantified by FLI using a hydroxyapatite-targeted probe and &#181;CT analysis. Stem cell recruitment was monitored by bioluminescence imaging (BLI) of transgenic mice that express luciferase under the control of the osteocalcin promoter. Here we describe and demonstrate preparation of the allograft, calvarial defect surgery, &#181;CT scanning protocols for the neovascularization study and bone formation analysis (including the in vivo perfusion of contrast agent), and the protocol for data analysis.
The 3D high-resolution analysis of vasculature demonstrated significantly greater angiogenesis in animals with implanted autografts, especially with respect to arteriole formation. Accordingly, blood perfusion was significantly higher in the autograft group by the 7th day after surgery. We observed superior bone mineralization and measured greater bone formation in animals that received autografts. Autograft implantation induced resident stem cell recruitment to the graft-host bone suture, where the cells differentiated into bone-forming cells between the 7th and 10th postoperative day. This finding means that enhanced bone formation may be attributed to the augmented vascular feeding that characterizes autograft implantation. The methods depicted may serve as an optimal tool to study bone regeneration in terms of tightly bounded bone formation and neovascularization.

Implantation of autologous and allogeneic bone grafts constitute accepted approaches to treat major craniofacial bone loss. Yet the effect of graft composition on the interplay among neovascularization, cell differentiation and bone formation is unclear. We present a multimodal imaging protocol aimed to elucidate the angiogenesis-osteogenesis interdependence at the graft proximity.

컴퓨터 단층 촬영 및 골 형성 - 혈관 신생 커플 링의 광학 이미징 두개골 뼈자가 이식과 동종 이식 통합을 평가하기 위해

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

A Method to Estimate Cadaveric Femur Cortical Strains During Fracture Testing Using Digital Image Correlation

This protocol describes the method using digital image correlation to estimate cortical strain from high speed video images of the cadaveric femoral surface obtained from mechanical testing. This optical method requires a texture of many contrasting fiduciary marks on a solid white background for accurate tracking of surface deformation as loading is applied to the specimen. Immediately prior to testing, the surface of interest in the camera view is painted with a water-based white primer and allowed to dry for several minutes. Then, a black paint is speckled carefully over the white background with special consideration for the even size and shape of the droplets. Illumination is carefully designed and set such that there is optimal contrast of these marks while minimizing reflections through the use of filters. Images were obtained through high speed video capture at up to 12,000 frames/s. The key images prior to and including the fracture event are extracted and deformations are estimated between successive frames in carefully sized interrogation windows over a specified region of interest. These deformations are then used to compute surface strain temporally during the fracture test. The strain data is very useful for identifying fracture initiation within the femur, and for eventual validation of proximal femur fracture strength models derived from Quantitative Computed Tomography-based Finite Element Analysis (QCT/FEA).

In this protocol, the femur surface strains are estimated during fracture testing using the digital image correlation technique. The novelty of the method involves application of a high-contrast stochastic speckle pattern on the femur surface, carefully specified illumination, high speed video capture, and digital image correlation analysis for strain calculations.

방법 골절 디지털 이미지 상관 관계를 사용 하 여 테스트 하는 동안 싱가포르로 대 퇴 골 피 질 긴장을 예상

This protocol describes the method using digital image correlation to estimate cortical strain from high speed video images of the cadaveric femoral ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

실시 한 형광 현미경으로 여러 영상 모드

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...