이 작품은 HL094536 (BJH)에 의해 지원되었다.

1. 마우스 심장에서 미토콘드리아의 절연 <ol><li> 마음이 미토콘드리아 분리하려면, 마취 및 지역 기관 동물 케어 및 사용위원회의 승인을 절차에 따라 쥐를 희생. </li></ol> 참고 : 미토콘드리아 격리 프로토콜의 모든 단계가 얼음에서 수행해야합니다. 얼음 차가운 버퍼 및 사전 차가운 페트리 요리, 팔콘 튜브 및 Eppendorf 튜브를 사용하십시오. 프로토콜에 주어진 볼륨은 2 마우스 하트가 포함 된 샘플위한 것입니다. <ol start="2"><li> , 마음을 제거 차가운 미토콘드리아 절연 버퍼에 배치 (300 밀리미터 자당, 10 MM 그렇단-HEPES, 200 μM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.4)과 피를 씻어 내 버리지. </li></ol> 참고 : 최적의 결과를 얻으려면 mitochondrial 버퍼의 pH가 코와 아세트산의 산성으로 조정해야합니다. <ol start="3"><li> 감기에 페트리 접시에 장소의 마음은 지방과 심방을 제거하고 얻을 때까지 블레이드를 사용하여 잘게 잘게 썬 고기균일 한 제품을 들죠. </li><li> 50 ML 팔콘 튜브에 다진 마음을 전송, 0.1 MG / ML 트립신과 미토콘드리아 절연 버퍼의 10 ML를 추가하고 샘플이 10 분 동안 얼음에 소화 할 수 있습니다. </li></ol> 참고 : 격리 절차를 수행하는 동안 트립신은 고립 된 미토콘드리아의 수율을 증가하고 mitochondrial 준비 사이에 일정한 보관해야합니다. 우리는 고립 준비에 mitochondrial 기능을 테스트하는 효소가 기능을 방해하지 않도록하는 트립신의 부재하시기 바랍니다. <ol start="5"><li> 0.1 % 지방산 무료 BSA와 5 MG 트립신 억제제 (콩)와 미토콘드리아 절연 버퍼의 10 ML을 추가하고 트립신을 중화하기 위해 반전 튜브를 여러 번에 섞는다. </li></ol> 참고 : 미토콘드리아 절연 버퍼는 사전에 준비 할 수 있으며, -20 ° C.에 저장할 수 있습니다 해동시 산도를 확인합니다. 트립신, 트립신 억제제 또는 BSA는해야합니다실험 당일 미토콘드리아 절연 버퍼에 dded. <ol start="6"><li> 4에 1 분 ° C.에 대한 낮은 - 투 - 중간 속도 원심 분리하여 소화 조직을 복구 </li><li> 테플론 유봉 (1,200-14,00 RPM에서 4-6 패스)와 동력 다운스 호 모지 나이저를 사용 0.1 % 지방산 무료 BSA와 균질화 8 ML 미토콘드리아 절연 버퍼에 Resuspend 조직. homogenizing 동안 얼음에 샘플을 보관. </li><li> 4에 10 분 동안 800xg에서 15 ML 팔콘 튜브와 원심 분리기에 homogenate 전송 ° C 펠릿의 핵 및 조직 파편 있습니다. </li><li> 4에, 15 분에 8,000 XG에서 Eppendorf 튜브와 원심 분리기에 미토콘드리아를 포함하는 표면에 뜨는 복구 ° C. </li><li> 조심스럽게 상단 흰색 레이어를 제거하고 1 ML 미토콘드리아 절연 버퍼에있는 미토콘드리아를 포함하는 나머지 어두운 펠릿을 씻는다. </li><li> 4에 15 분에 8000xg에서 원심 분리기 ° C. 150 μl Mitochondrial 솔라에 표면에 뜨는 및 resuspend 미토콘드리아 펠릿을 삭제 하시겠습니까기 버퍼. 자세한 assays에 얼음 미토콘드리아하세요. </li></ol> 참고 : 기능 assays 동안 최상의 결과를 얻으려면, 고립의 4 시간 이내에 미토콘드리아를 사용합니다. <ol start="12"><li> 브래드 포드 분석을 사용하여 mitochondrial 단백질을 정량화. </li></ol> 2. 절연 미토콘드리아의 품질 관리 2.1. 호흡 제어 비율의 측정 (RCR) <ol><li> 최대 산소 라인을 구축 공기 포화 물 Oxytherm 산소 전극을 보정합니다. 산소의 안정적인 수준은 제로 산소 라인을 구축 할 수있는 신선하게 조리 된 10 MM 나트륨 hydrosulfite 솔루션 100 μl를 추가 취득하는 경우. 30 ° C.