Name: practical considerations in studying metastatic lung colonization in osteosarcoma using the pulmonary metastasis assay
Uploaded: 2018-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay at JoVE.com

우리는 박사 Arnulfo 멘도사 푸 마 기술에서 훈련을 제공 감사 하 고 싶습니다. 또한, 우리는이 연구의 과정에서 그들의 현미경의 사용을 제공 하기 위한 박사 Chand Khanna, 수잔이 필드 (NCI/NIH), 그리고 샘 Aparicio (기원전 암 기구)를 인정 하 고 싶습니다. 이 연구는 건강의 국가 학회, 소아 종양학 분기 암 연구 센터의 교내 연구 프로그램에 의해 (부분적으로) 지원 되었다. M.M.L.는 국립 연구소 건강 교내 방문 동료 프로그램의 (수상 15335)에 의해 지원 되었다 그리고 현재 전이 연구에서 조 앤 파커 친교에 의해 지원 됩니다. P.H.S.는 브리티시 컬럼비아 암 재단에 의해 지원 됩니다.

영상 데이터를 가져온 모든 동물 프로토콜 승인 동물 관리 및 사용 위원회 국립 암 연구소, 국립 보건원의 수행 했다. 모든 동물 프로토콜 설명 및 비디오 문서에서 브리티시 컬럼비아의 대학 동물 관리 위원회에 의해 승인 되었습니다가지고.
1. 종양 세포 주입 및 푸 마 모델에 대 한 자료 준비
참고: 솔루션 및 셀의 양을 1 마우스에 대 한 충분 한 될 것입니다. 더 많은 생쥐 연구에 사용 되는 경우 필요에 따라 규모. 미디어 요리법을 표 1 과 표 2를 참조 하십시오.
<ol><li>전 37 oC 물 욕조에 15 mL 원뿔 튜브에 A-미디어의 5 mL 따뜻한.</li>
	<li>1.2% 낮은 녹는 agarose 솔루션을 (살 균 물)에 연구소 전자 레인지를 사용 하 여 녹 인 다.</li>
	<li>15 mL 원뿔 튜브에 녹은 agarose의 5 mL을 전송 하 고 37 oC 물 욕조에 따뜻한 유지. 37 oC 및 폐 insufflation 단계 전에 액체에서 녹은 agarose가 확인 합니다.</li>
	<li>미리 30 mL 세포 배양 학년 얼음 양동이에 1 X 펜/strep 보충 PBS의 진정.</li>
	<li>6 잘 플레이트의 한 잘, 미리 B-미디어의 1.5 mL에 젤라틴 스폰지를 적시 게. 스펀지 폐 조각에 대 한 지원 앵커 것입니다.</li>
	<li>OS 셀은 약 70-90% 보장 절차의 날에 confluent. -합칠 경우 또는 미디어 오렌지 노란색 셀은 일반적으로 스트레스와 시점에서 생존 능력을 감소는 때문에 셀을 사용 하지 마십시오. 다리 셀 라인, MNNG와 호, 100 μ의 볼륨에서 5 x 105 1 마우스의 꼬리 정 맥에 주사에 사용 됩니다. 더 많은 생쥐 연구에 사용 하는 경우 그에 따라 고급.</li>
	<li>0.25 %trypsin-EDTA (3 mL T75 플라스 크 또는 10 cm 배양 접시에 2 mL)을 사용 하 여 종양 세포를 수확. 셀은 시작 하면 접시에서 해제, 완벽 한 미디어 트립 신-EDTA를 중화. 셀 아래로 회전 시키십시오 그리고 세포 배양 학년 PBS로 한 번 씻어. PBS의 5 mL에 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>표준 방법으로 세포 수를 수행 합니다. 그것은 최고의 세포 현 탁 액의 손실을 자주 바늘 그리기 중 발생 이후 주입 시도 실패 실제로 필요한 것 보다 더 많은 세포 현 탁 액을 확인 하는.</li>
	<li>Trypan 블루 제외 분석 결과 세포의 생존 능력을 평가 하기 위해 세포 현 탁 액의 샘플에 수행 합니다. 셀 표시 90% 생존 하는 경우에 진행 또는 더 높은.</li>
	<li>5 x 105 셀 100 μ의 볼륨을 주입. 준비 하려면이 금액의 2 배를 초과, 1 x 106 셀 한다 스핀 다운 되며 HBSS 0.2 mL에 resuspended.</li>
	<li>주입을 위한 쥐를 준비 하는 동안 얼음 양동이에 세포 현 탁 액을 놓습니다.</li>
</ol>2. 꼬리 정 맥 주입 및 폐 Insufflation
참고: 솔루션 및이이 섹션에 있는 셀 1 마우스에 대 한 충분 한 될 것입니다. 더 많은 생쥐 연구에 사용 되는 경우 필요에 따라 규모. 장비, 자료 및 다음 단계에서 사용 되는 수술 도구 목록에 대 한 표 3 및 표 4를 참조 하십시오.
<ol><li>더 눈에 띄게 명백한 그들의 꼬리 정 맥을 만들기 위하여 여성 마우스 (나이 6-8 주) 5 분 동안 열 램프 아래 따뜻한. Murine K7M2 또는 K12 셀 사용 Balb/c 마우스; 인간의 MG63.3, MG63, MNNG, 및 호 셀에 대 한 심한 결합 된 면역 결핍 쥐를 사용 합니다.</li>
	<li>셀 서 스 펜 션은 부드럽게 튜브를 떨고 하 여 균일 한 다는 것을 확인 하십시오. 신중 하 게 바늘 없이 1 mL 주사기로 세포 현 탁 액을 그립니다. 모자는 27와 주사기 바늘 게이지. 바늘 베벨은 바늘에 볼륨 표시와 같은 측면에 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>Restrainer에 마우스를 놓고 면봉 알코올 지우기와 꼬리.</li>
	<li>꼬리 정 맥 주사를 수행 하 고 셀 서 스 펜 션의 100 μ 주사를 진행 합니다. 주입 후 5 분 CO2 챔버에 마우스 놓고 (기관 동물 관리 위원회 개요)으로 안락사 표준 운영 절차를 시작 합니다. 자 궁 경부 전위 이후 절차는 기관 손상 됩니다 안락사의 수단으로 사용할 수 없습니다.</li>
	<li>일단 마우스를 안락사 insufflation agarose/A-미디어 솔루션 마우스 폐의 층 류 후드의 준비를 시작 합니다. 층 류 흐름 후드 내에서 살 균 패드와 함께 작업 영역을 설정 합니다. 이 패드에 소독된 기기, 4 카 테 터, IV 확장 세트, 및 중력 관류 장치 ( 보충 그림 1참조)를 넣을 것입니다.</li>
	<li>지 recumbancy에 마우스를 놓습니다. 메 마른 작은 위, 신중 하 게 흉 폭로 흉 골 밖으로 해 부. Agarose/A-미디어 솔루션 폐를 insufflate 하는 데 사용 될 것입니다 폐를 찌를 하지 주의 하십시오.</li>
	<li>때 흉 골 밖으로 해 부 해 부 양쪽에 흉부 입구 과거 기도. 멀리 주변 부드러운 조직 해 부에 의해 기도 노출 합니다.</li>
	<li>20 게이지 4 카 테 터와 기관지 cannulate 느슨하게 cannulated 기관지 주위 살 균 다 봉합 사를 사용 하 여 수술 매듭 넥타이.</li>
	<li>Catheterized 기도에서 중력 관류 장치의 10 mL 주사기로 설정 4 확장을 연결 합니다.</li>
	<li>1:1 혼합물으로 미리 데워 진된 37 oC agarose (5 mL) 및 A-미디어 (5 mL)을 결합. 중력 관류 장치의 10 mL 주사기로 액체 agarose/A-미디어 솔루션을 붓는 다. Insufflation agarose/A-미디어 솔루션으로 폐의, 이전 확장 집합의 전체 길이 agarose/A-미디어, 공기와 함께 폐 샘플의 실수로 insufflation 함으로써 negating와 준비 되어 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>폐는 완전히 insufflated 때까지 폐 agarose/A-미디어 솔루션을 작성 합니다.</li>
	<li>일단 폐 insufflated 완벽 하 게는 정을 제거 하 고 기도 통해 agarase/A-미디어 솔루션의 누설을 방지 하기 위해 수술 매듭을 단단히 묶어.</li>
	<li>가슴 구멍에서 당기기 (기관, 심장, 폐)에 밖으로 부를 진행 합니다. 빵 꾸 하지 주의 또는 폐의 표면 손상.</li>
	<li>장소 미리 냉장된 30 mL PBS의에서 (아니 특정 방향)에서 뽑은 1 X 펜/strep, 보충 하 고 20 분을 강화 하기 위해 agarose/A 미디어 허용.</li>
	<li>좋은 위, 핀셋, 그림 1A와 같이 폐 (3 m m x 1.5 m m)의 작은 조각을 잘라 사용 합니다. 작은 폐 조각은 수 수 쉽게 몇 군데 2.5 X 목표를 사용 하 여. 여러 조각은 실험 조건, 당 그룹 당 4-10 조각 일반적으로 자를 수 있습니다. 참고: 각 실험 그룹에 대 한 미리 B 미디어에 배어 2 x 2 cm 젤라틴 스폰지를 포함 된 별도 우물 (6 잘 플레이트)으로 폐 조각 놓습니다. 잘 당 미디어의 양을 1.5 mL 이어야 한다. 2-3 일 마다 미디어를 변경 합니다. 약물 연구에 대 한 미디어/약물 변화의 주파수 결정 하는 사용자입니다.</li>
</ol>3. Widefield 형광 이미징 폐 슬라이스 및 분석의
참고: widefield 형광에 대 한 이미징, 작은 조각 폐 섹션 2.5 X 목표를 사용 하 여 1 이미지에 맞추기 위해 (1.5 m m x 1 m m x 3)를 절단 됩니다.
Widefield 형광 현미경에서 이미지 수집:
<ol><li>폐 슬라이스는 일반적으로 0, 3, 7, 14 일 후 주입에서 몇 군데. 생물 캐비닛의 메 마른 환경에서 신중 하 게 폐 분할 영역 전송에서 젤라틴 스폰지 살 균 35 m m 유리 하단에 라운드 접시. 폐 조각에서 초과 하는 액체에서 소량으로 초과 하는 액체는 거울으로 서 행동 하 고 종양 세포에서 나오는 형광 빛을 반영 하는 것을 주의.</li>
	<li>그림 1A에서 묘사 된 비슷한 방식으로 폐 분할 영역을 정렬. 각 열은 다른 실험 상태를 나타내는 것 이다. 교차-오염 하지 폐는 핀셋으로 알아서. 70% 에탄올과 린스를 폐 다른 실험적인 그룹에서 분할 영역을 처리 하기 전에 건조 합니다.</li>
	<li>이미지 매개 변수를 최적화 (즉. 이득, 오프셋, 노출 시간, binning) 형광 종양 세포와 배경 폐 조직 제어 (치료 되지 않는 차량)에 사이 좋은 대조를 제공 하 그룹. 컨트롤 그룹에서 동일한 매개 변수를 사용 하 여 실험적인 그룹 이미지. Tiff 이미지 형식으로 저장 합니다.</li>
	<li>에 대 한 규모, 동일한 목표에는 마이크로미터의 디지털 사진을 찍을.</li>
	<li>이후 폐 자동 형광 시간이 지남에 따라, 이미징 매개 변수 해야 합니다 조정 제어 폐 각 이미징 세션. 한 세션에 대 한 이미징 매개 변수 않을 수 있습니다 반드시 최적의 후속 이미징 세션에 대 한.</li>
</ol>이미지 분석: 참고: 다음 이미지 처리 단계 ImageJ 1.51 h 소프트웨어 패키지 17할 수 있습니다.
<ol><li>ImageJ (그림 3A)에서 이미지 파일을 엽니다.</li>