에서 측정을 수행 </li><li> 챔버를 막고, Oxytherm 챔버 1 μM의 rotenone 2 개 ML 미토콘드리아 호흡 버퍼를 (125 MM KCl, 20 MM HEPES, 3 MM MgCl 2, 400 μM EGTA, 300 μM의 DTT, 5 MM KH 2 PO 4, 산도 7.2)를 추가 그리고 시작 recor땡. </li><li> 산소 신호가 안정되면, 1 분에 250 미토콘드리아 μg 및 기록 기저 호흡을 추가 할 수 있습니다. 미토콘드리아는 내생 기판 (상태 1 호흡)에 respiring하기 때문에이 시점에서 호흡은 매우 낮은해야합니다. </li><li> 5 MM 호박산 1 분에 대한 기록 신호를 추가 할 수 있습니다. 산소 소비량은 상태 2 호흡하는 동안 증가합니다. </li><li> 150 μM의 ADP을 추가하여 주 3 호흡을 유도. 이 시점 산소 소비량에서 산화 인산화를 통해 ATP 합성에 의해 증가한다. 기록 신호 호흡은 ADP 소비, 4 호흡을 상태로 전환을 나타내는, 속도가 느려집니다 때까지. 최소한 1 분에 대한 기록 주 4 호흡. </li><li> 1 μM의 CCCP와 1 분에 대한 기록 신호를 추가 할 수 있습니다. Uncoupled 호흡이 최대해야합니다. </li></ol> 참고 : mitochondrial 호흡에 CCCP의 효과는 복용량 따라 달라집니다 : CCCP의 높은 농도는 산소 소비량을 억제 할 수 있으므로주의 깊게 t해야합니다itrated. <ol start="7"><li> 주 4 호흡시 산소 소비 속도에 의해 주 3 호흡하는 동안 산소 소비 속도를 나누어 호흡 제어 비율 (RCR)를 계산합니다. 대상 RCR은 ≥ 4 여야합니다. </li></ol> 2.2. mitochondrial 멤브레인 무결성의 평가 (시토크롬 C 테스트) <ol><li> 철저하게 70 % 에탄올과 물 Oxytherm 챔버을 씻고 단계 2.1.2 -2.1.4를 반복합니다. </li><li> 1 ㎜의 ADP와 1 분에 대한 기록 산소 소비를 추가합니다. </li><li> 10 μM 시토크롬 C를 추가 할 수 있습니다. 시토크롬 C는 그대로 mitochondrial 멤브레인에 불 투과성이기 때문에, 호흡의 증가가 고장 또는 손상 mitochondrial 멤브레인을 나타냅니다. </li></ol> 3. Mitochondrial 투과율 전환 기공 영업 측정 <ol><li> mtPTP 개구의 다중 매개 변수 측정을 위해 spectrofluorometer을 설정하십시오. FelixGx 프로그램 사용, 새로운 하드웨어 구성을 생성 (콴타 마스터 꾸준한 역테)은 광원, 여기 단색화, 샘플 구획과 여기 단색화 장치 (그림 4)에 대하여 90 ° 270 °에 위치이 감지기를 포함한다. 최대 시간 해상도를 달성하기 위해 두 방출 monochromators는 (90 ° 270 °) 사용 및 샘플 격실에서 90 ° 270 °에서 방출 필터는 하드웨어 구성 메뉴에서 사용하도록 설정해야합니다. 이 단계는 방출 파장의 모터 제어를 제거하고 특정 파장에서 각각의 단색화가 해결됩니다. 방출 monochromators이 비활성화되지 않은 경우, 각 감지기는 파장과 중복 측정을 모두 사이 사이클이 기록 될 것입니다 것입니다. </li><li> 멀티 염료 유형을 사용하여 새로운 수집 프로토콜을 작성하고 다음과 같은 염료를 입력 : <ul><li> Fura (높은 칼슘 + +) : 여기 340 나노 미터, 방사 525 nm의 (검출기 1) </li><li> Fura (낮은 칼슘 + +) : 여기 380 나노 미터, 방사 525 nm의 (검출기 1) </li><li> JC1 (종합) : 여기 543 nm의, 방출 595 nm의 (검출기 2) </li><li> JC1 (단량체) : 여기 498 나노 미터, 방사 525 nm의 (검출기 1) </li><li> 부기 : 여기 525 나노 미터, 방사 525 nm의 (검출기 1) </li></ul></li><li> 37 ° C.