	<li>배경 빼기: 과정 > 배경 빼기 > 롤링 볼 반경 50 픽셀 (시작), 선택을 취소 "빛 배경" (그림 3B).</li>
	<li>8 비트 형식으로 이미지 변환: 이미지 > 형식 > 8-비트 (그림 3C).</li>
	<li>단위를 픽셀로 설정: 이미지 > Enter "픽셀" 단위의 길이에 "픽셀 너비", "픽셀 높이", "복 깊이"에 1을 입력. "Global" 확인란을 다음 이미지에 적용 합니다.</li>
	<li>다각형 선택 도구를 사용 하 여 전체 폐 조각의 윤곽 고 총 폐 조각의 영역 (픽셀2)을 결정 합니다. 이 값은 폐의 백분율 종양 부담을 계산 하기 위해 사용 됩니다.</li>
	<li>임계값 이미지: 이미지 > 조정 > 임계값 > "기본" 및 "B & W" 강조 > 종양 세포의 대부분은 정확 하 게 강조 표시 되도록 임계값 이미지 슬라이더를 사용. 폐는 모든 검정, 및 형광 성 병 변은 흰색 흑인과 백인 이미지를 귀 착될 것 이다 "적용"을 누르면 (그림 3D). 두 번째 시간 "적용"을 누르면 모든 형광 구조는 지금 검은 모양 (그림 3E) 이미지를 반전 됩니다.</li>
	<li>병 변의 모양과 수의 정량화: 분석 > 측정 설정 > "지역"를 확인 하십시오. 다른 모든 상자를 선택 취소 합니다. 입자 분석 > 크기 (픽셀2): 0-무한 ImageJ 열거 하는 도형 범위를 나타냅니다. 경험적으로 하루 0 차량 이미지에는 단일 종양 셀 것으로 판단 되는 작은 병 변을 확인 합니다. 하한값으로이 단일 종양 세포의 영역을 사용 하 여 데이터 집합에는 나머지 이미지에 대 한. 이 문서에 소개 된 작품에 대 한 11 픽셀2 하한값으로 설정 됩니다. 비디오 예제에 제시 하는 작품에 대 한 24 픽셀2 하한값으로 설정 됩니다. "순환" 범위를 0-1로 둡니다. "표시"로 설정할 수 있습니다 "아무것도". 또는, "표시" 및 "설명"을 선택 하는 경우 모든 개요 도형 드로잉 생성 됩니다. 팝업 측정의 별도 창에 대 한 "표시 결과"를 확인 합니다. 필요한 경우, "관리자 추가" 상자를 체크 하는 데 나중에 참조할 저장 될 수 있다 투자 수익 관리자를 측정할 모든 셰이프 저장 됩니다. 확인을 누른 후 "결과" 창 포함 하는 모든 열거 모양 및 면적 측정 (그림 3 층) 나타납니다.</li>
	<li>복사 하는 스프레드시트에 "결과" 창에서 데이터를 붙여 넣습니다. Excel에서 SUM 수학 함수를 사용 하 여 해당 특정 폐 슬라이스에 대 한 전이성 병 변의 모든 분야를 요약. 폐 조각의 백분율 폐 종양 부담 평가, 폐 조각의 전체 면적에 의해 전이성 병 변의 영역의 합계를 나눕니다. 이 매개 변수는 일컬어 지역 일부 (A)는 언더우드 18여 더. 폐 종양 부담 = 폐 슬라이스의 전이성 병 변 지역/총 면적의 합</li>
	<li>제어 그룹 및 그룹 남은 폐 섹션의 나머지 부분에 대 한 폐 종양 부담을 계산 합니다. 0, 3, 7, 14 일 동안 그룹당 평균 폐 종양 부담을 플롯 합니다. 진보적인 시간 포인트에서 푸 마 모델에 성장 및 로우 전이성 인간 OS 셀의 대표 widefield 형광 사진 (그림 4A) 표시 됩니다. 시간이 지남에 따라 백분율 전이성 종양 부담에 배 변경 (0으로 정규화)을 보여주는 선 그래프 (그림 4B) 표시 됩니다.</li>
</ol>4. 푸 마 모델의 confocal 형광 이미징
참고: confocal 이미징, 조직 처리가 비슷합니다 그 이전 섹션에서 제외 하 고는 큰 폐 슬라이스 이미지 수를 더 ROIs 있도록 (완전 한 횡 근 섹션, 1-2 m m 두께) 잘립니다.
DAR4M와 폐 실질의 라벨:
<ol><li>폐 조각 10 μμM에서 DAR4M (HBSS)에서 37 ° c.에 45 분 동안 담가 DAR4M 라벨 폐의 세포 내에서 반응성 질소 종.</li>
	<li>외피의 45 분, 후 폐 조각 신선한 HBSS로 린스.</li>
	<li>요리, 그리고 confocal 현미경 이미지 라운드 35 m m 유리 하단에 폐 슬라이스를 놓습니다.</li>
	<li>그림 5 에 표시 된 예제에서는 이미지에 대 한 이미징 매개 변수는 표 5에 나열 됩니다.</li>
	<li>관심 영역에 대 한 Z-스택 취득. 나이 키스 트 샘플링에 대 한 제안된 Z 슬라이스 두께 사용 합니다. 3D 스택 DAR4M 표시 된 폐 조직에서 녹색 형광 OS 셀을 보여주는 대표 영화 영화 1 과 보충 영화 1에 제공 됩니다.</li>
</ol>그림 5에 표시 된 예제에서는 confocal 이미지 이미징 세션 터미널 이었다. 경도 화상 진 찰이 필요한 경우 2 광자 또는 다 광자 갖춘된 confocal LSM 현미경 이미징의 사용 때문에 생활에 더 적은 photodamage 좋습니다 조직19,20. 푸 마 모델에서 미토 RFP 표현 MG63 세포 이미징:
<ol><li>1 단계와 2 미토 RFP 구조를 표현 하는 MG63 세포를 사용 하 여 윤곽선으로 푸 마 프로토콜을 수행 합니다.</li>
	<li>요리, 그리고 confocal 현미경 이미지 라운드 35 m m 유리 하단에 폐 슬라이스를 놓습니다.</li>
	<li>그림 6 에 표시 된 예제에서는 이미지에 대 한 이미징 매개 변수는 표 6에 나열 됩니다. 영화 2 에 추가 영화 2형광 미토 콘 드리 아를 제공 하는 빨간색과 녹색 형광 OS 셀을 보여주는 3 차원 스택의 대표적인 영화.</li>
</ol>

<ol>
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Nat Med. , (2018).</li><li>Ren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Metabolomics+uncovers+a+link+between+inositol+metabolism+and+osteosarcoma+metastasis."> Metabolomics uncovers a link between inositol metabolism and osteosarcoma metastasis.</a> Oncotarget. 8 (24), 38541-38553 (2017).</li><li>Ren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+metastatic+phenotype+of+a+panel+of+established+osteosarcoma+cells.">Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells.</a> Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).</li></ol>

저자는 공개 없다.

다음 기술 문서에서는 운영 체제에서 폐 식민지 공부에서 푸 마 모델의 몇 가지 실용적인 측면을 설명 합니다. 어디 연구 해야 합니다 여분의 처리 프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계는 다음과 같습니다.
a) cannulation 기도 의입니다. 기도 주변 근육 및 결합 조직 해 부 동안 쉽게 손상 될 수 있습니다. 또한, 카 테 터의 바늘 기도 통해 쉽게 밀어 수 있습니다. 바늘의 경사는 캐 뉼 ?...

전이성 osteosarcoma (OS)와 소아 환자에 대 한 향상 된 결과 여전히 중요 한 충족된 임상 필요 1남아 있습니다. 이 새로운 분자로-타겟 요법 개발의 중요성을 밑줄. 대상 종양 세포 증식 하지 전이성 질병, 그리고 이렇게 새로운 전략을 치료에 효과가 입증 된 기존의 chemotherapeutics 2전이성 과정 자체를 타겟으로 해야 합니다. 현재 문서에서는 상대적으로 새로운 유형의 비보 전 폐 전이 모델, 폐 전이 분석 결과 (푸 마) 멘도사와 동료3, 새로운 발견에 유용한 도구를 제공 하 여 개발의 실용적인 측면을 설명 합니다. OS 4,5에서 폐 전이 진행에서 분자 드라이버. 그러나 계속 하기 전에, 그것은 간단히, 전이의 몇 가지 현재 모델에 따라 터치 것 하 고 어떻게 푸 마 모델은 기존의 시험관에 비해 여러 이점을 제공 분석 실험.
전이 공부 하는 데 사용 하는 가장 실험적인 모델 특정 단계 또는 전이성 캐스케이드의 여러 단계를 정리 하는 생체 외에서 그리고 vivo에서 시스템의 구성. 이러한 단계를 포함: 1) 종양 세포 주변 혈관 (혈액 또는 임 파 액) 및 교통 순환, 내 기본 종양, 2) intravasation에서 마이그레이션 3) 보조 사이트, 4) 넘쳐 흐름 및 보조 사이트, 5) 형성에 생존에서 체포 micrometastases, 및 6)의 vascularized 전이 (그림 1)로 성장. 전이의 생체 외에서 모델 2 차원 (2D) 마이그레이션을 포함할 수 있으며 3 차원 (3D) Matrigel 침공 분석 실험에서 검토는 자세히 다른 곳 6. Vivo에서 모델에 대 한 두 가지 일반적으로 사용 되 모델 시스템 포함: 1) 자발적 전이 모델 은 종양 세포가 저절로 전이성 세포 나 지방 종양을 형성 하는 특정 조직 유형으로 주입 하는 orthotopically 먼 사이트; 2) 실험 전이 모델 은 종양 세포는 혈관 상류의 대상 기관에 주사 된다. 예를 들어 한 꼬리 정 맥 주입의 종양 세포 개발 폐 전이5,,78. 다른 실험적인 전이 모델 비장 또는 간 전이9,10의 개발에 결과 mesenteric 정 맥으로 종양 세포의 주입을 포함 됩니다. 이러한 비보에 모델의 실용적인 고려 사항 웰 치 11자세히 설명 되어 있습니다. 또 다른 vivo 모델 소아 sarcomas에 전이 공부 하는 데 사용 로컬 종양 형성 및 자연 스러운 전이 폐 12,13에 귀착되는 신장 신장 subcapsular 종양 이식 모델이입니다. Intravital videomicroscopy 수 같은 더 기술적으로 까다로운 기술을 직접 시각화에 전이성 암 세포와 전이성 사이트의 microvasculature 간의 실시간, 상호 작용 (예. 폐 또는 간) 맥도날드14에 의해 설명 된 대로 및 Entenberg15또는 김 16에 의해 설명 된 대로 chorioallantoic 막에 암 셀 넘쳐 흐름.
푸 마 모델은 폐 조직 explant 비보, ex , 닫힌된 문화 시스템 어디 형광 종양 세포의 성장을 관찰 될 수 있다 경도 형광 현미경 검사 법을 통해 한 달의 기간 동안 ( 그림 2A참조). 이 모델이 전이성 캐스케이드에서 폐 식민 (3 ~ 5 단계)의 초기 단계. 기존의 체 외에 모델을 통해 푸 마 모델의 주요 장점은: 1)에 경도 측정 폐 microenvironment 의 많은 기능을 유지 하는 3D microenvironment에 전이성 암 세포 성장 하는 기회 제공 vivo 3; 2) 푸 마 수 후보 유전자 또는 약물 치료의 최저 3D 폐 microenvironment;의 맥락에서 안티 전이성 활동을가지고 있는지를 평가 하는 연구원 3) 푸 마 모델은 유연한 형광 현미경 검사 법 (그림 2B)와 같은 플랫폼 widefield 형광 현미경 검사 법 또는 레이저 스캔 confocal 현미경 검사 법의 많은 유형으로, 각각의 예제 그림 2C & D에 표시 됩니다. 각각. 이 문서는 푸 마 모델의 향상 된 녹색 형광 단백질 (eGFP) 전이성 성장에 경도 이미징 데이터를 얻기 위해 사용 하는 방법을 설명 합니다-표현, 인간의 높고 낮은 전이성 다리 셀 (MNNG와 호 셀, 각각)를 사용 하 여 낮은 확대 widefield의 형광 형광 성 염료는 폐 실질, 레이블 및 레이블 운영 체제에서 미토 콘 드리 아 유전자 기자 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법을 사용 하는 푸 마 모델에 셀 레드-형광 단백질 이미징의 예 또한 토론 된다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Table 2&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MNNG-HOS</td><td>ATCC</td><td>CRL-1547</td><td>highly metastatic OS cell line</td></tr><tr><td>HOS</td><td>ATCC</td><td>CRL-1543</td><td>poorly metastatic OS cell line</td></tr><tr><td>MG63.3</td><td>Amy LeBlanc Laboratory (NCI)</td><td>N/A</td><td>highly metastatic OS cell line</td></tr><tr><td>MG63</td><td>ATCC</td><td>CRL-1427</td><td>poorly metastatic OS cell line</td></tr><tr><td>10X M199 media</td><td>Thermofisher</td><td>11825015</td><td>Base media for A-media and B-media</td></tr><tr><td>Distilled Water (sterilized)</td><td>Thermofisher</td><td>15230-147</td><td>Component of A-media &amp;amp; B-media</td></tr><tr><td>7.5% sodium bicarbonate solution</td><td>Thermofisher</td><td>25080094</td><td>Component of A-media &amp;amp; B-media</td></tr><tr><td>Hydrocortizone</td><td>Sigma-Alrich</td><td>H6909</td><td>Component of A-media &amp;amp; B-media</td></tr><tr><td>Retinol acetate-water soluable</td><td>Sigma-Alrich</td><td>R0635-5MG</td><td>Component of A-media &amp;amp; B-media</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution</td><td>Thermofisher</td><td>15140122</td><td>Component of A-media &amp;amp; B-media, complete media.