에 1 나노 미터에 여기와 방출 슬릿과 온도를 설정 </li><li> Fura 및 JC-1에 대한 ratiometric 신호를 얻으려면 두 개의 파생 된 흔적을 생성합니다 : Fura (높은 칼슘 + +) / Fura (저 칼슘 + +)와 JC1 (종합) / JC1 (단량체). </li><li> 수동으로 각각 탐지기 1 2-525 나노 미터와 595 nm의 방출 파장을 조정할 수 있습니다. </li><li> 혼합 한 μM의 rotenone, 5 MM 호박산과 일회용 4면의 800 nm의 Fura FF 1 ML 미토콘드리아 분석 버퍼 (120 MM KCl, 10 MM NaCl, 1 ㎜ KH 2 PO 4, 20 MM HEPES - 트리스, 산도 7.2) 메타 크릴 레이트 큐벳. 샘플 칸에 250 μg 미토콘드리아와 장소 샘플을 추가합니다. 자기 교반기가 켜져 있는지 확인하십시오. </li><li> 녹화를 시작합니다. 1 분 후에 인수를 일시 중지, 500 nm의 JC-1을 추가 한 다음를 다시 시작cquisition. JC-1 비율 신호가 활성화 미토콘드리아의 염료 이해를 나타내는 증가한다. JC-1 신호가 대지를 (보통 5 분 이내)에 도달 할 때까지 녹음을 계속합니다. </li><li> 20 μM CaCl 2를 추가합니다. Fura FF 비율 신호의 순간 증가 mitochondrial 칼슘 2 + 통풍 관으로 인해 점차 감소에 이어 검정 버퍼의 증가 칼슘 2 + 존재에 의해 관찰해야합니다. JC-1 비율 신호는 약간의 mitochondrial 막 탈분극을 나타내는 간단한 과도 감소 전시한다. </li><li> 전에 다른 CaCl 2 펄스 (1-1.5 분)의 추가로 기초 수준에 Fura FF 비율 신호가 반환 될 때까지 기다리십시오. 미토콘드리아는 칼슘이 축적 수 없을 때까지 고정 간격으로 pulsing 계속 + 및 + 검정 버퍼에 칼슘이를 공개 시작합니다. mtPTP 운영 인해 칼슘 2 Fura FF 비율 신호의 동시 증가 시각화입니다 + 릴리스 막 pote로 인해 JC-1 신호 비율의 감소ntial 붕괴, 그리고 mitochondrial 붓기로 인해 빛의 분산이 감소 (그림 5). </li><li> mtPTP 활성화 후, 1 MM EGTA, 1 μM C​​CCP, 5 μg / ML의 alamethicin로 각각 Fura FF, JC-1과 붓기 신호의 특이성을 확인합니다. </li><li> mtPTP 개구의 특이성을 확인하려면 단계 3.6 반복 - cyclophilin D ​​억제제 시클로 스포린 1 μm의 면전에서 3.9 A (cyclophilin D는 mtPTP의 구성 요소입니다.) 시클로 스포린의 존재에는 mtPTP의 개방은 컨트롤 샘플 (그림 6)보다 훨씬 CaCl 2 펄스를 필요로합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 그림 2는 미토콘드리아 절연 마우스의 심장의 전형적인 호흡기 컨트롤을 보여줍니다. 주 3 호흡은 신산의 미토콘드리아 respiring에 ADP의 추가에 의해 달성되며, substra에 대해 크게 증가 산소 소비에 의해 특징입니다혼자 테. 의 고갈은 산소 소비가 느려지고 ADP의 추가 이전에 달성 속도 비교입니다 동안 ADP 시작 주 4 호흡을 추가했다. RCR은 주 4 호흡의로 주 3 호흡을위한 산소 소비 속도를 나누어 얻어진다. 시토크롬 C 시험은 검정 외부 mitochondrial 멤브레인의 무결성을하는 데 사용됩니다 시토크롬 C는 호박산과 ADP, 관찰 호흡에 더 이상의 증가에 미토콘드리아 respiring에 추가 될 때, 그대로 외부 mitochondrial 세포막을 (그림 3) 나타냅니다. 미토콘드리아 절연 중심부에 mtPTP 개방에 대한 대표 이미지가 그림 4에 표시됩니다. 이 경우 mtPTP 개방은 1.5 분 간격으로 4 CaCl 2 펄스 (20 μM 각)의 추가에 의해 실행되었다. mtPTP 운영은 mitochondrial 칼슘 2의 근처에 동시 릴리즈 + (Fura FF 비율 신호 증가), mitochond의 붕괴에 의해 명백리알 막전위 (JC-1 비율로 신호의 감소)과 증가 mitochondrial 볼륨 (붓기 신호의 감소). 