</td></tr><tr><td>Bovine insulin solution (10mg/ml)</td><td>Sigma-Alrich</td><td>I0516-5ML</td><td>Component of A-media &amp;amp; B-media</td></tr><tr><td>DMEM, high glucose</td><td>Thermofisher</td><td>11965092</td><td>Base media of Complete Media</td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Thermofisher</td><td>25030081</td><td>Component of Complete Media</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermofisher</td><td>16000044</td><td>Component of Complete Media</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Thermofisher</td><td>14190144</td><td>Used in cell culture.</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red</td><td>Thermofisher</td><td>14175095</td><td>Used to resuspend cell pellet prior to injection</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td><td>Thermofisher</td><td>25200114</td><td>Used in cell culture.</td></tr><tr><td>DAR4M</td><td>Enzo</td><td>ALX-620-069-M001</td><td>Used to label lung parenchyma.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Table 3&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials for PuMA&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 710 Confocal LSM</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Upright LSM confocal microscope</td></tr><tr><td>Zeiss 780 Confocal LSM</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Inverted LSM confocal microscope</td></tr><tr><td>SCID mice</td><td>Charles River</td><td>N/A</td><td>NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks</td></tr><tr><td>GelFoam</td><td>Harvard Apparatus</td><td>59-9863</td><td>Used as a support for lung tissue sections.</td></tr><tr><td>SeaPlaque Agarose</td><td>Lonza</td><td>50100</td><td>Used during insufflation of the lung.</td></tr><tr><td>1 ml syringe with 27 gauge needle</td><td>Fisherscientific</td><td>14-826-87</td><td>Used for tail vein injection.</td></tr><tr><td>10 ml syringe</td><td>BD</td><td>309604</td><td>Used for insufflation of the lung.</td></tr><tr><td>20 gauge catheter</td><td>Terumo</td><td>SR-OX2032CA</td><td>Used during insufflation of the lung.</td></tr><tr><td>Abbott IV extension set (30&quot;, Sterile)</td><td>Medisca</td><td>8342</td><td>Used during insufflation of the lung.</td></tr><tr><td>Alcohol swabs</td><td>BD</td><td>326895</td><td>For wiping tail vein before injection</td></tr><tr><td>Sterile surgical gloves</td><td>Fisherscientific</td><td>Varies with size</td><td>Asceptic handing of mouse lungs</td></tr><tr><td>30 cm ruler</td><td>Staples</td><td></td><td>Used for insufflation of the lung.</td></tr><tr><td>Support stand for ruler</td><td>Pipette.com</td><td>HS29022A</td><td>Used for insufflation of the lung.</td></tr><tr><td>35 mm glass-bottomed culture dish</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td>Used during imaging of lung slices</td></tr><tr><td>Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier</td><td>VWR</td><td>56617-014</td><td>Used to line the sterile work area in the biological hood.</td></tr><tr><td>Catgut Plain Absorbable Suture</td><td>Braun</td><td>N/A</td><td>Used to tie off cannulated trachea.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Table 4&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Surgical instruments for PuMA&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Scissors 3.5&quot; Straight Sharp/Sharp</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td>For cutting lung sections</td></tr><tr><td>4&amp;rdquo; (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip</td><td>Roboz</td><td>RS-5132</td><td>For manipulating/holding lung sections.</td></tr><tr><td>4&amp;rdquo; (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip</td><td>Roboz</td><td>RS5135</td><td>For manipulating/holding lung sections.</td></tr><tr><td>Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5&quot; Length; 1.3 mm Tip Width</td><td>Roboz</td><td>RS-8120</td><td>For general dissection.</td></tr><tr><td>Thumb Dressing Forceps 4.5&quot; Serrated 2.2 mm Tip Width</td><td>Roboz</td><td>RS-8100</td><td>For general dissection.</td></tr><tr><td>Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5&quot; Straight Sharp/Sharp, 20mm blade</td><td>Roboz</td><td>RS-5880</td><td>For general dissection.</td></tr><tr><td>Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4&quot; Overall Length</td><td>Roboz</td><td>RS-5960</td><td>For general dissection.</td></tr></tbody></table>