가 추가되면 시클로 스포린, 이는 mtPTP의 cyclophilin D 구성 요소에 바인딩 mtPTP 운영은 CaCl 2 대신 4 7 펄스 (그림 5)가 필요합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig1.jpg" /> 그림 1. 미토콘드리아 절연 심장에 대한 여러 매개 변수 mitochondrial 투과 전환 구멍을 여는 프로토콜의 흐름 차트입니다. 마음은 마우스에서 채취되며, 미토콘드리아는 차동 원심 분리를 통해 분리되어 있습니다. mitochondrial 준비는 이후 질적 시토크롬 C의 존재에 호흡 제어 비율과 mitochondrial 막 intactness의 polarographic 측정에 의해 평가된다. 절연 미토콘드리아에서 Mitochondrial 투과 전환 기공 개방 연속 CAC에 의해 실행된다리터 2 추가하며 미토콘드리아, 막 잠재적 인 붕괴에서 칼슘 2 + 릴리스를 모니터링하고 mitochondrial 매트릭스의 팽창에 의해 spectrofluorometer로 측정됩니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig2.jpg" /> 그림 2. 측정 미토콘드리아 절연 심장 호흡기 제어 비율 (RCR). 미토콘드리아 절연 심장의 산소 소비량은 호박산과 ADP의 존재에 주 3 호흡하는 동안 측정, 그리고 ADP 소비 후 주 4 호흡시.입니다 uncouplers에 고립 미토콘드리아의 응답은 CCCP의 추가에 의해 측정됩니다. 그래프의 숫자가 nmol / 분 / MG 단백질 격리 된 미토콘드리아에 의한 산소 소비 속도입니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig3.jpg" /> 그림 3. 측정<html> 미토콘드리아 절연 심장 막 무결성 ment. Mitochondrial 막 무결성이 호박산과 ADP의 존재와 시토크롬 C를 추가 한 후 격리 미토콘드리아에 산소 소비를 측정하여 결정됩니다. 그래프의 숫자가 nmol / 분 / MG 단백질 격리 된 미토콘드리아에 의한 산소 소비 속도입니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig4.jpg" /> mtPTP 개구의 다중 매개 변수 측정을위한 그림 4. Spectrofluorometer 하드웨어 구성. spectrofluorometer의 하드웨어 구성은 광원, 여기 단색화, 샘플 구획​​과 525 nm의와 595 nm의에서 고정 방출 파장을 가진 두 검출기가 포함되어 있습니다. 감지기 1 Fura FF 높은과 낮은 칼슘 2 +, JC-1 모노머의 신호 감지 및 붓기 신호에 사용됩니다. 감지기 2 JC-1 통합 신호를 측정합니다. jove_content &quot;강한 : 유지 - together.within 페이지 =&quot;항상 &quot;&gt; <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig5.jpg" /> 그림 5. 미토콘드리아 절연 중심부에 mtPTP 개구의 다중 매개 변수 측정. mtPTP 오픈 20 μM CaCl 2의 연속 추가에 의해 실행되었으며, 칼슘이 특징으로 한 + 미토콘드리아, mitochondrial 막 잠재적 인 붕괴의 자료와 mitochondrial 매트릭스 볼륨 (붓기)을 증가했다. Extramitochondrial 칼슘 2 +와 막 잠재력이 ratiometric 지표 Fura FF (녹색 성분)과 JC-1 (빨간색 추적)로 측정 하였다. 미토콘드리아의 팽창은 525 nm의 (검은 색 추적)에서 빛이 분산을 기록에 의해 측정되었다. JC-1의 특이성과 붓기 신호는 1 μM의 CCCP, 5 μg / ML alamethicin (미생물 독소)에서 테스트되었습니다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig6.jpg" /> 그림 6. 멀티시클로 스포린 A.의 시클로 스포린의 존재의 미토콘드리아 절연 중심부에 mtPTP 개구의 - 매개 변수 측정 (1 μM) 미토콘드리아 절연 중심부에 mtPTP를 여는 데 필요한 CaCl 2 펄스의 수를 증가시킵니다.

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A., Hoffman, D. L., de Mesy Bentley, K. L., Molkentin, J. D., Sheu, S. S., Porter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+permeability+transition+pore+controls+cardiac+mitochondrial+maturation+and+myocyte.">The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte.</a> 21, 469-478 (2011).</li><li>Halestrap, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">What is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46, 821-831 (2009).</li><li>Wei, A. C., Liu, T., Cortassa, S., Winslow, R. 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The demonstration of functional coupling to oxidative phosphorylation in an inner membrane-matrix preparation.</a> J. Biol. Chem. 260, 7757-7764 (1985).</li><li>Boehm, E. A., Jones, B. E., Radda, G. K., Veech, R. L., Clarke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+uncoupling+proteins+and+decreased+efficiency+in+palmitate-perfused+hyperthyroid+rat+heart.">Increased uncoupling proteins and decreased efficiency in palmitate-perfused hyperthyroid rat heart.</a> AJP - Heart. 280, 977-983 (2001).</li><li>Fontaine, E., Eriksson, O., Ichas, F., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Permeability+Transition+Pore+in+Skeletal+Muscle+Mitochondria.">Regulation of the Permeability Transition Pore in Skeletal Muscle Mitochondria.</a> J. Biol. 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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

여기에 제시된 프로토콜 미토콘드리아 격리 된 마음 (그림 1과 그림 4)에 투과 전환 기공 오픈을 평가하는 데 필요한 실험 단계를 설명 마우스 마음이 미토콘드리아 분리를위한 절차를, 그들의 무결성과 기능을 보장 호흡기 컨트롤은 mitochondrial 매개 변수는 동안 모니터 mtPTP 영업 및 측정을 위해 사용 된 염료, spectrofluorometric 장비의 설정까지, 그리고 mtPTP 개구의 특성. 이 프로토콜에서...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 트립신 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> T3030 </td></tr><tr><td> 트립신 억제제 (콩) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> T9128 </td></tr><tr><td> 나트륨 hydrosulfite </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 71,699 </td></tr><tr><td> Rotenone </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> R8875 </td></tr><tr><td> 시토크롬 C </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> C7752 </td></tr><tr><td> Alamethicin </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> A4665 </td></tr><tr><td> CCCP </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> C2759 </td></tr><tr><td> 시클로 스포린 </td><td> Calbiochem </td><td> 239835 </td></tr><tr><td> Fura FF </td><td> Invitrogen </td><td> F14180 </td></tr><tr> &lt;TD&gt; JC-1 </td><td> Invitrogen </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> 조직 분쇄기 테플론 유봉 15 ML과 포터 - Elvehjem </td><td> 휘튼 산업 </td><td></td></tr><tr><td> 오버 헤드 교반기 </td><td> 휘튼 산업 </td><td> 903475 </td></tr><tr><td> Oxytherm (온도 조절 산소 전극) </td><td> Hansatech 악기 </td><td></td></tr><tr><td> QuantaMaster 80 듀얼 방출 spectrofluorometer </td><td> 광자 기술 인터내셔널 </td><td></td></tr></tbody></table>