practical considerations in studying metastatic lung colonization in osteosarcoma using the pulmonary metastasis assay

폐 전이 분석 결과 (푸 마) 이며 폐 explant 비보 전 폐쇄 셀 문화 시스템 형광 현미경 검사 법에 의해 폐 식민 osteosarcoma (OS)에서 생물학을 공부 하는 연구원입니다. 이 문서는 프로토콜에 대 한 자세한 설명을 제공 하 고 전이성 성장 widefield 또는 공초점 형광 현미경 플랫폼을 사용 하 여 이미지 데이터를 얻는 예에 설명 합니다. 푸 마 모델의 유연성 허용 연구원 폐 microenvironment에서 운영 체제 셀의 성장 뿐만 아니라 공부 뿐만 아니라 시간이 지남에 안티 전이성 치료제의 효과 평가 합니다. Confocal 현미경 검사 법은 폐 실질과 OS 세포 상호 작용의 전례 없는, 고해상도 이미징에 대 한 수 있습니다. 또한, 푸 마 모델은 형광 염료 나 형광 단백질 유전자 기자와 함께, 연구팀은 폐 microenvironment, 세포 및 subcellular 구조, 유전자 기능 및 전이성 OS 셀에 발기인 활동 공부할 수 있습니다. 푸 마 모델 다리 연구자 새로운 전이 생물학 발견 하 고 새로운 안티 전이성, 타겟 요법의 활동을 평가에 대 한 새로운 도구를 제공 합니다.

낮은 확대 widefield 형광 현미경 검사 법
푸 마 폐 조각의 widefield 형광 현미경, 대표 이미지와 부 량 데이터 그림 2C및 그림 4A 와 B에 표시 됩니다. 높고 낮은 전이성 세포 라인에 대 한 전이성 경향은 시각적으로 명백한 진보적인 시간 포인트. 호 셀 전?...

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Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

이 기사의 목적은 폐 전이 분석 결과 (푸 마)에 대 한 프로토콜에 대 한 자세한 설명을 제공 하는 것입니다. 이 모델 widefield 형광 또는 confocal 레이저 스캐닝 현미경을 사용 하 여 폐 조직에서 전이성 osteosarcoma (OS) 세포 성장 연구에 연구를 허용 합니다.

폐 전이 분석 결과 사용 하 여 다리에 전이성 폐 식민지 공부에서 실용적인 고려 사항

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

practical-considerations-studying-metastatic-lung-colonization

Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.0K 조회수.  National Institutes of Health. 이 기사의 목적은 폐 전이 분석 결과 (푸 마)에 대 한 프로토콜에 대 한 자세한 설명을 제공 하는 것입니다. 이 모델 widefield 형광 또는 confocal 레이저 스캐닝 현미경을 사용 하 여 폐 조직에서 전이성 osteosarcoma (OS) 세포 성장 연구에 연구를 허용 합니다.

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Lung Tumor Cell Recruitment Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we demonstrate a simple assay to evaluate tumor cell extravasation or micrometastasis. In this assay, tumor cells were injected through the tail vein, and after a short period, the lungs were dissected and digested to count the accumulated labeled tumor cells. This assay skips the initial step of primary tumor invasion into the blood vessel and facilitates the study of events in the distant organ where tumor metastasis occurs. The number of cells injected into the blood vessel can be optimized to observe a limited number of metastases. It has been reported that stromal cells in the distant organ contribute to metastasis. Thus, this assay could be a useful tool to explore potential therapeutic drugs or devices for prevention of tumor metastasis.

This manuscript describes a method to quantify tumor cell accumulation in the lungs in an animal model of tumor metastasis.