multi-parameter measurement of the permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria

mitochondrial 투과 전환 기공 (mtPTP)는 1.5 kDa보다 작은 분자 질량과 용질을 운송 할 수있는 내부 mitochondrial 막에 형성되지 않은 특정 채널입니다. 기공의 결정적인 분자 ID가 토론에서 아​​직 시간이 남아 있기는하지만, 그러한 cyclophilin D, VDAC 및 ANT와 같은 단백질이 형성 mtPTP에 기여하고 있습니다. 세포 죽음의 mtPTP 개방의 참여 잘 하나를 설립하는 동안 증거를 축적하면 mtPTP는 mitochondrial 칼슘 2 + 항상성 2, bioenergetics 및 산화 환원 3 신호를하는 동안 physiologic 역할을 제공했음을 나타냅니다. mtPTP 영업은 매트릭스 카 2로 실행됩니다 +하지만, 그 활동에는 산화 스트레스, 아데닌 뉴클레오티드 고갈, 파이의 높은 농도, mitochondrial 막 탈분극 또는 uncoupling, 4 장쇄 지방산과 같은 여러 가지 다른 요인에 의해 조절 될 수 있습니다. 체외, mtPTP에서 개방 ACH 할 수 있습니다칼슘 2 +의 외인성 추가 (칼슘 유지 용량)를 통해 mitochondrial 매트릭스 내부에 칼슘 2 + 농도를 증가시켜 재 현 할 수없는 뛰 어. 카 2 미토콘드리아 내부 + 수준의 특정 임계 값에 도달하면, mtPTP가 열리고 카 2 용이 + 릴리스 양자의 동기 힘의 손실, 막 잠재적 인 붕괴와 궁극적으로의 파열로 연결 mitochondrial 매트릭스 볼륨 (붓기)의 증가 외부 mitochondrial 막과 세포 기관 기능의 돌이킬 수없는 손실. 여기 미토콘드리아 절연 마우스 중심부에 mtPTP 개구의 포괄적 인 특성을 허용 fluorometric 분석을 설명합니다. mitochondrial 칼슘 2 + 취급합니다 (칼슘 2로 분석 매체에서 + 농도를 측정 이해와 릴리스), mitochondrial 막 잠재력, 그리고 mitocho : 검정은 mtPTP을 여는가 발생했을 때 변경 아르 세 mitochondrial 매개 변수의 동시 측정을 포함ndrial 볼륨입니다. 카 2 고용 염료는 검정 매체와 mitochondrial 막 잠재력에 + 측정 Fura FF, 막 impermeant, CA 2 +, 그리고 JC-1, 양이온의 존재에 여기 파장의 변화를 겪 ratiometric 표시입니다 각각 낮은 및 높은 막전위에서 녹색 단량체 또는 빨간색 응집체를 형성 ratiometric 표시. mitochondrial 볼륨의 변화는 mitochondrial 정지에 의해 빛이 분산을 기록에 의해 측정됩니다. 높은 품질, 기능 미토콘드리아는 mtPTP 여는 분석에 필요한 때문에, 우리는 그대로 높은 커플 링 기능 절연 심장 미토콘드리아 확보하는 데 필요한 단계를 설명합니다.

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Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

미토콘드리아 절연 마우스 중심부에 mitochondrial 투과 전환 기공 개구의 측정을위한 spectrofluorometric 프로토콜이 여기에 제공됩니다. 검정은 미토콘드리아 칼슘의 동시 측정을 포함<sup&gt; 2 +</sup&gt; 처리, mitochondrial 막 잠재력과 mitochondrial 볼륨입니다. 미토콘드리아 높은 품질과 기능 마음을 얻기위한 절차도 설명되어 있습니다.

미토콘드리아 절연 마우스 중심부에 투과율 전환 기공 영업의 다중 매개 변수 측정

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

multi-parameter-measurement-permeability-transition-pore-opening

Research

JoVE Journal

Biology

21.4K 조회수.  University of Washington, Seattle. 미토콘드리아 절연 마우스 중심부에 mitochondrial 투과 전환 기공 개구의 측정을위한 spectrofluorometric 프로토콜이 여기에 제공됩니다. 검정은 미토콘드리아 칼슘의 동시 측정을 포함 2 + 처리, mitochondrial 막 잠재력과 mitochondrial 볼륨입니다. 미토콘드리아 높은 품질과 기능 마음을 얻기위한 절차도 설명되어 있습니다.

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Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there have been significant advances in our understanding of the functions of mitochondria other than the generation of energy. These include their role in apoptosis, acting as signalling organelles, mammalian development and ageing as well as their contribution to the coordination between cell metabolism and cell proliferation. Our understanding of biological processes modulated by mitochondria is based on robust methods for isolation and handling of intact mitochondria from tissues of the laboratory animals. Mitochondria from rat heart is one of the most common preparations for past and current studies of cellular metabolism including studies on knock-out animals.
Here we describe a detailed rapid method for isolation of intact mitochondria with a high degree of coupling. Such preparation of rat heart mitochondria is an excellent object for functional and structural research on cellular bioenergetics, transport of biomolecules, proteomic studies and analysis of mitochondrial DNA, proteins and lipids.