폐 종양 세포 모집 분석 결과

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

연구

암 연구학

Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

실험 전이 분석

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

의학

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under the influence of specific environmental signals, these adult stem cells can release paracrine mediators leading to accelerated tumor growth and metastasis. Defining the crosstalk between tumor and MSCs is of primary importance to understand the mechanisms underlying cancer progression and identify novel targets for therapeutic intervention. 
Cancer cells produce high amounts of extracellular vesicles (EVs), which can profoundly affect the behavior of target cells in the tumor microenvironment or at distant sites. Tumor EVs enclose functional biomolecules, including inflammatory RNAs and (onco)proteins, that can educate stromal cells to enhance the metastatic behavior of cancer cells or to participate in the pre-metastatic niche formation. In this article, we describe the development of a preclinical cancer mouse model that enables specific evaluation of the EV-mediated crosstalk between tumor and mesenchymal stem cells. First, we describe the purification and characterization of tumor-secreted EVs and the assessment of the EV internalization by MSCs. We then make use of a multiplex bead-based immunoassay to evaluate the alteration of the MSC cytokine expression profile induced by cancer EVs. Finally, we illustrate the generation of a bioluminescent orthotopic xenograft mouse model of osteosarcoma that recapitulates the tumor-MSC interaction, and show the contribution of EV-educated MSCs to tumor growth and metastasis formation. 
Our model provides the opportunity to define how cancer EVs shape a tumor-supporting environment, and to evaluate whether blockade of the EV-mediated communication between tumor and MSCs prevents cancer progression.

Direct injection of cancer-derived extracellular vesicles (EVs) leads to reprogramming of bone marrow supporting tumor progression; however, which cells mediate this effect is unclear. Herein, we describe a step-by-step protocol to investigate EV-mediated tumor-mesenchymal stem cell (MSC) interactions in vivo, revealing a crucial role for EV-educated MSCs in metastasis.

종양 및 중간 엽 줄기 세포 사이의 세포 외 기 중재 통신을 정의 하는 다리의 전 임상 마우스 모델

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.
While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research1, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials2. Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR5, FACS6 or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme &beta;-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye7 and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis8 in studies assessing new anticancer therapies9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.12 who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect "dormant" lung micrometastases in a mouse model13, which was originally described to be non-metastatic14.

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

The novel protocol reported in the present study allows selective detection of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ lung perfusion and fixation and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells.

복합에 의한 마우스의 싱글 셀 해상도에서 폐 Metastases의 향상된 시각화<em&gt;에서 시츄</em폐 조직 및 X-걸의 착색의&gt; 재관류<em&gt; lacZ</em&gt; 태그 종양 세포

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Models of Bone Metastasis

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible for significant morbidity and mortality1. Thus, there is a significant need to understand the molecular mechanisms controlling the establishment, growth and activity of tumors in bone. Several in vivo models have been established to study these events and each has specific benefits and limitations. The most commonly used model utilizes intracardiac inoculation of tumor cells directly into the arterial blood supply of athymic (nude) BalbC mice. This procedure can be applied to many different tumor types (including PC-3 prostate cancer, lung carcinoma, and mouse mammary fat pad tumors); however, in this manuscript we will focus on the breast cancer model, MDA-MB-231. In this model we utilize a highly bone-selective clone, originally derived in Dr. Mundy's group in San Antonio2, that has since been transfected for GFP expression and re-cloned by our group3. This clone is a bone metastatic variant with a high rate of osteotropism and very little metastasis to lung, liver, or adrenal glands. While intracardiac injections are most commonly used for studies of bone metastasis2, in certain instances intratibial4 or mammary fat pad injections are more appropriate. Intracardiac injections are typically performed when using human tumor cells with the goal of monitoring later stages of metastasis, specifically the ability of cancer cells to arrest in bone, survive, proliferate, and establish tumors that develop into cancer-induced bone disease. Intratibial injections are performed if focusing on the relationship of cancer cells and bone after a tumor has metastasized to bone, which correlates roughly to established metastatic bone disease. Neither of these models recapitulates early steps in the metastatic process prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. If monitoring primary tumor growth or metastasis from the primary site to bone, then mammary fat pad inoculations are usually preferred; however, very few tumor cell lines will consistently metastasize to bone from the primary site, with 4T1 bone-preferential clones, a mouse mammary carcinoma, being the exception 5,6.
This manuscript details inoculation procedures and highlights key steps in post inoculation analyses. Specifically, it includes cell culture, tumor cell inoculation procedures for intracardiac and intratibial inoculations, as well as brief information regarding weekly monitoring by x-ray, fluorescence and histomorphometric analyses.

Animal models are frequently utilized to study cancer metastasis to bone. In this protocol we will describe two common methods of tumor inoculation for bone metastasis studies and briefly describe some of the analyses utilized to monitor and quantify these models.

뼈 전이의 모델

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification and testing of novel therapeutic targets that will facilitate the development of better treatments for metastatic disease requires preclinical in vivo models. Demonstrated here is a syngeneic mouse model for assaying breast cancer metastatic colonization and subsequent growth. Metastatic cancer cells are stably transduced with viral vectors encoding firefly luciferase and ZsGreen proteins. Candidate genes are then stably manipulated in luciferase/ZsGreen-expressing cancer cells and then the cells are injected into mice via the lateral tail vein to assay metastatic colonization and growth. An in vivo imaging device is then used to measure the bioluminescence or fluorescence of the tumor cells in the living animals to quantify changes in metastatic burden over time. The expression of the fluorescent protein allows the number and size of metastases in the lungs to be quantified at the end of the experiment without the need for sectioning or histological staining. This approach offers a relatively quick and easy way to test the role of candidate genes in metastatic colonization and growth, and provides a great deal more information than traditional tail vein metastasis assays. Using this approach, we show that simultaneous knockdown of Yes associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with a PDZ-binding motif (TAZ) in breast cancer cells leads to reduced metastatic burden in the lungs and that this reduced burden is the result of significantly impaired metastatic colonization and reduced growth of metastases.

The described approach combines experimental tail vein metastasis assays with in vivo live animal imaging to allow real-time monitoring of breast cancer metastasis formation and growth in addition to the quantification of metastasis number and size in the lungs.

꼬리 정맥 전이 검사의 결합된 사용 및 생체 내 실시간 생체 내 이미징을 결합하여 폐암 전이성 식민지화 및 폐의 부담을 정량화

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

종양 세포의 측면 꼬리 정맥 주입 다음 폐 전이의 병리학 적 분석

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These lesions compromise bone structure, increase the risk of pathologic fracture, and leave patients with limited treatment options. Primary bone tumors metastasize to distant organs, with some types capable of spreading to other skeletal sites. However, recent evidence suggests that with many solid tumors, cancer cells that have spread to bone may be the primary source of cells that ultimately metastasize to other organ systems. Most syngeneic or xenograft mouse models of primary bone tumors involve intra-osseous (orthotopic) injection of tumor cell suspensions. Some animal models of skeletal metastasis from solid tumors also depend on direct bone injection, while others attempt to recapitulate additional steps of the bone metastatic cascade by injecting cells intravascularly or into the organ of the primary tumor. However, none of these models develop bone metastasis reliably or with an incidence of 100%. In addition, direct intra-osseous injection of tumor cells has been shown to be associated with potential tumor embolization of the lung. These embolic tumor cells engraft but do not recapitulate the metastatic cascade. We reported a mouse model of osteosarcoma in which fresh or cryopreserved tumor fragments (consisting of tumor cells plus stroma) are implanted directly into the proximal tibia using a minimally invasive surgical technique. These animals developed reproducible engraftment, growth, and, over time, osteolysis and lung metastasis. This technique has the versatility to be used to model solid tumor bone metastasis and can readily employ grafts consisting of one or multiple cell types, genetically-modified cells, patient-derived xenografts, and/or labeled cells that can be tracked by optical or advanced imaging. Here, we demonstrate this technique, modeling primary bone tumors and bone metastasis using solid tumor graft implantation into bone.

Bone metastasis models do not develop metastasis uniformly or with a 100% incidence. Direct intra-osseous tumor cell injection can result in embolization of the lung. We present our technique modeling primary bone tumors and bone metastasis using solid tumor graft implantation into bone, leading to reproducible engraftment and growth.

원발성 뼈 종양 및 뼈에 이식된 고형 종양을 통한 뼈 전이 모델링

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

A Syngeneic Orthotopic Osteosarcoma Sprague Dawley Rat Model with Amputation to Control Metastasis Rate

The most recent advance in the treatment of osteosarcoma (OS) occurred in the 1980s when multi-agent chemotherapy was shown to improve overall survival compared to surgery alone. To address this problem, the aim of the study is to refine a lesser-known model of OS in rats with a comprehensive histologic, imaging, biologic, implantation, and amputation surgical approach that prolongs survival. We used an immunocompetent, outbred Sprague-Dawley (SD), syngeneic rat model with implanted UMR106 OS cell line (originating from a SD rat) with orthotopic tibial tumor implants into 3-week-old male and female rats to model pediatric OS. We found that rats develop reproducible primary and metastatic pulmonary tumors, and that limb amputations at 3 weeks post implantation significantly reduce the incidence of pulmonary metastasis and prevent unexpected deaths. Histologically, the primary and metastatic OSs in rats were very similar to human OS. Using immunohistochemistry methods, the study shows that rat OS are infiltrated with macrophages and T cells. A protein expression survey of OS cells reveals that these tumors express ErbB family kinases. Since these kinases are also highly expressed in most human OSs, this rat model could be used to test ErbB pathway inhibitors for therapy.

Here, a syngeneic orthotopic implantation followed by an amputation procedure of the osteosarcoma with spontaneous pulmonary metastasis that can be used for preclinical investigation of metastasis biology and development of novel therapeutics is described.

전이율을 제어하는 절단을 가진 신제닉 직소 성 골육종 스프라그 Dawley 쥐 모델

The most recent advance in the treatment of osteosarcoma (OS) occurred in the 1980s when multi-agent chemotherapy was shown to improve overall survival ...

Intratibial Osteosarcoma Cell Injection to Generate Orthotopic Osteosarcoma and Lung Metastasis Mouse Models

Osteosarcoma is the most common primary bone cancer in children and adolescents, with lungs as the most common metastatic site. The five-year survival rate of osteosarcoma patients with pulmonary metastasis is less than 30%.Therefore, the utilization of mouse models mimicking the osteosarcoma development in humans is of great significance for understanding the fundamental mechanism of osteosarcoma carcinogenesis and pulmonary metastasis to develop novel therapeutics. Here, detailed procedures are reported to generate the primary osteosarcoma and pulmonary metastasis mouse models via&#160;intratibia injection of osteosarcoma cells. Combined with the bioluminescence or X-ray live imaging system, these living mouse models are utilized to monitor and quantify osteosarcoma growth and metastasis. To establish this model, a basement membrane matrix containing osteosarcoma cells was loaded in a micro-volume syringe and injected into one tibia of each athymic mouse after being anesthetized. The mice were sacrificed when the primary osteosarcoma reached the size limitation in the IACUC-approved protocol. The legs bearing osteosarcoma and the lungs with metastasis lesions were separated. These models are characterized by a short incubation period, rapid growth, severe lesions, and sensitivity in monitoring the development of primary and pulmonary metastatic lesions. Therefore, these are ideal models for exploring the functions and mechanisms of specific factors in osteosarcoma carcinogenesis and pulmonary metastasis, the tumor microenvironment, and evaluating the therapeutic efficacy in vivo.

The present protocol describes intratibia osteosarcoma cell injection to generate mouse models bearing orthotopic osteosarcoma and pulmonary metastasis lesions.

경골 내 골육종 세포 주사 동위원소 골육종 및 폐 전이 마우스 모델 생성

Osteosarcoma is the most common primary bone cancer in children and adolescents, with lungs as the most common metastatic site. The five-year survival ...