We describe &#1072; protocol for isolation of pure, highly coupled rat heart mitochondria for functional or structural studies of cellular bioenergetics, biophysical measurements, proteomics or mitochondrial DNA and lipids analysis.

Mitochondria 높은 결합 랫 마음의 준비

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

연구

생물학

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

단일 미토콘드리아 과산화물 온전한 마음에 점멸 또는 공 촛점 이미징<em&gt; 생체</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

고립 된 혈액 관류 쥐 폐 준비에 단일 미세 혈관 투과성의 양을

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

삼투 물 투수 계수 (P 측정<sub&gt; F</sub&gt;) 구형 세포 : 예를 들어 식물 절연 원형질체

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

고립 된 미토콘드리아의 유동 세포 계측법에 의해 외부 막 단백질의 면역

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

약리학 연구에 고립 된 조직 목욕-애플리케이션에서 부드러운 근육 기능의 측정

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아의 분리

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of myocardial metabolism have been linked to the development of contractile dysfunction and heart failure. Therefore, unraveling the link between metabolism and contraction should shed light on some of the mechanisms governing cardiac adaptation or maladaptation in disease states. The isolated working rat heart preparation can be used to follow, simultaneously and in real time, cardiac contractile function and flux of energy providing substrates into oxidative metabolic pathways. The present protocol aims to provide a detailed description of the methods used in the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of the rates of oxidation for glucose and fatty acids, the main energy providing substrates of the heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed. In brief, the technique is based on the supply of 14C- radiolabeled glucose and a 3H- radiolabeled long-chain fatty acid to an ex vivo beating heart via normothermic crystalloid perfusion. 14CO2 and 3H2O, end byproducts of the enzymatic reactions involved in the utilization of these energy providing substrates, are then quantitatively recovered from the coronary effluent. With knowledge of the specific activity of the radiolabeled substrates used, it is then possible to individually quantitate the flux of glucose and fatty acid in the oxidation pathways. Contractile function of the isolated heart can be determined in parallel with the appropriate recording equipment and directly correlated to metabolic flux values. The technique is extremely useful to study the metabolism/contraction relationship in response to various stress conditions such as alterations in pre and after load and ischemia, a drug or a circulating factor, or following the alteration in the expression of a gene product.

The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

격리 된 작업 쥐의 심장에서 포도당과 지방산 산화의 가격의 결정 방법

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

마우스입니다 관류 신장 기법

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found responsible for very diverse diseases, ranging from neurological pathologies to cancer. Interestingly, mitochondria have recently been shown to display the capacity to be transferred between cell types, notably from human mesenchymal stem cells (MSC) to cancer cells in coculture conditions, with metabolic and functional consequences for the mitochondria recipient cells, further enhancing the current interest for the biological properties of these organelles.
Evaluating the effects of the transferred MSC mitochondria in the target cells is of primary importance to understand the biological outcome of such cell-cell interactions. The MitoCeption protocol described here allows the transfer of the mitochondria isolated beforehand from the donor cells to the target cells, using MSC mitochondria and glioblastoma stem cells (GSC) as a model system. This protocol has previously been used to transfer mitochondria, isolated from MSCs, to adherent MDA-MB-231 cancer cells. This mitochondria transfer protocol is adapted here for GSCs that present the specific particularity of growing as neurospheres in vitro. The transfer of the isolated mitochondria can be followed by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and confocal imaging using mitochondria vital dyes. The use of mitochondria donor and target cells with distinct haplotypes (SNPs) also allows detection of the transferred mitochondria based on the concentration of their circular mitochondrial DNA (mtDNA) in the target cells. Once the protocol has been validated with these criteria, the cells harboring the transferred mitochondria can be further analyzed to determine the effects of the exogenous mitochondria on biological properties such as cell metabolism, plasticity, proliferation and response to therapy.

Here, a protocol (MitoCeption) is presented to transfer mitochondria, isolated from human mesenchymal stem cells (MSC), to glioblastoma stem cells (GSC), with the goal of studying their biological effects on GSC metabolism and functions. A similar protocol can be adapted to transfer mitochondria between other cell types.